Kokultura 2D komórek białaczkowych z BMSC: metoda uzyskiwania subpopulacji komórek białaczkowych

Streszczenie

Źródło: Slone, W. L. et al. Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro. J. Vis. Exp. (2016).

Ten film opisuje technikę długoterminowej kohodowli 2D komórek białaczkowych z komórkami zrębu szpiku kostnego w celu zbadania ich interakcji z mikrośrodowiskiem szpiku kostnego. Model kokultury 2D wykorzystuje komórki ostrej białaczki limfoblastycznej oraz zrębu szpiku kostnego lub osteoblasty, które wpływają na fenotyp komórek nowotworowych. Badanie to pomoże w badaniu mechanizmów, które leżą u podstaw przeżycia komórek białaczkowych wspomaganych szpikiem kostnym podczas ekspozycji na chemioterapię.

Protokół

1. Zaawansowane przygotowanie

1. Hodowla komórek zrębu szpiku kostnego (BMSC) i osteoblastów (OB).
   1. Utrzymuj zarówno BMSC, jak i OB w temperaturze 37 °C przy 6% CO₂ i hoduj na 10 cm płytkach do hodowli tkankowej, aż do osiągnięcia 90% zbieżności.
   2. Trypsynizuj komórki BMSC lub OB i podziel 1:2 na nowe płytki o średnicy 10 cm. Komórki są hodowane zgodnie z tymi standardami, dopóki nie będą potrzebne do kohodowli białaczki.

2. Ustanawianie i utrzymywanie wspólnej kultury

1. Dodaj 5-20 x 10⁶ komórek białaczkowych w 10 ml pożywki hodowlanej specyficznej dla nowotworu na 80%-90% zlewającej się płytki BMSC lub OB.
   UWAGA: Nasze laboratorium utrzymuje kokultury w temperaturze 37 °C w 5%_O2, aby lepiej podsumować mikrośrodowisko szpiku kostnego, które, jak wykazano, mieści się w zakresie od 1% do 7%. Jednak utrzymanie kokultur przy tym napięciu tlenu nie jest krytyczne dla ustanowienia trzech subpopulacji białaczki i leży w gestii laboratorium.
2. Co 4^dni należy usunąć wszystkie pożywki z wyjątkiem 1 ml (w tym komórki białaczkowe w zawiesinie) i zastąpić 9 ml świeżej pożywki do hodowli białaczkowej. Podczas wyjmowania 9 ml pożywki z płytki należy uważać, aby nie naruszyć warstwy przylegającej komórek zrębu szpiku kostnego (BMSC) lub osteoblastów (OB).
   1. Wyjmij nośnik, przechylając płytkę na bok i zassaj nośnik w rogu płytki. Dodatkowo, dodając świeże podłoże, pamiętaj, aby dodać kroplami w rogu płyty przy ścianie bocznej, aby zapewnić minimalne zakłócenie warstwy przylegającej BMSC lub OB.
3. Po 12 dniu kohodowli wypłucz komórki białaczkowe z warstwy BMSC lub OB, delikatnie pipetując pożywkę hodowlaną z naczynia w górę iw dół na szalce około 5 do 10 razy, a następnie zebrać w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Ponownie wysiewaj się na nową, 80%-90% zlewającą się płytkę BMSC lub OB, jak opisano w kroku 2.1.
   UWAGA: Delikatne płukanie kokultury, jak opisano w kroku 2.3, usunie zawieszone i fazowe jasne komórki białaczkowe bez naruszania monowarstwy BMSC lub OB. Pozwala to na przeniesienie tylko komórek nowotworowych na następną płytkę kohodowlaną. Ten 12-dniowy cykl można powtarzać tyle razy, ile potrzeba, w zależności od potrzeb użytkownika.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Naczynia do hodowli komórkowych 100 x 20 mm	Greiner Bio-One	Numer katalogowy: 664160
Stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 15 ml	Produkty medyczne na całym świecie	41021037	Służy do zbierania komórek
Pożywki hodowlane
Pożywki do hodowli osteoblastów	Komórka promocyjna	Silnik C-27001	Dla ludzkich pożywek osteoblastowych
Nośniki RPMI 1640	Mediatech, Inc.	15-040	Do przygotowania pożywki nowotworowej
Komórki adherentne
Ludzkie osteoblasty	Komórka promocyjna	Nr kat. C-12720	Ludzkie osteoblasty zostały wyhodowane zgodnie z zaleceniami dostawcy.
Ludzkie komórki zrębu kości Morrowa	Rdzeń próbki biologicznej WVU		Zdeidentyfikowane pierwotne komórki zrębu ludzkiej białaczki i szpiku kostnego (BMSC) zostały dostarczone przez Mary Babb Randolph Cancer Center (MBRCC) Biospecimen Processing Core oraz Bank Tkanek Wydziału Patologii Uniwersytetu Zachodniej Wirginii
Komórki białaczkowe
REH	Kontroler ATCC (Kontroler T	ATCC-CRL-8286	Komórki REH hodowano zgodnie z zaleceniami dostawcy i zalecanymi pożywkami.
Zobacz materiał SD-1	Komunikacja DSMZ	ACC 366	SD-1 hodowano zgodnie z zaleceniami dostawcy i zalecanymi pożywkami.

TGLI