Analiza stabilnych izotopów w DNA (DNA-SIP)

Podsumowanie

Metoda znakowania stabilnymi izotopami DNA (DNA stable-isotope probing) jest metodą niezależną od hodowli, służącą do identyfikacji i charakterystyki aktywnych społeczności mikroorganizmów zdolnych do wykorzystania określonych substratów. Asymilacja substratu wzbogaconego w ciężki izotop prowadzi do wbudowania znakowanych atomów w biomasę mikrobiologiczną. Ultracentryfugacja w gradiencie gęstości pozwala na odzyskanie znakowanego DNA do dalszych analiz molekularnych.

Streszczenie

Sondowanie stabilnymi izotopami DNA (DNA-SIP) jest potężną techniką służącą do identyfikacji aktywnych mikroorganizmów, które asymilują określone substraty węglowe i składniki odżywcze do biomasy komórkowej. Jako taka, ta niezależna od hodowli technika stanowi ważną metodologię przypisywania funkcji metabolicznych zróżnicowanym społecznościom zamieszkującym szeroki zakres środowisk lądowych i wodnych. Po inkubacji próbki środowiskowej ze związkami znakowanymi stabilnymi izotopami, wyekstrahowany kwas nukleinowy poddawany jest ultrawirowaniu w gradiencie gęstości, a następnie frakcjonowaniu gradientu w celu oddzielenia kwasów nukleinowych o różnych gęstościach. Oczyszczanie DNA z chlorku cezu pozwala na odzyskanie DNA znakowanego i nieznakowanego do późniejszej charakterystyki molekularnej (np. fingerprintingu, mikromacierzy, bibliotek klonów, metagenomiki). Niniejszy protokół wideo JoVE zapewnia wizualne, krokowe wyjaśnienia procedury ultrawirowania w gradiencie gęstości, frakcjonowania gradientu i odzyskiwania znakowanego DNA. Protokół zawiera również przykładowe dane SIP oraz podkreśla ważne wskazówki i ostrzeżenia, które należy wziąć pod uwagę, aby zapewnić pomyślną analizę DNA-SIP.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników

Metoda DNA-SIP wymaga użycia odczynników, które należy przygotować przed przystąpieniem do właściwej procedury. Instrukcje przygotowania każdego odczynnika są wymienione w tej sekcji i stanowią modyfikację poprzedniego protokołu SIP¹.

1. Roztwór chlorku cezu (CsCl) do przygotowania gradientów SIP – Przygotować 7,163 M roztwór CsCl, stopniowo rozpuszczając 603,0 g CsCl w destylowanej i dejonizowanej wodzie (ddH₂O) do końcowej objętości 500 mL. Należy uważać, aby nie przekroczyć 500 mL! Lekkie podgrzanie roztworu podczas mieszania ułatwi całkowite rozpuszczenie CsCl. Gotowy roztwór rozdzielić na szczelne aliquoty. W naszym laboratorium powszechną praktyką przechowywania jest przygotowanie aliquotów o objętości 100 mL w fiolkach serum o pojemności 125 mL, które następnie zamyka się poprzez zaciskanie korków z gumy butylowej. Szczelne aliquoty można przechowywać w temperaturze pokojowej (20°C) w nieskończoność. Uszczelnienie zapobiega parowaniu i tworzeniu się „skorupy” CsCl. Gęstość roztworu należy wyznaczyć poprzez zważenie trzech powtórzeń aliquotów o objętości 100 μL lub za pomocą cyfrowego refraktometru (np. Reichert AR200), który został starannie skalibrowany dla roztworów CsCl. Po pomyślnej kalibracji urządzenie Reichert AR200 działa stabilnie i dostarcza dokładnych odczytów przez kilka lat. W temperaturze pokojowej (20°C) końcowa gęstość tego roztworu zazwyczaj mieści się w zakresie 1,88-1,89 g ml^-1. Gęstość nieznacznie różni się przy każdym przygotowaniu nowej partii roztworu zapasowego.
2. Roztwór chlorku cezu do przygotowania gradientów z bromkiem etydyny (EtBr) – Połączyć 250 g CsCl z 250 mL sterylnej wody ddH₂O. Rozdzielić ten roztwór do osobnych fiolek serum, które należy zamknąć poprzez zaciskanie korków z gumy butylowej, zgodnie z opisem w punkcie 1.1.
3. Bufor do gradientu – Połączyć 50 ml 1 M Tris-HCl, 3,75 g KCl i 1 ml 0,5 M EDTA z 400 ml wody. Rozpuścić KCl, a następnie uzupełnić ddH₂O do objętości 500 ml. Przesączyć przez filtr sterylizujący i autoklawować. Końcowy roztwór zawiera 0,1 M Tris, 0,1 M KCl i 1 mM EDTA.
4. Roztwór glikolu polietylenowego (PEG) – Przygotować roztwór PEG, rozpuszczając 150 g glikolu polietylenowego 6000 i 46,8 g NaCl w sterylnej wodzie ddH₂O do całkowitej objętości 500 mL (30% PEG, 1,6 M NaCl). Autoklawować.
   Uwaga: Podczas autoklawowania roztwór ten rozdziela się na dwie fazy. Do autoklawowanej butelki należy włożyć magnes mieszający, aby umożliwić prawidłowe wymieszanie roztworu w takim przypadku.
5. Bufor TE – Przygotować roztwór 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) i 1 mM EDTA (pH 8,0) w sterylnej wodzie ddH₂O, wykorzystując autoklawowane roztwory zapasowe 1 M Tris-HCl (pH 8,0) i 0,5 M EDTA (pH 8,0). Przesączyć przez filtr sterylizujący i autoklawować.
6. 70% Etanol – Połączyć 350 ml wysokiej czystości etanolu z 150 ml sterylnej wody ddH₂O.

2. Inkubacja próbek i ekstrakcja DNA

W przypadku inkubacji DNA-SIP próbki są zazwyczaj inkubowane z substratem zawierającym ciężki izotop węgla (¹³C). Okresy i warunki inkubacji (np. suplementacja składnikami odżywczymi, wilgotność, światło) różnią się w zależności od rodzaju inkubowanej próbki oraz charakteru substratu. Eksperymenty DNA-SIP zostały z sukcesem przeprowadzone z użyciem różnych jednoatomowych związków węgla ^2,3, wieloatomowych związków węgla ^4,5,6 oraz z użyciem znakowanego azotu ^7,8 lub tlenu ⁹. Wadą stosowania związków znakowanych ¹⁵N lub ¹⁸O jest jednak mniejsza separacja fizyczna znakowanych kwasów nukleinowych, co wynika przede wszystkim z mniejszej liczby atomów azotu i tlenu w DNA i RNA w stosunku do atomów węgla.

Kluczową kontrolą w eksperymentach DNA-SIP jest analogiczna inkubacja przeprowadzona z podłożem naturalnym (np. ¹²C). Inkubacja ta umożliwia późniejsze porównanie w celu upewnienia się, że wszelkie widoczne znakowanie kwasów nukleinowych nie było artefaktem ultrawirowania ani wynikiem różnic w gęstości wynikających z zawartości G+C w DNA, które mogłyby wpłynąć na rozdział ¹⁰. Ważne jest również zachowanie zamrożonego materiału z próbki do porównania z DNA „lekkim” i „ciężkim”, a także warto uwzględnić kontrolę bez podłoża, aby ocenić tło zmian w populacji podczas inkubacji SIP.

1. Inkubować próbki środowiskowe w mikrokosmosach zawierających znakowane podłoże (Rycina 1). Z naszego doświadczenia wynika, że minimalna inkorporacja od 5-500 μmol węgla ¹³C na gram próbki będzie odpowiednia dla próbek o wysokiej biomasie, takich jak próbki gleby ¹. W przypadku próbek wodnych, które zawierają mniejszą biomasę niż gleby, 1-100 μmol inkorporowanego węgla ¹³C na litr może przynieść wykrywalny sygnał ciężkiego izotopu ¹. Ilość dodanego węgla, proporcja węgla wbudowanego w biomasę oraz zapotrzebowanie na dodatkowe składniki odżywcze dla asymilacji będą zależeć od charakterystyki analizowanych próbek i docelowych organizmów. Pojedynczy zestaw wytycznych dotyczących inkubacji próbek nie będzie miał zastosowania do wszystkich próbek. Co ważne, stężenie podłoża stosowane podczas inkubacji SIP powinno być idealnie jak najbliższe stężeniu występującemu normalnie in situ; błąd eksperymentalny może być konsekwencją warunków hodowli wzbogaconej ¹⁰.
2. Po inkubacji próbki z podłożem znakowanym izotopem stabilnym, wyekstrahować DNA z mikrokosmosów, stosując rygorystyczny protokół ekstrakcji (do PCR lub klonowania małych insertów) lub sprawdzoną lizę enzymatyczną w przypadku klonowania wysokocząsteczkowego (np. metagenomiki dużych insertów). Koekstrakcja RNA zazwyczaj nie wpływa na analizę, zatem można stosować protokoły, które pozyskują zarówno RNA, jak i DNA. Ultrawirowanie wyekstrahowanego DNA nie spowoduje rozrywania fragmentów krótszych niż ~50 kb par ¹.
3. Oznaczyć ilość wyekstrahowanego DNA przed przygotowaniem probówek do ultrawirowania w gradiencie CsCl. Ilość DNA oznaczyć za pomocą spektrofotometru (np. Nanodrop 2000), jeśli protokół ekstrakcji daje wyłącznie DNA (np. zestawy kolumienkowe). Alternatywnie można zastosować elektroforezę w żelu agarozowym.

3. Przygotowanie roztworów gradientowych do ultrawirowania

Niniejsza procedura polega na wprowadzaniu DNA do probówek do ultrawirówki. Istnieje wiele rodzajów probówek i rotorów, dlatego dokładny protokół może się różnić i zależy od instrukcji producenta. Niemniej jednak zalecamy stosowanie rotora z pionowymi otworami, aby zapewnić maksymalnie możliwą separację lekkiego i ciężkiego DNA. W naszej pracy wykorzystujemy rotor Beckman-Coulter Vti 65.2 z 16 otworami, przeznaczony do probówek QuickSeal Polyallomer o pojemności 5,1 ml; protokół zawiera kroki oraz uwagi dostosowane do tych warunków.

1. Wykorzystując stężenia DNA określone w kroku 2.3, oblicz objętość wyekstrahowanego DNA niezbędną do uzyskania od 0,5 μg do 5 μg DNA w probówkach do ultrawirówki.
2. Połącz wyekstrahowane DNA (0,5 - 5 μg) z buforem gradientowym (patrz krok 1.3) oraz 4,8 ml 7,163 M CsCl do łącznej objętości ok. 6 ml w sterylnej jednorazowej probówce 15-ml. Należy pamiętać, że gęstość roztworu CsCl może się różnić nawet przy tej samej molarności (patrz krok 1.1). Do wyznaczenia objętości mieszaniny buforu gradientowego/DNA wymaganej do uzyskania odpowiedniego stosunku mieszania można zastosować następujące równanie:
   
   Objętość buforu gradientowego i roztworu DNA (ml) = (gęstość roztworu stokowego CsCl - pożądana gęstość końcowa) x objętość dodanego roztworu stokowego CsCl x 1,52
   
   Przyjmij objętość roztworu stokowego CsCl wynoszącą 4,80 ml. Pożądana gęstość końcowa powinna wynosić 1,725 g ml^-1. Gęstość roztworu stokowego została określona w kroku 1.1.
   
   Należy również zauważyć, że względne objętości CsCl i buforu gradientowego/DNA spowodują uzyskanie łącznej objętości większej niż 5,1 ml. Przygotowanie objętości przekraczającej maksymalną pojemność probówek do ultrawirówki (powyżej 5,1 ml) zapewni ilość roztworu wystarczającą do całkowitego wypełnienia probówki.
3. Wymieszaj poprzez 10-krotne odwrócenie probówki. DNA jest stabilne w temperaturze pokojowej w CsCl.

4. Tworzenie gradientu kontrolnego EtBr (opcjonalnie)

Ponieważ EtBr jest barwnikiem interkalującym, który tworzy kompleksy z DNA, czyniąc je widocznym w świetle UV, gradienty kontrolne zawierające EtBr są pomocne, gdyż zapewniają natychmiastowe wizualne potwierdzenie utworzenia gradientu przed frakcjonowaniem probówek z próbkami (np. Rysunek 1). Dołączenie probówki kontrolnej zawierającej EtBr oraz mieszaninę DNA ¹²C i DNA ¹³C (lub DNA ¹⁴N i DNA ¹⁵N) umożliwia natychmiastową wizualizację powstania prążków w probówkach po zakończeniu ultrawirowania. Jest to istotne, ponieważ pęknięta probówka podczas ultrawirowania lub nieprawidłowo zaprogramowane warunki wirowania mogą doprowadzić do niepowodzenia w utworzeniu gradientu. Wiążąc się z DNA, EtBr obniża jego gęstość, w związku z czym do przygotowania gradientów stosuje się inny protokół. Należy zauważyć, że zamiast EtBr można użyć innych barwników do kwasów nukleinowych ¹¹, jednak protokół ten będzie wymagał optymalizacji w przypadku innych fluoroforów.

1. Gradient kontrolny wymaga dwóch objętości DNA genomowego: jednej w pełni znakowanej izotopem stabilnym i jednej nieznakowanej. Jako kontrole zazwyczaj stosujemy Sinorhizobium meliloti hodowane w pożywkach zawierających glukozę ¹³C lub ¹²C jako jedyne źródło węgla lub szczep Bath Methylococcus capsulatus hodowany w obecności metanu ¹³C lub ¹²C.
2. W jednorazowej probówce z zakrętką o pojemności 15 ml połącz ilość 5-10 μg zarówno ¹²C-DNA, jak i ¹³C-DNA z buforem do gradientu (Gradient Buffer) do uzyskania końcowej objętości 1.00 ml.
3. Do tej samej probówki dodaj 1.00 g stałego CsCl. Wymieszaj przez odwracanie.
4. Do tej samej probówki z zakrętką użytej w kroku 4.2 dodaj 110 μl roztworu EtBr o stężeniu 10 mg ml^-1 oraz 4.3 ml roztworu stokowego CsCl o stężeniu 1 g ml^-1. Końcowa gęstość roztworu będzie zbliżona do gęstości oryginalnego roztworu stokowego CsCl.
5. Wymagany będzie również dodatkowy „ślepy” roztwór kontrolny zawierający EtBr, aby zrównoważyć roztwór przygotowany w kroku 4.4. W osobnej probówce z zakrętką o pojemności 15 ml połącz 1.00 mL buforu do gradientu (Gradient Buffer), 1.00 g CsCl, 110 μl roztworu EtBr o stężeniu 10 mg ml^-1 oraz 4.3 ml roztworu stokowego CsCl o stężeniu 1 g ml^-1 i wymieszaj przez odwracanie.

5. Ultracentryfugacja

1. Za pomocą gruszki i pipety Pasteura ostrożnie napełnić probówki do ultrawirówki roztworami gradientowymi przygotowanymi w kroku 3.2 (lub w krokach 4.4 w przypadku przygotowania gradientu kontrolnego z EtBr). Roztwory należy ostrożnie nanosić do probówek pipetą Pasteura. Probówki należy opisać na ramieniu cienkim markerem permanentnym. UWAGA: Należy upewnić się, że probówki są napełnione dokładnie do podstawy szyjki. Niedopełnione probówki mogą pęknąć podczas ultrawirowania.
2. Po napełnieniu wszystkich wymaganych probówek roztworami próbek, należy zapisać dokładną masę każdej z nich. Probówki należy dobrać w pary i zrównoważyć z dokładnością do 0-10 mg. W celu zrównoważenia należy znaleźć pary o niemal identycznej masie i dodawać lub usuwać minimalne ilości roztworu, aż zostaną one zrównoważone, utrzymując poziom cieczy jak najbliżej podstawy szyjek probówek. Należy pamiętać, że do ważenia probówek jako uchwytu na wadze stosujemy odwróconą probówkę 15-ml z nakrętką, przeciętą na pół.
3. Probówki należy uszczelnić za pomocą zatyczek typu „tube topper” zgodnie z instrukcjami producenta.
4. Należy sprawdzić poprawność uszczelnienia probówek, odwracając je i wywierając umiarkowany nacisk. Probówki należy ponownie zważyć, aby upewnić się, że po uszczelnieniu nadal są zrównoważone z dokładnością do 0-10 mg.
5. Należy dokładnie sprawdzić każde gniazdo rotora, aby upewnić się, że są one czyste i wolne od zanieczyszczeń lub kurzu, które mogłyby przebić probówki podczas ultrawirowania.
6. Probówki należy umieścić w rotorze tak, aby zrównoważone pary znajdowały się naprzeciw siebie. Należy zapisać położenie każdej próbki w rotorze, ponieważ proces ultrawirowania może spowodować uszkodzenie lub starcie oznaczeń markerem. Gniazda rotora należy ostrożnie uszczelnić zgodnie z zaleceniami producenta.
7. Rotor należy umieścić w ultrawirowce. Następnie należy zamknąć drzwiczki ultrawirowki i wytworzyć próżnię. W przypadku użycia rotora Vti 65.2 należy ustawić prędkość obrotową na 44,100 rpm (~177,000 x g_av), temperaturę na 20°C oraz czas ultrawirowania na 36-40 godzin. Należy wybrać tryb próżni, maksymalne przyspieszenie i wyłączyć hamulec (zapobiega to zaburzeniu gradientu podczas zwalniania). Należy pamiętać, że wyłączenie hamulca wydłuży czas pracy o dodatkowe 1-2 godziny. Należy również zauważyć, że krótszy czas wirowania może nie zapewnić wystarczającej rozdzielczości prążków. Zaleca się długie cykle ultrawirowania, ponieważ prowadzą one do lepszej rozdzielczości poszczególnych prążków kwasów nukleinowych.
8. Niezwłocznie po zakończeniu procedury ultrawirowania należy ostrożnie wyjąć rotor. Unikając przechylania lub uderzania rotorem, należy delikatnie wyjąć z niego probówki, aby nie zakłócić gradientów w ich wnętrzu. W rzadkich przypadkach probówka może pęknąć podczas wirowania. Jeśli tak się stanie, istnieje ryzyko, że gradienty w pozostałych probówkach nie uformowały się prawidłowo. Jeśli zastosowano gradient kontrolny, należy dokładnie sprawdzić tę probówkę w świetle UV, aby potwierdzić utworzenie gradientu. Jeśli gradient w probówce kontrolnej nie uformował się prawidłowo, najlepiej powtórzyć cały krok 5. Należy pamiętać, że probówka kontrolna z EtBr oraz jej kontrola ujemna mogą być przechowywane w ciemności i ponownie wykorzystane przez okres do sześciu miesięcy. Po usunięciu pękniętej probówki należy starannie oczyścić rotor zgodnie z instrukcjami producenta. Aby uniknąć zarysowań gniazd rotora, nie należy używać szczotek metalowych ani środków czyszczących o działaniu ściernym! Szczotki dedykowane do konkretnych rotorów oraz roztwory czyszczące można nabyć od firmy Beckman.

6. Frakcjonowanie gradientowe

Obecnie stosuje się dwie metody odzyskiwania DNA z probówek do ultrawirówki: frakcjonowanie oraz ekstrakcję igłą. Niniejszy protokół opisuje jedynie proces ekstrakcji DNA z wykorzystaniem techniki frakcjonowania. Wynika to z faktu, że w większości eksperymentów SIP znakowanego DNA nie można zwizualizować za pomocą EtBr, lecz należy je wykryć poprzez porównanie równoważnych frakcji lekkich i ciężkich z wielu probówek z próbkami. Do pobierania frakcji gradientu gęstości o tej samej objętości z probówek do ultrawirówki wysoce zaleca się stosowanie pompy strzykawkowej. W naszej pracy używamy pompy infuzyjnej modelu BSP (Braintree Scientific Inc.). Można również zastosować perystaltyczną pompę niskoprzepływową lub pompę HPLC.

1. Napełnij sterylną strzykawkę o pojemności 60 ml sterylną wodą ddH₂O zawierającą wystarczającą ilość barwnika błękitu bromofenolowego, aby uzyskać ciemnoniebieski kolor. Umieść strzykawkę na ramieniu załadunkowym pompy strzykawkowej. Podłącz dren pompy wyposażony w igłę 23G o długości 1" i włącz pompę, aż woda ddH₂O wypłynie z końcówki igły. Należy pamiętać, że wszelkie pęcherzyki powietrza w tym zapasie ddH₂O negatywnie wpłyną na proces frakcjonowania.
2. Przymocuj jedną z probówek do ultrawirówki do statywu z zaciskiem. Upewnij się, że zacisk jest wystarczająco mocny, aby zapobiec przemieszczeniu probówki, ale nie na tyle, aby nacisk na probówkę spowodował wyciek roztworu CsCl po jej przebiciu. Przebij sam dół probówki wzdłuż szwu, używając nowej igły 23G o długości 1". Aby uzyskać najlepsze wyniki, przebij probówkę w sposób kontrolowany, szybki i zdecydowany. Wykonanie tego zadania poprawnie jest bardzo trudne; należy przećwiczyć tę czynność kilka razy, zanim zostanie ona po raz pierwszy wykonana na probówkach z próbkami.
3. Dla każdej próbki przygotuj 12 sterylnych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml z etykietami wskazującymi numer próbki i frakcję (1-12; od ciężkiej do lekkiej). Używając igły podłączonej do drenu pompy (krok 6.1), przebij górną część probówki na górnym ramieniu probówki, wzdłuż szwu. Zbieraj roztwór gradientu do probówek do mikrocentryfugi. Podobnie jak w przypadku dna probówki, przebij ją w sposób szybki i kontrolowany. Przećwicz to wcześniej i zachowaj szczególną ostrożność, stosując kontrolowany ruch ciągnący, aby zapobiec przejściu wbitej igły przez probówkę i w palec! Użyj wcześniej skalibrowanego przepływu pompy, który pozwoli na uzyskanie 12 frakcji po 425 μl w ciągu 12 minut (425 μl min^-1).
4. Użyj cyfrowego refraktometru (np. Reichert AR200; zalecany) lub wagi analitycznej, aby sprawdzić gęstość frakcji z jednego gradientu w celu potwierdzenia prawidłowego utworzenia gradientu. Do tego testu będziesz potrzebować ~50 μl próbki. Często umieszczamy DNA z czystej kultury w jednej probówce (jak opisano przy przygotowywaniu gradientów kontrolnych z EtBr), aby służyło ono jako kontrola frakcjonowania i wykorzystujemy je do oznaczenia gęstości. Przewidywane wartości gęstości mieszczą się w zakresie ~1.690-1.760 g ml^-1, z gęstością średnią wynoszącą ~1.725 g ml^-1.

7. Wytrącanie DNA

1. Wytrąć DNA ze wszystkich frakcji, dodając najpierw 20 μg liniowego poliakryloamidu jako nośnika precypitacji. Wymieszaj poprzez odwracanie probówek. Dodaj 2 objętości roztworu PEG (patrz krok 1) i wymieszaj poprzez odwracanie probówek. Należy pamiętać, że zastosowanie nośnika precypitacji (np. glikogenu lub liniowego poliakryloamidu) jest kluczowe dla ilościowego odzyskania DNA z frakcji gradientu, jednak w przypadku stosowania glikogenu jako nośnika w tym protokole należy zachować ostrożność. Wykazano, że preparaty glikogenu mogą być zanieczyszczone bakteryjnymi kwasami nukleinowymi, co może łatwo prowadzić do błędnej interpretacji frakcji gradientu SIP ¹².
2. Pozostaw probówki w temperaturze pokojowej na 2 godziny, aby umożliwić wytrącenie DNA. W razie potrzeby probówki można pozostawić w temperaturze pokojowej na noc.
3. Wiruj przy 13,000 g przez 30 minut, umieszczając probówki w rotorze tyłem na zewnątrz, aby zapewnić jednolitą orientację. Ostrożnie odciągnij i usuń nadsącz. Osad powinien być widoczny, choć na tym etapie może być bardzo trudny do dostrzeżenia. Pracuj pod silnym źródłem światła (np. lampką biurkową), aby ułatwić wizualizację osadu.
4. Przemyj osad 500 μl 70% etanolu. Wiruj przy 13,000 g przez 10 minut. Ostrożnie odciągnij i usuń nadsącz. Na tym etapie osad jest zazwyczaj bardziej widoczny, ale łatwiej oddziela się od ścianki probówki.
5. Pozostaw osad do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
6. Resuspenduj każdy osad w 50 μl buforu TE (patrz krok 1.5). Nałóż 5 μl każdej frakcji na żel agarozowy zgodnie ze standardowymi protokołami laboratoryjnymi.

8. Charakterystyka frakcji

Metoda stosowana do charakterystyki frakcji gradientu w celu oceny powodzenia inkubacji SIP będzie różnić się w zależności od laboratorium i dostępności sprzętu. Powszechnym podejściem jest zastosowanie metody fingerprintingu ukierunkowanego na gen 16S rRNA; odpowiednie są w tym celu metody takie jak polimorfizm długości końcowych fragmentów restrykcyjnych (T-RFLP) lub elektroforeza w żelu z denaturującym gradientem (DGGE) (Rycina 1). Postępując zgodnie z opisanym powyżej protokołem, należy spodziewać się, że lekkie DNA będzie powiązane z frakcjami 9-11 (~1.705-1.720 g ml^-1), a fingerprinty ciężkiego DNA będą występować w frakcjach 5-8 (~1.720-1.735 g ml^-1). Unikalne fingerprinty związane z frakcjami 5-8 próbek inkubowanych z izotopem stabilnym, których nie stwierdzono w kontrolach inkubowanych z podłożem natywnym, stanowią silny dowód łączący konkretne organizmy z metabolizmem danego znakowanego podłoża. Jeśli w przypadku niektórych zastosowań (hybrydyzacja, metagenomika) pozostanie niewystarczająca ilość znakowanego DNA, można zastosować amplifikację z wielokrotnym wypieraniem (MDA) w celu uzyskania większych ilości ^13-15, jednak może to wprowadzić chimery do amplifikowanego DNA ^14,16.

9. Wyniki

Typowe wyniki DNA-SIP wykażą rozdzielenie znakowanego i nieznakowanego DNA w gradiencie utworzonym w procesie ultrawirowania. W idealnym przypadku zostanie osiągnięta całkowita rozdzielczość materiału genetycznego o wysokiej masie cząsteczkowej (np. ¹³C, ¹⁵N) od materiałów nieznakowanych. Rozdzielczość można stwierdzić wizualnie, obserwując formowanie się prążków w probówkach kontrolnych z EtBr. Do potwierdzenia prawidłowego utworzenia gradientu można również wykorzystać stężenia odzyskanego DNA genomowego zawarte w poszczególnych frakcjach gradientu.

W ramach niniejszego protokołu przedstawiamy reprezentatywne wyniki ultrawirowania w gradiencie gęstości przeprowadzonego z wykorzystaniem kwasów nukleinowych z dwóch czystych kultur (Rysunek 2). Przedstawiony tutaj gradient frakcjonowany został przygotowany przy użyciu genomicznego DNA wyekstrahowanego z S. meliloti (ATCC 1021) oraz ¹³C-znakowanego M. capsulatus str. Bath. Po ultrawirowaniu, frakcjonowaniu i odzyskaniu DNA, znakowane i nieznakowane genomiczne DNA rozdzielają się do odpowiednich frakcji gradientu o różnych gęstościach (Rysunek 2A). DNA znakowane ciężkim izotopem można zaobserwować w frakcjach 4-5, natomiast DNA nieznakowane występuje w wysokich stężeniach w frakcjach 9-10. DNA z każdej frakcji scharakteryzowano za pomocą denaturującej elektroforezy w gradiencie żelowym ¹⁷, a produkty amplifikacji PCR utworzyły wyraźne wzory prążków odpowiadające dwóm organizmom zawartym w gradiencie (Rysunek 2B). Gęstość frakcji mieściła się w zakresie ~1.580 - 1.759 g ml^-1 i są one przedstawione w kolejności malejącej gęstości od lewej do prawej.

Chociaż rozdział czystego DNA z ¹³C i ¹²C może być wyraźny (Rycina 2), interpretacja inkubacji próbek środowiskowych może być trudniejsza. Na przykład inkubowaliśmy gleby tundry z Resolute Bay (Nunavut, Kanada) z glukozą znakowaną ¹²C lub ¹³C przez okres 14 dni w temperaturze 15°C. Żele agarozowe oczyszczonego DNA z frakcji gradientu wykazały, że DNA genomiczne było „rozmyte” w frakcjach 7-10 zarówno dla inkubacji z ¹²C, jak i ¹³C (odpowiednio Rycina 3A i 3C). W takim przypadku wzbogacenie w ¹³C biomasy konkretnych taksonów mikrobiologicznych można określić jedynie za pomocą metody takiej jak DGGE genów 16S rRNA. DNA z gleby inkubowanej z glukozą ¹²C generuje podobne wzory we wszystkich frakcjach gradientu (Rycina 3B), natomiast próbka inkubowana z glukozą ¹³C wygenerowała odciski DGGE, które są jednoznacznie powiązane z frakcjami 5-8 (Rycina 3D). Szczególnie interesujące są zachowane prążki wskazane strzałkami. Ten dominujący „filotyp” jest spójny we wszystkich frakcjach gradientu, ale przesuwa się w stronę cięższych frakcji w przypadku DNA uzyskanego z gleby inkubowanej z glukozą ¹³C. Następne sekwencjonowanie DNA tego prążka i/lub analiza biblioteki klonalnej potwierdziłyby tożsamość tego konkretnego genu 16S rRNA i wskazały kierunek dalszych podejść metagenomicznych lub opartych na hodowli.

Rycina 1. Schemat eksperymentu DNA-SIP obejmujący inkubację próbek, ekstrakcję DNA, ultrawirowanie w gradiencie gęstości CsCl oraz charakterystykę DNA za pomocą technik molekularnych.

Rycina 2. Oczekiwane wyniki frakcjonowania gradientowego SIP zawierającego DNA z dwóch czystych kultur. (A) Alikwoty DNA z frakcji gradientu 1-12 rozdzielono na 1% żelu agarozy z gradientu zawierającego znakomiony ¹³C szczep Bath M. capsulatus (frakcje 4-6) oraz znakomiony ¹²C S. meliloti (frakcje 8-10). Do porównania dołączono drabinkę 1-kb. (B) DNA powielone metodą PCR z tych samych frakcji rozdzielono na 10% żelu DGGE. Wzory odcisków palców wykazują wyraźne różnice, na przykład między frakcjami 5 i 9.

Rycina 3. Oczekiwane wyniki frakcjonowania gradientowego SIP z inkubacji próbek gleby. Alikwoty frakcji gradientu z gleby wzbogaconej w glukozę ¹²C (A) oraz gleby wzbogaconej w glukozę ¹³C (C) naniesiono na żele agarozowe 1%, a do porównania dołączono drabinę 1-kb. Odpowiadające im odciski palców DGGE dla każdej z tych próbek przedstawiono w (B) i (D). Analiza odcisków palców frakcji ujawnia wzbogacenie konkretnych taksonów bakteryjnych w próbce wzbogaconej w glukozę ¹³C we frakcjach 5-8 (D).

Dyskusja

Właściwe zaprojektowanie eksperymentów z wykorzystaniem analizy znakowania stabilnymi izotopami (SIP) ma krytyczne znaczenie dla uzyskania znakowanego DNA powyżej poziomu tła nieznakowanej społeczności. Kwestie związane z czasem inkubacji próbek, stężeniami substratów, warunkami inkubacji (np. składnikami odżywczymi, wilgotnością gleby), zjawiskiem cross-feedingu oraz powtórzeniami zostały omówione w innych opracowaniach ^10,18, dlatego zalecamy czytelnikom zapoznanie się z tymi publikacjami podczas projektowan...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Błękit bromofenolowy	Odczynnik	Fisher Scientific	BP115-25
Chlorek cezu	Odczynnik	Fisher Scientific	BP210-500
Ethanol, cz.d.a.	Odczynnik	Sigma-Aldrich	652261
Bro מקid etylowy	Odczynnik	Sigma-Aldrich	E1510
Kwas solny	Odczynnik	Fisher Scientific	351285212
Liniowa poliakrylanamid	Odczynnik	Applichem	A6587
Glikol polietylenowy 6000	Odczynnik	VWR international	CAPX1286L-4
Chlorek potasu	Odczynnik	Fisher Scientific	AC42409-0010
Chlorek sodu	Odczynnik	Fisher Scientific	S2711
Wodorotlenek sodu w granulkach	Odczynnik	Fisher Scientific	S3181
Tris (zasada)	Odczynnik	Fisher Scientific	BP1521
Dark Reader	Urządzenie	Clare Chemical	DR46B
Mikrowirówka	Urządzenie	Eppendorf	5424 000.410
Nanodrop 2000	Urządzenie	Fisher Scientific	361013650
Pompa infuzyjna	Urządzenie	Braintree Scientific, Inc.	N/A	Numer modelu: BSP Szczegóły zamówienia dostępne na stronie www.braintreesci.com.
Zgrzewarka do probówek	Urządzenie	Beckman Coulter Inc.	358312
Ultrawirówka	Urządzenie	Beckman Coulter Inc.
Rotor do ultrawirówki	Urządzenie	Beckman Coulter Inc.	362754
Źródło światła ultrafioletowego	Urządzenie	UVP Inc.	95-0017-09	Wystarczy dowolne źródło UV
Przyłbica ochronna UV	Urządzenie	Fisher Scientific	114051C
Zatworki z gumy butylowej, szare	Materiał	Sigma-Aldrich	27232
Probówki do wirowania	Materiał	Beckman Coulter Inc.	342412
Igła hipodermiczna, 23 G, długość 2”	Materiał	BD Biosciences	305145
Probówki do mikrowirówki, 1,5 mL	Materiał	DiaMed	AD151-N500
Uszczelki z otworem centralnym, średnica 20 mm	Materiał	Sigma-Aldrich	27230-U
Pipety Pasteura, szklane	Materiał	Fisher Scientific	13-678-6C
Kapturki do pipet	Materiał	DiaMed	BPS340-1000	Numer katalogowy dotyczy kapturków 200 μl. Kapturki 10 lub 20 μl można nabyć u tego samego dostawcy
Przewód pompy, otwór 1,5 mm x ścianka 1,5 mm	Materiał	Appleton Woods
Probówki z nakrętką, 15 mL	Materiał	DiaMed	AD15MLP-S
Fiolki do surowicy, objętość 125 mL	Materiał	Sigma-Aldrich	Z114014
Strzykawka, 60 mL	Materiał	BD Biosciences	309653