Wirowanie w gradiencie gęstości: metoda izolowania komórek PBL z krwi obwodowej

Abstract

Źródło: Hay, J. et al. Subkomórkowe frakcjonowanie pierwotnych komórek przewlekłej białaczki limfocytowej w celu monitorowania transportu białek jądrowych/cytoplazmatycznych. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film opisuje technikę izolowania komórek przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL) od krwi obwodowej. Dzięki temu protokołowi wyizolujemy komórki PBL z próbki krwi ludzkiego pacjenta w celu późniejszego wydajnego generowania frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych.

Protocol

1. Izolacja komórek PBL z próbek krwi pacjenta

1. Próbki krwi obwodowej od pacjentów, którzy wcześniej wyrazili zgodę na PBL, są odbierane z kliniki w probówkach do pobierania krwi EDTA, wraz z morfologią białych krwinek (WCC). Oczyść próbki CLL krwi obwodowej zgodnie z WCC. W przypadku WCC <⁴⁰ x 10 6 komórek/ml przejdź do kroku 1.1.1; w przypadku WCC ≥ 40 x 10⁶ komórek/ml przejdź do kroku 1.1.2.
   1. Wlej zawartość wszystkich probówek z krwią EDTA do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i dodaj 50 μl koktajlu wzbogacającego ludzkie komórki B na 1 ml krwi. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 minut. Przejdź do kroku 1.1.2.
   2. Rozcieńczyć próbkę w stosunku 1:1 buforem do przemywania RT CLL (sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 0,5% płodowa surowica bydlęca (FBS) i 2 mM EDTA).
2. Podwielokrotność pożywki o gradiencie gęstości RT do stożkowej probówki wirówkowej o odpowiedniej wielkości dla próbki (10 ml do probówki o pojemności 50 ml na 30 ml próbki lub 4 ml do probówki o pojemności 15 ml na 10 ml próbki).
3. Ostrożnie ułożyć próbkę warstwowo na pożywce o gradiacji gęstości i odwirować przy 400 x g przez 30 minut w temperaturze RT.
   UWAGA: Upewnij się, że wirówka ma temperaturę RT przed umieszczeniem próbek w wirówce, ponieważ zmiana temperatury spowoduje słabe wzbogacenie komórek jednojądrzastych i wyłącz hamulec wirówki, ponieważ nagłe hamowanie może zakłócić interfejs cieczy.
4. Delikatnie zebrać białą warstwę komórek jednojądrzastych, które gromadzą się na granicy pożywki gradientu gęstości i buforu płuczącego CLL, do świeżej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml za pomocą plastikowej pipety Pasteura.
5. Dodać 40 ml buforu płuczącego CLL do izolowanej monowarstwy w celu przepłukania komórek i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze suchej masy.
6. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad, przesuwając dno probówki, a następnie powtórzyć etap płukania opisany w kroku 1.5.
7. Wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad zgodnie z opisem w kroku 1.6, a następnie ponownie zawiesić osad w ustalonej objętości buforu do płukania CLL (do 40 ml, w zależności od wielkości osadu komórkowego).
8. Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru. Następnie przystąp do cytometrii przepływowej, aby sprawdzić czystość komórek CLL.
   UWAGA: Na tym etapie komórki CLL mogą być hodowane w stężeniu 10 x 10⁶ komórek/ml w pożywkach do wykorzystania w eksperymentach i/lub kriokonserwowane w 10% dimetylosulfotlenku (DMSO)/FBS do przyszłych prac w stężeniach do 100 x 10⁶ komórek/fiolkę.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Probówka 15 ml	Griener Bio jeden	188271
Probówki do mikrowirówek 1,5 ml	Griener Bio jeden	616201
Dmso	Sigma	Zobacz materiał D2650
Edta	Sigma	Eds
Surowica bydlęca płodu	Rybak termiczny	10500064
Histopaque1077 gradient gęstości	Sigma	Zobacz materiał H8889
Roztwór błękitu trypanowego	Rybak termiczny	15250061
Tabletki PBS	Fisher Naukowy	BR0014G
RosetteSep Koktajl wzbogacający ludzkie komórki B	Technologie komórek macierzystych	Numer katalogowy: 15064
Sigma 3-16P	SciQuip (SciQuip)		wirówka