Pobieranie szpiku kostnego z tylnej kończyny myszy

Streszczenie

Źródło: Zhu, Y. P., Padgett, et al. Przygotowanie całego szpiku kostnego do analizy cytometrii masowej komórek linii neutrofili. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film opisuje szczegółowy protokół izolowania świeżego całego szpiku kostnego z tylnych kończyn myszy w celu zbadania całych wad BM u pacjentów z chorobami krwi, takimi jak białaczka.

Protokół

1. Zbieranie szpiku kostnego myszy (BM)

1. Kup myszy C57BL/6J od komercyjnego dostawcy. Karm standardową dietę gryzoni i trzymaj w klatkach z mikroizolatorami w obiekcie wolnym od patogenów.
2. Użyj samców myszy w wieku 6-10 tygodni do celów eksperymentalnych. Eutanazja przez wdychanie CO_{2 ,} a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
3. Umieść mysz na sterylnej podkładce chirurgicznej brzuchem do góry. Wysterylizuj skórę brzucha i kończyn tylnych, rozpylając 70% etanolu. Użyj nożyczek chirurgicznych do preparowania, aby rozciąć jamę brzuszną.
4. Usuń skórę, aby odsłonić kończyny tylne. Użyj pary kleszczy opatrunkowych z końcówką, aby przytrzymać piszczel myszy tuż poniżej kostki. Użyj innej pary zakrzywionych kleszczy opatrunkowych, aby ustabilizować piszczel poniżej kleszczy opatrunkowych z końcówką. Złam kość piszczelową i odsłoń kość, odrywając mięsień kleszczykami opatrunkowymi z końcówką.
   nuta: Kość piszczelowa jest luźno przymocowana do stawu kolanowego i można ją łatwo wybrać za pomocą kleszczy opatrunkowych z końcówką.
5. Umieść piszczel w zimnym 1x PBS.
6. Następnie przesuń stabilizujące zakrzywione kleszcze opatrunkowe w dół do kości udowej. Wsuń kleszcze opatrunkowe z końcówką poniżej stawu kolanowego i przytrzymaj rzepkę. Zwichnij rzepkę, delikatnie pociągając ją do góry. Odsłoń kość udową, zrywając mięsień przyczepiony do rzepki. Przytrzymaj odsłoniętą kość udową za zakrzywione kleszcze opatrunkowe i odetnij kość udową od spodu kości za pomocą nożyczek chirurgicznych do preparowania.
7. Umieść kość udową w zimnym 1x PBS.
8. Przebić otwór w probówce mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml za pomocą igły 18 G.
9. Umieść zarówno kość piszczelową, jak i kość udową w tej samej probówce do mikrowirówki o pojemności 0,5 ml z otwartym końcem kości skierowanym w dół do otworu.
10. Umieść probówkę o pojemności 0,5 ml zawierającą kość piszczelową i kość udową w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml.
11. Obracać dwuwarstwowe probówki zawierające zarówno kość piszczelową, jak i kość udową pod ciśnieniem 5 510 x g przez 30 s w mikrowirówce.
12. Upewnij się, że BM został wyjęty z kości i granulowany na dnie probówki. Wrzuć probówkę o pojemności 0,5 ml zawierającą uświęcone kości. Mysz BM jest gotowa do kolejnych kroków.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mysz: C57BL/6J	Laboratorium Jacksona	Nr katalogowy: 000664
Hyklon Roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanem	GE Nauki Przyrodnicze	Kot#SH30256.01