Pobieranie próbek krwi za oczodołem: metoda izolowania komórek jednojądrzastych z zatoki zadoczodołowej myszy

Streszczenie

Źródło: Mopin A. et al. Szczegółowy protokół charakteryzujący mysią linię komórkową C1498 i związany z nią mysi model białaczki. J. Vis. Exp. (2016)

Film opisuje metodę pobierania próbek krwi obwodowej z zatoki zaoczodołowej myszy i dalszej izolacji komórek jednojądrzastych z krwi za pomocą wirowania w gradiacji gęstości.

Protokół

1. Retro orbitalne pobieranie krwi

1. Wykonaj retroorbitalne pobieranie krwi tuż przed eutanazją w sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym i pod lampą grzewczą, aby zapobiec hipotermii.
2. Do znieczulenia należy stosować ketaminę w dawce 150 mg/kg i ksylazynę w dawce 10 mg/kg. Przygotować roztwór znieczulający, rozcieńczając 1,5 ml ketaminy i 0,5 ml ksylazyny w 18 ml roztworu PBS.
3. Włóż rurkę kapilarną do przyśrodkowej kantu oka. Krew uniesie się z zatoki oczodołowej do rurki kapilarnej. Tamować krwawienie, delikatnie uciskając oko sterylną gąbką z gazy.
   nuta: Za pomocą tej techniki można pobrać objętość od 100 do 200 μl krwi.
4. Zbierz krew do probówki EDTA i przechowuj próbkę na lodzie przed wyizolowaniem komórek jednojądrzastych.

2. Izolacja komórek jednojądrzastych krwi

1. Przenieść próbkę krwi (100-200 μl; otrzymaną z kroku 1.1) do probówki mikrowirówki i dodawać PBS/1 mM roztwór EDTA, aż objętość roztworu wyniesie 500 μl. Ostrożnie umieścić 500 μl roztworu oddzielającego pod roztworem zawierającym krew za pomocą igły 30G i strzykawki o pojemności 1 ml. Nie mieszać krwi z roztworem rozdzielającym.
2. Odwirować probówki o sile 800 x g (bez hamulca) przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu zebrać pierścień komórkowy (nieprzezroczystą białą warstwę) za pomocą pipety. Przenieść komórki do probówki do mikrowirówki.
   nuta: Nieprzezroczysta biała warstwa zawiera limfocyty, a także monocyty i pojawia się między dolną warstwą - roztworem rozdzielającym - a górną warstwą.
3. Dodać 1 ml roztworu PBS i odwirować probówkę o sile 350 x g przez 10 minut. Ponownie zawiesić komórki w 600 μl buforu FACS.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ketamina 1000 (100 mg/ml)	WIRUS VIRBAC	3.59713E+12
Ksylazyna SEDAXYLAN (20 mg/ml)	CEVA (Międzynarodowa Federacja
Roztwór PBS (1x koncentrat)	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 14190
Ultra Pure 0,5 M roztwór EDTA, pH 8,0	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 15575
Roztwór separujący (Mysz Pancoll)	PANBIOTECHNOLOGIA	P04-64100
Rurka EDTA	Greiner Bio-One	454034
Pipeta Pasteura 150 mm (rurka kapilarna)	Marka rybacka	Numer katalogowy: 1154-6963
Rurki do cytometrii przepływowej (niebieskie)	Beckman Coulter	2523749
Probówka do mikrowirówek (1,5 ml)	ThermoFisher Naukowy	05-408-129
Sterylne gąbki z gazy	URGO	Numer katalogowy: 501580
Igła 30 G	Becton & Dickinson	304000
Strzykawka 1 ml	Terumo (Ziemia)	Zobacz materiał SS-01T
Shandon Cytospin 3 Cytowirówka cytocentrifuge	ThermoFisher Naukowy