Porównawcze badanie in vivo przymiotności adiuwantowej gp96 u żaby Xenopus laevis

Podsumowanie

Żaba Xenopus laevis stanowi atrakcyjną, niemammalijną alternatywę modelu badawczego do analizy zdolności białek szoku termicznego, takich jak gp96, do promowania swoistych dla antygenu odpowiedzi limfocytów T CD8. Przedstawiamy metody badania in vivo wspomagania cross-prezentacji antygenów skóry i nowotworów przez gp96.

Streszczenie

Opracowaliśmy u płazów Xenopus laevis unikalny model niemammalny do badania zdolności niektórych białek szoku cieplnego (hsp), takich jak gp96, do ułatwiania krzyżowej prezentacji antygenów opiekuńczych oraz wywoływania wrodzonych i adaptacyjnych odpowiedzi limfocytów T. Odrzucanie przeszczepów skóry u Xenopus stanowi doskonałą platformę do badania zdolności gp96 do wywoływania klasycznych odpowiedzi limfocytów T ograniczonych przez MHC klasy Ia (klasa Ia). Ponadto model Xenopus stanowi atrakcyjną alternatywę dla myszy w badaniu zdolności gp96 do generowania odpowiedzi przeciwko guzam, które obniżyły ekspresję cząsteczek klasy Ia, unikając w ten sposób nadzoru immunologicznego. Niedawno opracowaliśmy test adoptywnego transferu komórek u klonów Xenopus, wykorzystując leukocyty otrzewnowe jako komórki prezentujące antygen (APC), i wykazaliśmy, że gp96 może indukować odpowiedzi limfocytów T CD8 in vivo przeciwko mniejszym antygenom histokompatybilności skóry, a także przeciwko guzowi grasicy Xenopus 15/0, który nie wykazuje ekspresji cząsteczek klasy Ia. Opisujemy tutaj metodologię niezbędną do przeprowadzenia tych testów, w tym pobieranie, pulsowanie i adoptywny transfer leukocytów otrzewnowych, a także testy przeszczepiania skóry i guzów. Opisujemy również pobieranie i separację leukocytów krwi obwodowej wykorzystywanych w cytometrii przepływowej oraz testach proliferacji, co pozwala na dalszą charakterystykę populacji efektorowych zaangażowanych w odrzucanie skóry i odpowiedzi przeciwnowotworowe.

Protokół

1. Zwierzęta

X. laevis x X. gilli klony izogeniczne LG-6 i LG-15 ¹ pochodzą z naszej kolonii hodowlanej na Uniwersytecie w Rochester (http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/xenopus/index.htm). LG-6 i LG-15 posiadają ten sam heterozygotyczny haplotyp MHC (a/c), ale różnią się w mniejszych loci zgodności tkankowej (H). Potomstwo z tych klonów jest otrzymywane w drodze gynogenezy, w której diploidalne komórki jajowe wyprodukowane przez samicę są aktywowane przez naświetlony promieniowaniem UV plemnik (bez wkładu DNA do potomstwa).

Stosowanie rękawiczek jest opcjonalne. Niektórzy preferują ich niezakładanie, ponieważ utrudnia to manipulację żabami (są śliskie), a ponadto wydaje się powodować u nich dyskomfort.

2. Oczyszczanie gp96 z guza 15/0 (wykazującego ekspresję zarówno antygenów nowotworowych, jak i mniejszych antygenów H)

Oczyszczanie Gp96 zostało opisane wcześniej ^{2, 3}. W skrócie, gp96 jest oczyszczane poprzez frakcjonowanie siarczanem amonu w stężeniu 50-70%, a następnie za pomocą chromatografii na ConA-Sepharose oraz DEAE. Z 1 mL tkanki guza można uzyskać około 20-50 μg białka. Czystość preparatu określa się za pomocą SDS-PAGE i barwienia srebrem.

3. Pobudzanie i pozyskiwanie leukocytów otrzewnych (PLs) od żab LG-6 z różnicami w antygenach mniejszego histocompatibility (Minor H-Ag)

1. Hodować 25 ml przez noc E. coli hodowlę w probówce stożkowej o pojemności 50 ml w temperaturze 37°C z wytrząsaniem.
2. Następnego dnia należy zabić bakterie poprzez gotowanie ich przez 1 godzinę.
3. Odwiruj próbki z zabitymi termicznie mikroorganizmami E. coli przez 15 min przy 2 000 obr./min (1 500 g) w temperaturze 4°C.
4. Usunąć supernatant i zawiesić osad bakteryjny w 1/10^th pierwotna objętość hodowli (2,5 ml) w APBS. W tym momencie hodowla bakteryjna jest gotowa do użycia i musi zostać wykorzystana w ciągu 24 godzin.
5. Wstrzyknąć dojamy brzusznej (i.p.) 200 μL (dla żaby o długości 2 cali) lub 300 μL (dla żaby o długości 3 cali) preparatu bakterii zabitych termicznie na jedną żabę, używając igły 25G o długości 5/8 cala.
6. Trzy dni po iniekcji PL są pobierane za pomocą płukania otrzewnej.
7. Przed pobraniem PL dorosłe żaby poddaje się znieczuleniu poprzez zanurzenie w 0,1% wodnym roztworze metanosulfonianu trikainy (TMS, MS-222) buforowanym wodorowęglanem sodu przez maksymalnie 5 min, aż do całkowitego ustania ruchów (czas trwania zależy od wielkości i wieku zwierząt). Zwierzęta budzą się w ciągu 10–20 min po zabiegu.
8. Zdezynfekuj brzuch żaby niewielką ilością 70% etanolu.
9. Wstrzyknąć do jamy otrzewnowej 5 ml (w przypadku żaby o długości 2 cali) lub 10 ml (w przypadku żaby o długości 3 cali) sterylnego roztworu APBS, uprzednio ogrzanego do temperatury pokojowej, używając igły 18G o długości 1 ½ cala. Wyjąć igłę i delikatnie masować żabę przez minutę, aby zapewnić równomierne wymieszanie wstrzykniętego buforu z płynem w jamie ciała.
10. Użyj nowej igły o rozmiarze 18 G i długości 1 ½ cala, bez strzykawki, aby zebrać płyn peritonealny, który będzie wyciekać z tylnej części igły do czystej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Należy upewnić się, że odzyskano jak największą część początkowo wstrzykniętej objętości. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć naczyń krwionośnych w centralnej części obszaru brzusznego.
11. Po pobraniu PL-ów należy umieścić żabę w pojemniku z płytką wodą, aż do momentu jej przebudzenia, po czym można ją przenieść z powrotem do klatki.

4. Pulsowanie i adoptywny transfer Lg-6 Pls do naiwnych biorców Lg-6

1. Przemyć PL raz zimnym APBS i odwirować przy 1,000 rpm (750 g) przez 10 min w temperaturze 4°C.
2. Usunąć nadsącz i resuspendować PL w APBS.
3. Poddać PL pulsacji gp96 w stężeniu 1 μg gp96 na 5 x 10⁵ PL.
4. Po dodaniu odpowiedniej ilości gp96 do PL, wymieszać je za pomocą pipety i inkubować na lodzie przez 1 godzinę.
5. Odwirować komórki przy 1,000 rpm przez 10 min w temperaturze 4°C lub przy 14,000 rpm przez 1 min, aby usunąć niezwiązany gp96.
6. Przemyć PL 3 razy zimnym APBS, aby upewnić się, że nie pozostały resztki gp96.
7. Resuspendować pulsowane PL do stężenia 5 x 10⁵ PL na 300 μL.
8. Przenieść adoptywnie PL poprzez wtryśnięcie d.o. za pomocą igły 25 gauge 5/8. Wstrzyknąć 300 μL pulsowanych PL (5 x 10⁵ komórek) na zwierzę.
9. Żaby muszą zostać przygotowane co najmniej 3 dni przed kontynuacją eksperymentów z przeszczepem skóry lub wyzwaniem nowotworowym.

5. Analiza przeszczepu skóry

Odrzucenie przeszczepu skóry jest dobrze ugruntowaną metodą badawczą u Xenopus ^{4, 5, 6}. U Xenopus biorca odrzuca skórę dawcy wykazującą 1 lub 2 niezgodności haplotypów MHC w ciągu 18-22 dni w temperaturze 21-22°C. W przeciwieństwie do tego, przeszczepy skóry między klonami LG-6 i LG-15, które różnią się jedynie mniejszymi antygenami histokompatybilnymi (minor H-Ags), są odrzucane wolniej (powyżej 30 dni). Jednak odrzucenie to przyspiesza u biorców, którzy zostali uprzednio uwrażliwieni na mniejsze antygeny histokompatybilne dawcy, albo poprzez wcześniejszy przeszczep skóry, albo poprzez immunizację gp96 oczyszczonym z tkanki dawcy. Brak odrzucenia występuje w przypadku, gdy dawca i biorca są genetycznie identyczni (np. zwierzęta klonowane lub w pełni inbredowane). Zatem ta prosta technika jest bardzo skutecznym narzędziem do charakteryzacji odpowiedzi immunologicznych wywołanych przez gp96 in vivo.

1. Zanieć żabę dawcy zgodnie z opisem w punkcie 3.7.
   Uwaga: Należy zachować jedynie minimalne środki ostrożności, ponieważ Xenopus produkuje w skórze silne peptydy przeciwdrobnoustrojowe (np. magaininę), co sprawia, że całkowite procedury aseptyczne nie są konieczne. W rzeczywistości traktowanie żaby jakimkolwiek środkiem dezynfekcyjnym byłoby szkodliwe dla skóry. Ponadto Xenopus nie przenoszą żadnych patogenów na ludzi, dlatego użycie rękawiczek jest opcjonalne. Wszystkie użyte instrumenty do sekcji muszą być jednak autoklawowane, a wszystkie roztwory muszą być sterylne.
2. Za pomocą nożyczek wyciąć i usunąć niewielki (20 mm X 5 mm) fragment skóry brzusznej (skóry brzucha, która ma srebrzysty kolor ze względu na obecność komórek pigmentowych – irydoforów) od żaby dawcy LG-15.
3. Umieścić skórę w szalce Petriego zawierającej APBS i trzymać na lodzie. Tkankę skórną należy manipulować bardzo delikatnie; należy unikać ściskania jej pęsetą.
4. Za pomocą żyletki lub nożyczek wyciąć poszczególne przeszczepy o wymiarach 5 mm X 5 mm. Fragmenty należy przechowywać w APBS na lodzie.
5. W tym momencie żabę dawcy umieszcza się w pojemniku z płytką warstwą wody, aż się obudzi, a następnie przenosi do wody zawierającej antybiotyki (Penstrep w stężeniu 5 mg/L). Żaba pozostaje w wodzie z antybiotykami przez dwa dni, po czym zostaje przeniesiona do zwykłej wody. Mała rana w miejscu usunięcia skóry nie wymaga zszycia i goi się w ciągu tygodnia.
6. Zanieć żabę biorcy LG-6.
7. Wyonać niewielkie nacięcie na skórze grzbietowej (na plecach) biorcy i wprowadzić przeszczep o wymiarach 5 mm X 5 mm pod skórę srebrzystą stroną do góry. Należy uważać, aby nie wprowadzić pod skórę dużych pęcherzyków powietrza, ponieważ może to doprowadzić do przemieszczenia lub nawet utraty przeszczepu.
8. Należy odnotować oznaczenia nożyczkowe i pęsetowe na przeszczepach, ponieważ nie są one uznawane za odrzucenie przeszczepu po rozpoczęciu oceny.
9. Po 24 godzinach należy usunąć część nakładającej się skóry gospodarza z obszaru przeszczepu.
10. Zanieć żabę biorcy LG-6. Postępować z zwierzęciem zgodnie z opisem w punkcie 5.1.
11. Za pomocą autoklawowanych nożyczek wyciąć „okno” wokół przeszczepu, aby można było go swobodnie obserwować. Należy uważać, aby nie dotykać skóry dawcy i nie wywołać krwawienia. Pozostawić żabę do wybudzenia zgodnie z opisem w punkcie 5.5.
12. Natychmiast rozpocząć ocenę przeszczepu, wykonując szkic. Odrzucenie przeszczepu skóry określa się na podstawie procentowego zniszczenia irydoforów w przeszczepionej skórze.
13. Przeszczepy należy sprawdzać co 2-3 dni, jednak nie ma potrzeby ponownego znieczulania zwierząt. Aby zwizualizować przeszczepy, żaby należy umieścić w szalce Petriego pod mikroskopem stereotypowym.

6. Immunohistochemia całego preparatu przeszczepionej skóry

Immunohistochemia całego preparatu żaby została opisana wcześniej ⁶. W skrócie, żabę znieczula się i umieszcza pod mikroskopem na sterylnym ręczniku papierowym uprzednio zwilżonym wodą dla żab (obszar roboczy jest również przygotowany aseptycznie). Następnie pobiera się przeszczepioną skórę wraz z niewielką ilością otaczającej skóry gospodarza i barwi ją przeciwciałami w sposób analogiczny do barwienia komórek do analizy cytometrii przepływowej ⁶. Należy używać autoklawowanych narzędzi i sterylnych buforów. Po barwieniu skórę umieszcza się na szkiełku przedmiotowym i delikatnie przyciska szkiełkiem nakrywnym. Na tym etapie skórę można wizualizować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby zidentyfikować różne populacje komórek, które zinfiltrowały przeszczep. Po zabiegu żabę utrzymuje się w wodzie z antybiotykami, zgodnie z opisem w sekcji 5.5., a następnie przenosi do zwykłej wody. Mała rana pozostała w miejscu usunięcia skóry goi się w ciągu tygodnia.

7. Charakterystyka leukocytów krwi

1. Przed pobraniem krwi z żaby należy przygotować „szklane igły”, wyciągając sterylne pipety Pasteura nad płomieniem. Cienki koniec pipety należy zaostrzyć pod stereomikroskopem. Następnie pipetę podłącza się do plastikowej rurki aspiracyjnej.
   Wszystkie narzędzia, takie jak pincety i nożyczki, muszą zostać wysterylizowane w autoklawie przed użyciem.
2. Należy również przygotować 10 mL lodowatego APBS oraz roztwór heparyny poprzez dodanie 50 jednostek heparyny na 1 mL APBS. Roztwór należy przechowywać w lodzie. Wszystkie używane roztwory muszą być sterylne.
3. Żabę należy znieczulić zgodnie z opisem w punkcie 3.7 i stosować te same procedury obchodzenia się ze zwierzęciem, które opisano w punkcie 5.1.
4. Należy naciąć skórę nad tylną stopą, aby odsłonić grzbietową żyłę kostkową.
5. Pipetę Pasteura należy napełnić 1-2 mL roztworem APBS+heparyna.
6. „Szklaną igłę” należy wprowadzić do żyły i rozpocząć pobieranie krwi, powoli aspirując ją ustami. Ważne jest, aby w „szklanej igle” znajdował się roztwór APBS+heparyna, ponieważ zapobiegnie to krzepnięciu krwi i zapchaniu się końcówki igły.
7. Z jednej żaby o przeciętnej wielkości można uzyskać od 1 do 2 mL krwi.
8. Małe nacięcie na nodze żaby nie wymaga zszywania, a rana goi się w ciągu jednego tygodnia.
9. Krew należy wirować przy 1,000 rpm przez 10 min w temperaturze 4°C.
10. Należy usunąć nadsącz i wypłukać komórki 1X w 10 mL zimnego APBS.
11. Należy nałożyć 2 mL krwi (1-5 x 10⁶ komórek) na 1 mL ficoll Histopaque 1.077 (Sigma) wstępnie ogrzanego do temperatury pokojowej, aby oddzielić leukocyty krwi od erytrocytów.
12. Wirować przez 20 min przy 1,000 rpm w temperaturze pokojowej bez hamowania, a następnie zebrać pierścień leukocytów.
13. Komórki należy wypłukać 2X w APBS poprzez wirowanie przy 1,400 rpm przez 10 min w temperaturze 4°C, aby usunąć pozostałości ficollu.
14. Na tym etapie komórki są gotowe do barwienia przeciwciałami w celu analizy cytometrycznej lub do wykorzystania w testach hodowli in vitro.

8. Próba transplantacji guza

1. Około tygodnia przed eksperymentem rozmrozić nową partię komórek nowotworowych 15/0 i upewnić się, że komórki dobrze rosną. Pożywka hodowlana została krótko opisana w następnej sekcji, a bardziej szczegółowo w ³.
2. Namnożyć komórki nowotworowe 15/0.
3. W dniu eksperymentu policzyć komórki i określić stopień śmierci komórkowej metodą wykluczania błękitu Trypan. Śmiertelność komórek powinna wynosić mniej niż 5%. Przemyć komórki 1X w zimnym APBS i odwiruj przy 1,000 rpm w temperaturze 4°C przez 10 min.
4. Resuspender komórki w pożywce do hodowli nowotworów w zagęszczeniu 5 x 10⁵ komórek 15/0 na 300 μL.
5. Przeszczepić 5 x 10⁵ komórek w objętości 300 μL na żabę poprzez wstrzyknięcie podskórne za pomocą igły 25 gauge 5/8 po jednej stronie grzbietu zwierzęcia.
6. Wzrost guza rozpocznie się w ciągu 2-3 tygodni po inokulacji nowotworem. Należy odnotować moment pierwszego pojawienia się guza oraz zapisywać objętość guza co 2-3 dni. Objętość guza (wysokość X długość X szerokość) mierzy się za pomocą suwmiarki.
7. Gdy guz osiągnie objętość 3,500 mm³ lub żaba zacznie wykazywać letarg, zwierzę należy poddać eutanazji, aby zapobiec dyskomfortowi.

9. Wymagane odczynniki:

• Fosforanowy bufor solny dla płazów (APBS): 6,6 g/L NaCl, 1,15 g/L Na₂HPO₄, 0,2 g/L KH₂PO. pH dostosowane do 7,5 za pomocą 10N NaOH i wysterylizowane przez filtr 0,2 μm.
• Metanosulfonian trikainy (TMS, MS-222) (Crescent Research Chemicals CAS#886-86-2).
• Wodorowęglan sodu (Fisher Scientific S-233-500).
• Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich 10771-100 mL)
• Sól sodowa heparyny (Sigma-Aldrich H3149-50KU)
• Pożywka hodowlana dla guzów Xenopus 15/0 [szczegóły w punkcie 3]: 1 L podstawowej pożywki Iscove DMEM (Gibco-Invitrogen 11965) z dodatkiem 10 mL insuliny, 10 mL nieistotnych aminokwasów, 10 mL penicyliny-streptomycyny; 10 μg/mL kanamycyny; 3 mL primatone (Sheffield Products Division), 1 mL β2-merkaptoetanolu oraz 3,02 g NaHCO₃ w wodzie (pH 7,0). Pożywkę tę rozcieńcza się do osmolarności płazów poprzez dodanie 30% wody dwukrotnie destylowanej i uzupełnia o 5% płodowej surowicy bydlęcej, 20% supernatantu z linii komórkowej nerek Xenopus A6 oraz 0,25% normalnej surowicy Xenopus.

10. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Analiza stereomikroskopowa odrzucenia przeszczepu skóry 12 dni po transplantacji. Klonowana żaba LG-6 otrzymała przeszczep skóry od (A) identycznej pod względem MHC żaby LG-6 (brak odrzucenia) lub (B) niezwiązanego genetycznie dawcy z odmiennym MHC (80% odrzucenia). Strzałki wskazują srebrzyste, pigmentowane komórki irydoforów znakujące zdrowe (nieodrzucone) tkanki przeszczepione. (*) Ślad po pęsecie, niezwiązany z odrzuceniem.

Rycina 2. Gp96 wspomaga prezentację krzyżową antygenów nowotworowych u Xenopus. Limfocyty PL LG-15 (5 x 10⁵) inkubowano przez 1 h w lodzie z APBS (kontrola negatywna), 1 μg rekombinowanego gp96 oczyszczonego z hodowli E. Coli lub 1 lub 0,5 μg gp96 oczyszczonego z tkanki guza 15/0. Po trzech przemyciach komórki poddano transferowi adopcyjnemu do dorosłych biorców LG-15 (1 x 10⁶ na osobnika). Trzy dni później, żywe komórki guza 15/0 (5 x 10⁵) przeszczepiono poprzez wtryskiwanie podskórne. Każda krzywa przedstawia kinetykę wzrostu guza u jednej żaby. Monitorowano dni po wyzwoleniu, w których po raz pierwszy pojawiły się guzy, a wielkość guza określano okresowo za pomocą suwmiarki (długość x szerokość x grubość).

Dyskusja

Płaz z rodzaju Xenopus stanowi wyjątkowy i wszechstronny niemammalny model do badania odporności. Jego szerokie zastosowanie w badaniach biomedycznych i immunologicznych doprowadziło do opracowania wielu ważnych narzędzi badawczych, takich jak zdefiniowane przez MHC klony LG-6 i LG-15, a także różnych linii komórkowych i przeciwciał monoklonalnych. Wykorzystując te narzędzia, opracowaliśmy różne testy in vitro i in vivo w celu zbadania zdolności białek szoku cieplnego, takich jak gp96, do pośre...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wymagane odczynniki:
bufor fosforanowy dla płazów (APBS):
NaCl, 1,15 g/L
Na2HPO4, 0,2 g/L
KH2PO
10N NaOH
Metanosulfonian trykainy (TMS, MS-222)	Crescent Research Chemicals	CAS#886-86-2
Węglan sodu(IV)	Fisher Scientific	S-233-500
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771	100 ml
Sól sodowa heparyny	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Pożywka dla guzów Xenopus 15/0 [szczegóły w punkcie 3]:
podstawowa pożywka Iscove DMEM	GIBCO, by Life Technologies	11965
Insulina
Aminokwasy nieessentialne
Penicylina-streptomycyna
Kanamycyna
Primatone	Dział Produktów Sheffield
β2-merkapto–etanol
NaHCO3
30% dwukrotnie destylowana woda
5% płodowej surowicy bydlęcej
20% supernatantu z linii komórkowej A6 nerki Xenopus
0,25% normalnego surowicy Xenopus
Materiały i sprzęt:
sterylne probówki stożkowe do wirowania o pojemności 50 i 15 ml
sterylne igły Precision Glide 25 G 5/8"	BD Biosciences
igła 18 G 1½ sterylne igły Precision Glide	BD Biosciences
sterylna strzykawka tuberkulinowa 1 ml z końcówką typu slip tip	BD Biosciences
sterylna strzykawka 10 ml z końcówką typu Slip Tip	BD Biosciences
Probówki do mikrowirówki 1,5 ml (sterylne)
Sterylne polistyrenowe płytki Petriego 60 x 15 mm	Falcon BD
Żyletki
szkiełka przedmiotowe premium 25 x 75 mm x 1 mm	Fisher Scientific
szklane szalki Petri o średnicy 10 cm
9" Jednorazowe pipety Pasteura Durex z borokrzemianowego szkła z bawełnianym czopem	VWR international
przewody Tygon
Dwie igły szwajcarskie typu Jeweler nr 5’Pinceta	Miltex Inc.
Mikrosekcyjne nożyczki sprężynowe McPherson-Vannas z prostą krawędzią tnącą 6 mm	Roboz Surgical Instruments Co.
suwmiarka Helios
Mikroskop stereoskopowy
Iluminator o wysokiej intensywności
Komora odczytowa (hemacytometr)
Palnik Bunsena
37°inkubator wytrząsowy C
Wirówka