Test immunofluorescencji CTC: technika charakteryzowania krążących komórek nowotworowych

Streszczenie

Źródło: Garcia, J., et al. Semi-automatic PD-L1 Charakterystyka i liczenie krążących komórek nowotworowych od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc metodą immunofluorescencji.J. Vis. Exp.(2019 rok)

Ten film opisuje test immunofluorescencji krążących komórek nowotworowych (CTC), technikę charakteryzowania biomarkerów na krążących komórkach nowotworowych w próbkach pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuc. Test ten może być stosowany do monitorowania dynamicznych zmian guza i odpowiedzi immunologicznej, która może odzwierciedlać odpowiedź na chemioterapię, radioterapię i możliwe leczenie immunoterapeutyczne.

Protokół

1. Barwienie immunofluorescencyjne

1. Wyliczyć na szkiełku z komorą z siatką typu hemocytometr liczbę komórek na ml. Wzbogaconą próbkę rozcieńczyć 0,2% roztworem zapobiegającym wiązaniu (tabela materiałów) do stężenia osiągającego 100 000 komórek/100 μl na cytospinę.
2. Zwilżyć kontur komory próbki bawełną (tabela materiałów) z 50 μl 0,2% roztworu zapobiegającego wiązaniu. Umieścić szkiełko ze szkła polilizynowego w komorze na próbkę i zamknąć.
3. Pokryj końcówkę 0,2% roztworem zapobiegającym wiązaniu, pipetując w górę i w dół 3 razy. Ponownie zawiesić wzbogaconą próbkę i przenieść roztwór komórkowy do komory na próbkę. Wirówka z dedykowaną wirówką (tabela materiałów) przy 400 obr./min przez 4 min (niskie przyspieszenie).
4. Umieść izolator krzemowy wokół obszaru osadzania. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia pod komorą bezpieczeństwa mikrobiologicznego na 2 minuty.
5. Przygotować roztwór utrwalający, rozcieńczając 1 ml 16% paraformaldehydu (PFA) 3 ml sterylnego PBS. Dodać 100 μl roztworu utrwalającego (4% PFA) na próbkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Usunąć roztwór utrwalający i wykonać trzy przemycia 200 μl PBS i inkubować w temperaturze pokojowej każde przez 2 minuty
   UWAGA: Używaj PFA pod komorą bezpieczeństwa chemicznego, aby zapobiec wdychaniu.
6. Przygotować roztwór nasycający, rozcieńczając płodową surowicę bydlęcą (FBS) w 5%, odczynnik blokujący receptor Fc (FcR) w 5% i albuminę surowicy bydlęcej (BSA) w stężeniu 1% w sterylnym PBS (tabela materiałów). Dodać 100 μl roztworu nasyconego na próbkę i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć roztwór nasycony.
7. Dodać 100 μl roztworu przeciwciała na próbkę (przeciwciało CD45 1/20; Przeciwciało PanCK 1/500; przeciwciało PD-L1 1/200; Qsp roztwór nasycający 100 μL) (Tabela materiałów). Umieścić szkiełko ze szkła polilizynowego na szalce Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm. Zwilżyć chłonny papier 2 ml sterylnej wody i zamknąć szalkę Petriego pokrywką. Umieścić w temperaturze 4 °C na noc i chronić przed światłem.
8. Usunąć mieszaninę przeciwciał i wykonać 3 przemycia z 200 μl PBS, inkubując każde przemycie przez 2 minuty. Pozostaw próbkę do wyschnięcia na 5 minut i chroń ją przed światłem. Umieścić 10 μl roztworu montażowego (tabela materiałów) w miejscu osadzania i przykryć szkiełkiem nakrywkowym mikroskopu, nie tworząc pęcherzyka. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pluroniczny F-68 10%	Gibco (firma Gibco)	24040-032	Rozwiązanie zapobiegające wiązaniu. Warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
EZ Cytolejki	Rybak termiczny	A78710003	Komora na próbki z bawełny. Warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Wirówka Shandon Cytopsin4	Rybak termiczny	A78300003	Dedykowana wirówka. Warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Paraformaldehyd 16%	Rybak termiczny	11490570	Roztwór do utrwalania. Warunki przechowywania: +4°C
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Ultra Pure Grade 1X – 1L	1 Laboratorium Baza	BUF-2040-1X1L	Warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Agent blokujący FcR	Miltenyi Biotec	Numer katalogowy: 130-059-901	Warunki przechowywania: +4°C
Przeciwciało monoklonalne PD-L1 (klon 29E2A3) - fikoerytryna	Legenda biologiczna	BLE329706	Warunki przechowywania: +4°C
Przeciwciało monoklonalne PanCK (klon AE1/AE3) Alexa Fluor 488	Rybak termiczny	53-9003-80	Warunki przechowywania: +4°C
Przeciwciało monoklonalne CD45 (klon HI30) Alexa Fluor 647	Legenda biologiczna	BLE304020	Warunki przechowywania: +4°C
Mocowanie fluorowe	Sigma	Zobacz materiał F4680	Rozwiązanie montażowe. Warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
szalka Petriego	Holender	Numer katalogowy: 632180	Warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Ozyme powiedział:	BE17-512F	Warunki przechowywania: +4°C
Szkiełka polilizynowe	Rybak termiczny	J2800AMNZ	Warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Izolator krzemowy	Grace bio-Labs	Numer katalogowy: 664270	Warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Sterylna woda dejonizowana – 100 ml	1 Laboratorium Baza	CUS-4100-100ml	Warunki przechowywania: Temperatura pokojowa
Surowica cielęca płodu (FCS)	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 10270-106	Warunki przechowywania: +4°C

TGL