Porównawcze badanie in vivo przymiotności adiuwantowej gp96 u żaby Xenopus laevis

Podsumowanie

Żaba Xenopus laevis stanowi atrakcyjną, niemammalijną alternatywę modelu badawczego do analizy zdolności białek szoku termicznego, takich jak gp96, do promowania swoistych dla antygenu odpowiedzi limfocytów T CD8. Przedstawiamy metody badania in vivo wspomagania cross-prezentacji antygenów skóry i nowotworów przez gp96.

Streszczenie

Opracowaliśmy u płazów Xenopus laevis unikalny model niemammalny do badania zdolności niektórych białek szoku cieplnego (hsp), takich jak gp96, do ułatwiania krzyżowej prezentacji antygenów opiekuńczych oraz wywoływania wrodzonych i adaptacyjnych odpowiedzi limfocytów T. Odrzucanie przeszczepów skóry u Xenopus stanowi doskonałą platformę do badania zdolności gp96 do wywoływania klasycznych odpowiedzi limfocytów T ograniczonych przez MHC klasy Ia (klasa Ia). Ponadto model Xenopus stanowi atrakcyjną alternatywę dla myszy w badaniu zdolności gp96 do generowania odpowiedzi przeciwko guzam, które obniżyły ekspresję cząsteczek klasy Ia, unikając w ten sposób nadzoru immunologicznego. Niedawno opracowaliśmy test adoptywnego transferu komórek u klonów Xenopus, wykorzystując leukocyty otrzewnowe jako komórki prezentujące antygen (APC), i wykazaliśmy, że gp96 może indukować odpowiedzi limfocytów T CD8 in vivo przeciwko mniejszym antygenom histokompatybilności skóry, a także przeciwko guzowi grasicy Xenopus 15/0, który nie wykazuje ekspresji cząsteczek klasy Ia. Opisujemy tutaj metodologię niezbędną do przeprowadzenia tych testów, w tym pobieranie, pulsowanie i adoptywny transfer leukocytów otrzewnowych, a także testy przeszczepiania skóry i guzów. Opisujemy również pobieranie i separację leukocytów krwi obwodowej wykorzystywanych w cytometrii przepływowej oraz testach proliferacji, co pozwala na dalszą charakterystykę populacji efektorowych zaangażowanych w odrzucanie skóry i odpowiedzi przeciwnowotworowe.

Protokół

1. Zwierzęta

X. laevis x X. gilli hybrydy, izogeniczne klony LG-6 i LG-15 ¹, pochodzą z naszej kolonii hodowlanej na Uniwersytecie w Rochester (http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm). LG-6 i LG-15 posiadają ten sam heterozygotyczny haplotyp MHC (a/c), lecz różnią się w locusach mniejszej zgodności histologicznej (H). Potomstwo z tych klonów uzyskuje się poprzez ginegenezę, w której diploidalne komórki jajowe produkowane przez samicę są aktywowane przez plemniki naświetlone promieniami UV (bez wkładu DNA w potomstwo).

Stosowanie rękawiczek jest opcjonalne. Niektórzy wolą z nich nie korzystać, ponieważ utrudnia to manipulowanie żabami (są śliskie), a ponadto wydaje się, że powoduje to dyskomfort u zwierząt.

2. Oczyszczanie gp96 z guza 15/0 (wykazującego ekspresję zarówno antygenów nowotworowych, jak i mniejszych antygenów histokompatybilacyjnych H)

Oczyszczanie białka Gp96 zostało opisane wcześniej ^{2, 3}. W skrócie, gp96 jest oczyszczane poprzez frakcjonowanie siarczanem amonu w stężeniu 50-70%, a następnie za pomocą chromatografii na ConA-sepharose oraz DEAE. Z 1 mL tkanki nowotworowej można uzyskać około 20-50 μg białka. Czystość preparatu określa się za pomocą SDS-PAGE i barwienia srebrem.

3. Elicytacja i pobieranie leukocytów otrzewnowych (PLs) od żab LG-6 różniących się antygenami mniejszego histocompatibility (Minor H-Ag)

1. Hodować 25 ml przez noc E. coli hodować w probówce stożkowej o pojemności 50 ml w 37°C z wstrząsaniem.
2. Następnego dnia należy zabić bakterie termicznie, gotując je przez 1 godzinę.
3. Odwiruj próbki zutylizowane termicznie E. coli przez 15 min przy 2000 obr./min (1500 g) w 4°C.
4. Usuń nadsącz i resuspenduj osad bakteryjny w 1/10^th pierwotna objętość hodowli (2,5 ml) w APBS. W tym momencie hodowla bakteryjna jest gotowa do użycia i musi zostać wykorzystana w ciągu 24 godzin.
5. Wstrzyknąć doprzewnowłocznie (i.p.) 200 (dla żaby o długości 2 cali) lub 300 μL (dla żaby o długości 3 cali) preparatu bakteryjnego zabitego termicznie na każdą żabę, używając igły 25 G o długości 5/8 cala.
6. Trzy dni po iniekcji PL są pobierane poprzez płukanie otrzewnej.
7. Przed pobraniem PL dorosłe żaby poddawane są anestezji poprzez zanurzenie w 0,1% wodnym roztworze metanosulfonianu trikainy (TMS, MS-222) buforowanym wodorowęglanem sodu przez maksymalnie 5 min, aż do całkowitego ustania ruchów (czas zależy od wielkości i wieku zwierząt). Zwierzęta budzą się w ciągu 10–20 min po zabiegu.
8. Zdezynfekuj brzuch żaby niewielką ilością 70% etanolu.
9. Wstrzyknij 5 mL (w przypadku żaby o długości 2 cali) lub 10 mL (w przypadku żaby o długości 3 cali) sterylnego roztworu APBS, uprzednio ogrzanego do temperatury pokojowej, do jamy otrzewnej, używając igły 18 G o długości 1 ½ cala. Wyjmij igłę i delikatnie masuj żabę przez minutę, aby zapewnić równowagę między wstrzykniętym buforem a płynem w jamie ciała.
10. Użyj nowej igły o rozmiarze 18 G i długości 1 ½ cala, bez strzykawki, aby zebrać płyn otrzewnowy, który będzie skapywał z tylnej części igły do czystej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Upewnij się, że odzyskano jak największą część początkowej wstrzykniętej objętości. Zachowaj ostrożność, aby uniknąć uszkodzenia naczyń krwionośnych w centralnej części obszaru brzusznego.
11. Po pobraniu PL-ów umieścić żabę w pojemniku z płytką warstwą wody, aż do momentu jej wybudzenia, po czym można ją przenieść z powrotem do klatki.

4. Pulsowanie i transfer adopcyjny komórek Lg-6 Pls do naiwnych biorców Lg-6

1. Przemyj PL raz zimnym APBS i odwiruj przy 1 000 rpm (750 g) przez 10 min w temperaturze 4°C.
2. Usuń supernatant i resuspenduj PL w APBS.
3. Poddaj PL pulsacji gp96 w stężeniu 1 μg gp96 na 5 x 10⁵ PL.
4. Po dodaniu odpowiedniej ilości gp96 do PL wymieszaj je za pomocą pipety i inkubuj na lodzie przez 1 godzinę.
5. Odwiruj komórki przy 1 000 rpm przez 10 min w 4°C lub przy 14 000 rpm przez 1 min, aby usunąć niezwiązane gp96.
6. Przemyj PL 3X zimnym APBS, aby upewnić się, że nie pozostały resztki gp96.
7. Resuspenduj pulsowane PL w stężeniu 5 x 10⁵ PL na 300 μL.
8. Wykonaj adopcyjny transfer PL poprzez wstrzyknięcie dostronne (i.p.) za pomocą igły 25G 5/8. Wstrzyknij 300 μL pulsowanych PL (5 x 10⁵ komórek) na zwierzę.
9. Żaby muszą zostać poddane primingowi co najmniej 3 dni przed kontynuacją eksperymentów z przeszczepem skóry lub wyzwaniem nowotworowym.

5. Analiza przeszczepu skóry

Odrzucenie przeszczepu skóry jest uznanym badaniem w Xenopus ^{4, 5, 6}W Xenopusodbiorca odrzuca skórę dawcy wykazującą 1 lub 2 niezgodności haplotypów MHC w ciągu 18–22 dni w temperaturze 21-22°CW przeciwieństwie do tego, przeszczepy skóry między klonami LG-6 i LG-15, które różnią się jedynie niewielkimi antygenami H (minor H-Ags), są odrzucane wolniej (po ponad 30 dniach). Jednakże odrzucenie to ulega przyspieszeniu u biorców, którzy zostali uprzednio uwrażliwieni na niewielkie antygeny H dawcy, albo poprzez wcześniejszy przeszczep skóry, albo poprzez immunizację oczyszczonym od dawcy białkiem gp96. Brak odrzutu występuje w przypadku, gdy dawca i biorca są identyczni genetycznie (np. zwierzęta klonowane lub w pełni inbredowe). Zatem ta prosta technika jest bardzo skutecznym narzędziem do charakteryzacji in vivo odpowiedzi odpornościowe wywołane przez gp96.

1. Zanurzyć żabę dawcę w anestetyku zgodnie z opisem w punkcie 3.7.
   Uwaga: Należy zachować jedynie minimalne środki ostrożności, ponieważ Xenopus produkuje w skórze silne peptydy przeciwdrobnoustrojowe (np. magaininę), co znosi konieczność stosowania pełnych procedur aseptycznych. W rzeczywistości traktowanie żaby jakimkolwiek środkiem dezynfekującym byłoby szkodliwe dla skóry. Ponadto Xenopus nie przenosi żadnych patogenów zagrażających ludziom. W związku z tym stosowanie rękawiczek jest opcjonalne. Wszystkie narzędzia sekcyjne muszą być jednak poddane autoklawowaniu, a wszystkie roztwory muszą być sterylne.
2. Za pomocą nożyczek wyciąć i usunąć z żaby dawcy LG-15 niewielki fragment skóry brzusznej (skóra brzucha, która ma srebrzysty wygląd ze względu na obecność pigmentowych komórek irydoforów) o wymiarach 20 mm X 5 mm.
3. Umieścić skórę w czarence Petriego zawierającej APBS i przechowywać w lodzie. Tkankę skórną należy manipulować bardzo delikatnie; należy unikać chwytania jej pęsetą.
4. Za pomocą żyletki lub nożyczek pociąć poszczególne przeszczepy na fragmenty o wymiarach 5 mm X 5 mm. Fragmenty przechowywać w APBS w lodzie.
5. W tym momencie żabę dawcę umieszcza się w pojemniku z płytką warstwą wody aż do przebudzenia, a następnie przenosi do wody z antybiotykami (Penstrep w stężeniu 5 mg/L). Żabę utrzymuje się w wodzie z antybiotykami przez dwa dni, po czym przenosi się ją z powrotem do zwykłej wody. Niewielka rana w miejscu usunięcia skóry nie wymaga zszywania i goi się w ciągu tygodnia.
6. Zanurzyć żabę biorcę LG-6 w anestetyku.
7. Wyciąć niewielkie nacięcie w skórze grzbietowej biorcy i wprowadzić przeszczep 5 mm X 5 mm pod skórę srebrzystą stroną do góry. Należy uważać, aby nie wprowadzić pod skórę dużych pęcherzyków powietrza, ponieważ może to doprowadzić do przemieszczenia lub nawet utraty przeszczepu.
8. Należy odnotować oznaczenia nożyczkami i pęsetą na przeszczepach, ponieważ nie są one wliczane jako odrzut przeszczepu po rozpoczęciu oceny.
9. Po 24 godzinach należy usunąć część nadkładającej skóry gospodarza z obszaru przeszczepu.
10. Zanurzyć żabę biorcę LG-6 w anestetyku. Postępować z zwierzęciem zgodnie z opisem w punkcie 5.1.
11. Za pomocą autoklawowanych nożyczek wyciąć „okno” wokół przeszczepu, tak aby przeszczep był swobodnie widoczny. Należy uważać, aby nie dotknąć skóry dawcy i nie wywołać krwawienia. Pozostawić żabę do wybudzenia zgodnie z opisem w punkcie 5.5.
12. Bezzwłocznie rozpocząć ocenę przeszczepu, wykonując szkic. Odrzut przeszczepu skóry określa się na podstawie procentowej destrukcji irydoforów w przeszczepionej skórze.
13. Przeszczepy należy sprawdzać co 2-3 dni; nie jest do tego wymagane znieczulanie zwierząt. W celu wizualizacji przeszczepów żaby należy umieścić w czarence Petriego pod mikroskopem stereoskopowym.

6. Immunohistochemia całego preparatu przeszczepionej skóry

Immunohistochemia całego preparatu żaby została opisana wcześniej ⁶. W skrócie, żabę znieczula się i umieszcza pod mikroskopem na sterylnym ręczniku papierowym uprzednio zwilżonym wodą dla żab (obszar roboczy jest również przygotowany aseptycznie). Następnie pobiera się przeszczepioną skórę wraz z niewielką ilością otaczającej skóry biorcy i barwi ją przeciwciałami w sposób podobny do barwienia komórek do analizy cytometrycznej ⁶. Należy używać autoklawowanych narzędzi i sterylnych buforów. Po barwieniu skórę umieszcza się na szkiełku mikroskopowym i delikatnie dociska szkiełkiem nakrywnym. Na tym etapie można zwizualizować skórę za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego w celu zidentyfikowania różnych populacji komórek, które zinfiltrowały przeszczep. Po zabiegu żabę utrzymuje się w wodzie z antybiotykami, zgodnie z opisem w sekcji 5.5., a następnie przenosi do zwykłej wody. Mała rana powstała w miejscu usunięcia skóry goi się w ciągu tygodnia.

7. Charakterystyka leukocytów krwi

1. Przed pobraniem krwi z żaby należy przygotować „szklane igły”, wyciągając sterylne pipety Pasteura nad płomieniem. Cienki koniec pipety należy zaostrzyć pod stereomikroskopem. Następnie pipetę podłącza się do plastikowej rurki aspiracyjnej.
   Wszystkie instrumenty, takie jak pęsety i nożyczki, muszą zostać poddane autoklawowaniu przed użyciem.
2. Należy również przygotować 10 mL lodowatego APBS oraz roztwór heparyny, dodając 50 jednostek heparyny na 1 mL APBS. Roztwór należy przechowywać w lodzie. Wszystkie używane roztwory muszą być sterylne.
3. Żabę należy znieczulić zgodnie z opisem w punkcie 3.7 i stosować te same procedury postępowania ze zwierzętami, które opisano w punkcie 5.1.
4. Naciąć skórę nad tylną stopą, aby odsłonić grzbietową żyłę tarsalną.
5. Napełnić pipetę Pasteura 1-2 mL roztworem APBS+heparyna.
6. Wprowadzić „szklaną igłę” do żyły i rozpocząć pobieranie krwi, powoli aspirując ją ustami. Ważne jest, aby w „szklanej igle” znajdował się roztwór APBS+heparyna, co zapobiegnie krzepnięciu krwi i zapchaniu się końcówki igły.
7. Z jednej żaby o średniej wielkości można uzyskać od 1 do 2 mL krwi.
8. Małe nacięcie na nodze żaby nie wymaga zaszycia, a rana goi się w ciągu jednego tygodnia.
9. Krew wirować przy 1,000 rpm przez 10 min w temperaturze 4°C.
10. Usunąć supernatant i przemyć komórki raz 10 mL zimnego APBS.
11. Nanieść 2 mL krwi (1-5 x 10⁶ komórek) na 1 mL ficoll Histopaque 1.077 (Sigma), uprzednio ogrzanego do temperatury pokojowej, w celu oddzielenia leukocytów krwi od erytrocytów.
12. Wirować przez 20 min przy 1,000 rpm w temperaturze pokojowej bez hamowania, a następnie zebrać pierścień leukocytów.
13. Komórki przemyć dwa razy APBS poprzez wirowanie przy 1,400 rpm przez 10 min w temperaturze 4°C, aby usunąć pozostałości ficollu.
14. Na tym etapie komórki są gotowe do barwienia przeciwciałami do analizy cytometrycznej lub do wykorzystania w testach hodowli in vitro.

8. Test transplantacji guza

1. Na około tydzień przed eksperymentem rozmrozić nową partię komórek nowotworowych 15/0 i upewnić się, że komórki dobrze rosną. Pożywka hodowlana została krótko opisana w następnej sekcji oraz bardziej szczegółowo w ³.
2. Namnożyć komórki nowotworowe 15/0.
3. W dniu eksperymentu policzyć komórki i określić stopień obumarcia komórek metodą wykluczania błękitu trypanu. Odsetek komórek martwych powinien być mniejszy niż 5%. Przemyć komórki 1X w zimnym APBS i odwirować przy 1,000 rpm w temperaturze 4°C przez 10 min.
4. Resuspendować komórki w pożywce do hodowli nowotworów w zagęszczeniu 5 x 10⁵ komórek 15/0 na 300 μL.
5. Przeszczepić 5 x 10⁵ komórek w objętości 300 μL na żabę poprzez wstrzyknięcie podskórne za pomocą igły 25 G o długości 5/8 po jednej stronie grzbietu zwierzęcia.
6. Wzrost nowotworu rozpocznie się w ciągu 2-3 tygodni po indukcji guza. Należy odnotować moment pojawienia się guza i zapisywać objętość nowotworu co 2-3 dni. Objętość nowotworu (wysokość X długość X szerokość) mierzy się za pomocą suwmiarki.
7. Gdy nowotwór osiągnie objętość 3,500 mm³ lub gdy żaba stanie się letargiczna, należy przeprowadzić eutanazję, aby zapobiec cierpieniu zwierzęcia.

9. Potrzebne odczynniki:

• Fosforanowy bufor solny dla płazów (APBS): 6,6 g/L NaCl, 1,15 g/L Na₂HPO₄, 0,2 g/L KH₂PO. pH dostosowano do 7,5 przy użyciu 10N NaOH, a następnie sterylizowano przez filtr 0,2 μm.
• Metanosulfonian tricainy (TMS, MS-222) (Crescent Research Chemicals CAS#886-86-2).
• Wodorowęglan sodu (Fisher Scientific S-233-500).
• Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich 10771-100 mL)
• Sól sodowa heparyny (Sigma-Aldrich H3149-50KU)
• Pożywka hodowlana dla guzów Xenopus 15/0 [szczegóły w punkcie 3]: 1 L podstawowej pożywki Iscove DMEM (Gibco-Invitrogen 11965) z 10 mL insuliny, 10 mL nieistotnych aminokwasów, 10 mL penicyliny-streptomycyny; 10 μg/mL kanamycyny; 3 mL primatone (Sheffield Products Division), 1 mL β2-merkaptoetanolu oraz 3,02 g NaHCO₃ w wodzie (pH 7,0). Pożywkę tę rozcieńczono do osmolarity płazów poprzez dodanie 30% wody dwukrotnie destylowanej i uzupełniono o 5% płodowej surowicy bydlęcej, 20% supernatantu z linii komórkowej A6 nerek Xenopus oraz 0,25% normalnej surowicy Xenopus.

10. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Analiza stereomikroskopowa odrzucenia przeszczepu skóry 12 dni po transplantacji. Klonowana żaba LG-6 otrzymała przeszczep skóry od (A) identycznego pod względem MHC osobnika LG-6 (brak odrzutu) lub (B) niezwiązanego genetycznie dawcy z odmiennym MHC (odrzut w 80%). Strzałki wskazują srebrzyste komórki pigmentowe – irydofory, które wyznaczają zdrową (nieodrzuconą) tkankę przeszczepioną. (*) Znak pozostawiony przez pęsetę, niezwiązany z procesem odrzucania.

Rycina 2. Gp96 wspomaga prezentację krzyżową antygenów nowotworowych u Xenopus. PL LG-15 (5 x 10⁵) inkubowano przez 1 hr w lodzie z APBS (kontrola negatywna), 1 μg rekombinowanego gp96 oczyszczonego z hodowli E. Coli lub 1 lub 0,5 μg gp96 oczyszczonego z tkanki guza 15/0. Po 3 przemyciach komórki przeniesiono adoptywnie do dorosłych biorców LG-15 (1 x 10⁶/osobnik). Trzy dni później, żywe komórki guza 15/0 (5 x 10⁵) przeszczepiono drogą wstrzyknięcia s.c. Każda krzywa przedstawia kinetykę wzrostu guza u jednej żaby. Monitorowano dni po wyzwaniu, w których po raz pierwszy pojawiły się guzy, a wielkość guza określano okresowo za pomocą suwmiarki (długość x szerokość x grubość).

Dyskusja

Płaz z rodzaju Xenopus stanowi wyjątkowy i wszechstronny niemammalny model do badania odporności. Jego szerokie zastosowanie w badaniach biomedycznych i immunologicznych doprowadziło do opracowania wielu ważnych narzędzi badawczych, takich jak zdefiniowane przez MHC klony LG-6 i LG-15, a także różnych linii komórkowych i przeciwciał monoklonalnych. Wykorzystując te narzędzia, opracowaliśmy różne testy in vitro i in vivo w celu zbadania zdolności białek szoku cieplnego, takich jak gp96, do pośre...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wymagane odczynniki:
bufor fosforanowy dla płazów (APBS):
NaCl, 1,15 g/L
Na2HPO4, 0,2 g/L
KH2PO
10N NaOH
Metanosulfonian trykainy (TMS, MS-222)	Crescent Research Chemicals	CAS#886-86-2
Węglan sodu(IV)	Fisher Scientific	S-233-500
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	100 ml
Sól sodowa heparyny	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Pożywka dla guzów Xenopus 15/0 [szczegóły w punkcie 3]:
podstawowa pożywka Iscove DMEM	GIBCO, by Life Technologies	11965
Insulina
Aminokwasy nieessentialne
Penicylina-streptomycyna
Kanamycyna
Primatone	Dział Produktów Sheffield
β2-merkapto–etanol
NaHCO3
30% dwukrotnie destylowana woda
5% płodowej surowicy bydlęcej
20% supernatantu z linii komórkowej A6 nerki Xenopus
0,25% normalnego surowicy Xenopus
Materiały i sprzęt:
sterylne probówki stożkowe do wirowania o pojemności 50 i 15 ml
sterylne igły Precision Glide 25 G 5/8"	BD Biosciences
igła 18 G 1½ sterylne igły Precision Glide	BD Biosciences
sterylna strzykawka tuberkulinowa 1 ml z końcówką typu slip tip	BD Biosciences
sterylna strzykawka 10 ml z końcówką typu Slip Tip	BD Biosciences
Probówki do mikrowirówki 1,5 ml (sterylne)
Sterylne polistyrenowe płytki Petriego 60 x 15 mm	Falcon BD
Żyletki
szkiełka przedmiotowe premium 25 x 75 mm x 1 mm	Fisher Scientific
szklane szalki Petri o średnicy 10 cm
9" Jednorazowe pipety Pasteura Durex z borokrzemianowego szkła z bawełnianym czopem	VWR international
przewody Tygon
Dwie igły szwajcarskie typu Jeweler nr 5’Pinceta	Miltex Inc.
Mikrosekcyjne nożyczki sprężynowe McPherson-Vannas z prostą krawędzią tnącą 6 mm	Roboz Surgical Instruments Co.
suwmiarka Helios
Mikroskop stereoskopowy
Iluminator o wysokiej intensywności
Komora odczytowa (hemacytometr)
Palnik Bunsena
37°inkubator wytrząsowy C
Wirówka