Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza stabilnych izotopów w DNA (DNA-SIP)

44.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2027

⸱

2 sierpnia 2010

 , 
1Department of Biology, University of Waterloo

W tym artykule

Podsumowanie

Metoda znakowania stabilnymi izotopami DNA (DNA stable-isotope probing) jest metodą niezależną od hodowli, służącą do identyfikacji i charakterystyki aktywnych społeczności mikroorganizmów zdolnych do wykorzystania określonych substratów. Asymilacja substratu wzbogaconego w ciężki izotop prowadzi do wbudowania znakowanych atomów w biomasę mikrobiologiczną. Ultracentryfugacja w gradiencie gęstości pozwala na odzyskanie znakowanego DNA do dalszych analiz molekularnych.

Streszczenie

Sondowanie stabilnymi izotopami DNA (DNA-SIP) jest potężną techniką służącą do identyfikacji aktywnych mikroorganizmów, które asymilują określone substraty węglowe i składniki odżywcze do biomasy komórkowej. Jako taka, ta niezależna od hodowli technika stanowi ważną metodologię przypisywania funkcji metabolicznych zróżnicowanym społecznościom zamieszkującym szeroki zakres środowisk lądowych i wodnych. Po inkubacji próbki środowiskowej ze związkami znakowanymi stabilnymi izotopami, wyekstrahowany kwas nukleinowy poddawany jest ultrawirowaniu w gradiencie gęstości, a następnie frakcjonowaniu gradientu w celu oddzielenia kwasów nukleinowych o różnych gęstościach. Oczyszczanie DNA z chlorku cezu pozwala na odzyskanie DNA znakowanego i nieznakowanego do późniejszej charakterystyki molekularnej (np. fingerprintingu, mikromacierzy, bibliotek klonów, metagenomiki). Niniejszy protokół wideo JoVE zapewnia wizualne, krokowe wyjaśnienia procedury ultrawirowania w gradiencie gęstości, frakcjonowania gradientu i odzyskiwania znakowanego DNA. Protokół zawiera również przykładowe dane SIP oraz podkreśla ważne wskazówki i ostrzeżenia, które należy wziąć pod uwagę, aby zapewnić pomyślną analizę DNA-SIP.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników

Metoda DNA-SIP wymaga użycia odczynników, które należy przygotować przed przystąpieniem do właściwej procedury. Instrukcje przygotowania każdego z odczynników są wymienione w tej sekcji i stanowią modyfikację wcześniejszego protokołu SIP1.

  1. Roztwór chlorku cezu (CsCl) do przygotowywania gradientów SIP - Przygotować 7,163 M roztwór CsCl poprzez stopniowe rozpuszczanie 603,0 g CsCl w wodzie destylowanej i dejonizowanej (ddH2O) do końcowej objętości 500 mL. Należy uważać, aby nie przekroczyć 500 mL! Lekkie podgrzanie roztworu podczas mieszania ułatwi rozpuszczenie całego CsCl. Rozdzielić końcowy roztwór na szczelne alikwoty. W naszym laboratorium powszechną praktyką przechowywania jest przygotowywanie alikwotów 100 mL w fiolkach do surowicy o pojemności 125 mL, które następnie zamyka się poprzez zaciskanie korków z gumy butylowej. Szczelne alikwoty można przechowywać w nieskończoność w temperaturze pokojowej (20°C). Uszczelnienia pomagają zapobiec parowaniu i tworzeniu się „skorupy” CsCl. Gęstość roztworu należy określić poprzez zważenie trzech alikwotów po 100 µL lub przy użyciu cyfrowego refraktometru (np. Reichert AR200), który został starannie skalibrowany dla roztworów CsCl. Po pomyślnej kalibracji urządzenie Reichert AR200 działa stabilnie i zapewnia dokładne odczyty przez kilka lat. W temperaturze pokojowej (20°C) końcowa gęstość tego roztworu zazwyczaj mieści się w zakresie 1,88-1,89 g ml-1. Gęstość nieznacznie różni się przy każdym przygotowaniu nowej partii zapasu.
  2. Roztwór chlorku cezu do przygotowywania gradientów z bromkiem etydyny (EtBr) - Połączyć 250 g CsCl z 250 mL sterylnej wody ddH2O. Rozdzielić ten roztwór do osobnych fiolek do surowicy, które zostały zamknięte poprzez zaciskanie korków z gumy butylowej, zgodnie z opisem w punkcie 1.1.
  3. Bufor do gradientu - Połączyć 50 ml 1 M Tris-HCl, 3,75 g KCl i 1 ml 0,5 M EDTA z 400 ml wody. Rozpuścić KCl, a następnie dodać ddH2O do objętości 500 ml. Zsterylizować przez filtrację i autoklawować. Końcowy roztwór to 0,1 M Tris, 0,1 M KCl i 1 mM EDTA.
  4. Roztwór glikolu polietylenowego (PEG) - Przygotować roztwór PEG poprzez rozpuszczenie 150 g glikolu polietylenowego 6000 i 46,8 g NaCl w sterylnej wodzie ddH2O do całkowitej objętości 500 mL (30% PEG, 1,6 M NaCl). Autoklawować.
    Uwaga: Roztwór ten rozdziela się na dwie fazy podczas autoklawowania. Należy umieścić mieszadło magnetyczne w autoklawowanej butelce, aby roztwór można było odpowiednio wymieszać, gdy to nastąpi.
  5. Bufor TE - Przygotować roztwór 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) i 1 mM EDTA (pH 8,0) w sterylnej wodzie ddH2O, używając autoklawowanych roztworów zapasowych 1 M Tris-HCl (pH 8,0) i 0,5 M EDTA (pH 8,0). Zsterylizować przez filtrację i autoklawować.
  6. 70% Etanol - Połączyć 350 ml etanolu o wysokiej czystości z 150 ml sterylnej wody ddH2O.

2. Inkubacja próbek i ekstrakcja DNA

W przypadku inkubacji DNA-SIP próbki są zazwyczaj inkubowane z podłożem zawierającym ciężki izotop węgla (13C). Okresy i warunki inkubacji (np. suplementacja składnikami odżywczymi, wilgotność, światło) różnią się w zależności od rodzaju inkubowanej próbki oraz charakteru podłoża. Eksperymenty DNA-SIP były z sukcesem przeprowadzane z użyciem różnych związków jednowęglowych 2,3, związków wielowęglowych 4,5,6 oraz z wykorzystaniem znakowanego azotu 7,8 lub tlenu 9. Wadą stosowania związków znakowanych 15N lub 18O jest jednak mniejsza separacja fizyczna znakowanych kwasów nukleinowych, co wynika przede wszystkim z mniejszej liczby atomów azotu i tlenu w DNA i RNA w porównaniu do atomów węgla.

Krytyczną kontrolą w eksperymentach DNA-SIP jest identyczna inkubacja przeprowadzona z natywnym substratem (np. 12C). Inkubacja ta umożliwia późniejsze porównanie, aby upewnić się, że jakiekolwiek pozorne znakowanie kwasów nukleinowych nie było artefaktem ultrawirowania ani wynikiem różnic w gęstości wynikających z zawartości G+C w DNA, które mogłyby wpłynąć na separację 10. Ważne jest również zachowanie zamrożonego materiału z próbki do porównania z DNA „lekkim” i „ciężkim”; warto również uwzględnić kontrolę bez substratu, aby ocenić tła zmian w populacji podczas inkubacji SIP.

  1. Inkubować próbki środowiskowe w mikrokosmosach zawierających znakowane podłoże (Rysunek 1). Z naszego doświadczenia wynika, że minimalna inkorporacja od 5-500 μmol węgla 13C na gram próbki będzie odpowiednia dla próbek o wysokiej biomasie, takich jak próbki gleby 1. W przypadku próbek wodnych o mniejszej biomasie niż gleby, inkorporacja 1-100 μmol węgla 13C na litr może przynieść wykrywalną sygnaturę ciężkiego izotopu 1. Ilość dodawanego węgla, proporcja węgla wbudowanego w biomasę oraz potrzeba suplementacji składników odżywczych dla asymilacji będą zależeć od charakterystyki analizowanych próbek oraz docelowych organizmów. Pojedynczy zestaw wytycznych dotyczących inkubacji próbek nie będzie miał zastosowania do wszystkich materiałów. Co ważne, stężenie podłoża stosowane podczas inkubacji SIP powinno być idealnie jak najbliższe stężeniu spotykanemu in situ; błąd eksperymentalny może być konsekwencją warunków hodowli wzbogaconej 10.
  2. Po inkubacji próbki z podłożem znakowanym izotopem stabilnym, wyekstrahować DNA z mikrokosmosów, stosując rygorystyczny protokół ekstrakcji (dla PCR lub klonowania małych insertów) lub sprawdzoną lizę enzymatyczną dla klonowania wysokocząsteczkowego (np. metagenomika dużych insertów). Koekstrakcja RNA zazwyczaj nie wpływa na analizę, dlatego można stosować protokoły, które dają zarówno RNA, jak i DNA. Ultrawirowanie wyekstrahowanego DNA nie spowoduje fragmentacji fragmentów krótszych niż ~50 kb par 1.
  3. Ilościowo określić zawartość wyekstrahowanego DNA przed przygotowaniem probówek do ultrawirowania w gradiencie CsCl. Oznaczenie ilości DNA przeprowadzić za pomocą spektrofotometru (np. Nanodrop 2000), jeśli protokół ekstrakcji daje tylko DNA (np. zestawy kolumienkowe). Alternatywnie, ilość DNA można określić za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.

3. Przygotowanie roztworów gradientowych do ultrawirowania

Procedura ta polega na wprowadzaniu DNA do probówek do ultrawirówki. Istnieje wiele rodzajów probówek i wirników, dlatego dokładny protokół będzie się różnić i zależeć od instrukcji producenta. Niemniej jednak zalecamy stosowanie wirnika z pionowymi otworami, aby zapewnić maksymalną możliwą separację lekkiego i ciężkiego DNA. Używamy wirnika Beckman-Coulter Vti 65.2 z 16 otworami przeznaczonymi dla probówek QuickSeal Polyallomer o pojemności 5,1 ml, a protokół przedstawia kroki i uwagi dotyczące tych warunków.

  1. Wykorzystując stężenia DNA określone w kroku 2.3, oblicz objętość wyekstrahowanego DNA niezbędną do dostarczenia od 0.5 μg do 5 μg DNA do probówek do ultrawirówki.
  2. Połącz wyekstrahowane DNA (0.5 - 5 μg) z buforem gradientowym (patrz krok 1.3) oraz 4.8 ml 7.163 M CsCl do całkowitej objętości ~6 ml w sterylnej jednorazowej probówce 15-ml. Należy pamiętać, że gęstość roztworu CsCl może się różnić nawet przy tej samej molarności (patrz krok 1.1). Do określenia objętości mieszaniny buforu gradientowego/DNA wymaganej do uzyskania odpowiedniego stosunku mieszania można użyć następującego równania:

    Objętość buforu gradientowego i roztworu DNA (ml) = (gęstość roztworu stokowego CsCl - pożądana gęstość końcowa) x objętość dodanego roztworu stokowego CsCl x 1.52

    Przyjmij objętość roztworu stokowego CsCl wynoszącą 4.80 ml. Pożądana gęstość końcowa powinna wynosić 1.725 g ml-1. Gęstość roztworu stokowego została określona w kroku 1.1.

    Należy również zauważyć, że względne objętości CsCl i buforu gradientowego/DNA spowodują uzyskanie łącznej objętości większej niż 5.1 ml. Przygotowanie objętości przekraczających maksymalną pojemność probówek do ultrawirówki (powyżej 5.1 ml) zapewni wystarczającą ilość roztworu do całkowitego wypełnienia probówki.
  3. Wymieszaj, odwracając probówkę 10 razy. DNA jest stabilne w temperaturze pokojowej w CsCl.

4. Tworzenie gradientu kontrolnego EtBr (opcjonalnie)

Ponieważ EtBr jest barwnikiem interkalującym, który tworzy kompleksy z DNA, czyniąc go widocznym w świetle UV, gradienty kontrolne zawierające EtBr są pomocne, gdyż zapewniają natychmiastowe wizualne potwierdzenie utworzenia gradientu przed frakcjonowaniem probówek z próbką (np. Rycina 1). Dołączenie probówki kontrolnej zawierającej EtBr oraz mieszaniny 12C-DNA i 13C-DNA (lub 14N-DNA i 15N-DNA) umożliwia natychmiastową wizualizację powstania prążków w probówkach po zakończeniu ultrawirowania. Jest to istotne, ponieważ pęknięcie probówki podczas ultrawirowania lub niewłaściwie zaprogramowane warunki pracy mogą doprowadzić do niepowodzenia w utworzeniu gradientu. EtBr związany z DNA obniża jego gęstość, w związku z czym do przygotowania gradientów stosuje się inny protokół. Należy zauważyć, że zamiast EtBr można użyć innych barwników do kwasów nukleinowych 11, jednak protokół będzie wymagał optymalizacji w przypadku innych fluoroforów.

  1. Gradient kontrolny wymaga dwóch objętości DNA genomowego: jednej w pełni znakowanej izotopem stabilnym i jednej nieznakowanej. Jako kontrole zazwyczaj stosujemy Sinorhizobium meliloti hodowane w pożywce zawierającej glukozę 13C- lub 12C- jako jedyne źródło węgla albo szczep Bath Methylococcus capsulatus hodowany w obecności metanu 13C- lub 12C-.
  2. Połączyć ilość 5-10 μg DNA 12C- oraz DNA 13C- z buforem do gradientu (Gradient Buffer) do końcowej objętości 1,00 ml w jednorazowej probówce 15-ml z nakrętką.
  3. Do tej samej probówki dodać 1,00 g stałego CsCl. Wymieszać przez odwracanie.
  4. Do tej samej probówki z nakrętką, użytej w kroku 4.2, dodać 110 μl roztworu EtBr o stężeniu 10 mg ml-1 oraz 4,3 ml roztworu stokowego CsCl o stężeniu 1 g ml-1. Końcowa gęstość roztworu będzie zbliżona do gęstości oryginalnego roztworu stokowego CsCl.
  5. Wymagany będzie również dodatkowy „ślepy” roztwór kontrolny zawierający EtBr, aby zrównoważyć roztwór przygotowany w kroku 4.4. Połączyć 1,00 mL buforu do gradientu (Gradient Buffer), 1,00 g CsCl, 110 μl roztworu EtBr o stężeniu 10 mg ml-1 oraz 4,3 ml roztworu stokowego CsCl o stężeniu 1 g ml-1 w oddzielnej probówce 15 ml z nakrętką i wymieszać przez odwracanie.

5. Ultracentryfugacja

  1. Za pomocą gruszki i pipety Pasteura ostrożnie napełnij probówki do ultrawirówki roztworami gradientowymi przygotowanymi w kroku 3.2 (lub w krokach 4.4 w przypadku przygotowania gradientu kontrolnego z EtBr). Roztwory należy precyzyjnie wprowadzać do probówek przy użyciu pipety Pasteura. Probówki należy opisać na ramieniu cienkopisem permanentnym. UWAGA: Należy upewnić się, że probówki są napełnione dokładnie do podstawy szyjki. Niedopełnione probówki mogą pęknąć podczas ultrawirowania.
  2. Po napełnieniu wszystkich wymaganych probówek roztworami próbek, zmierz dokładną masę każdej z nich. Dobierz probówki w pary i zrównoważ je z dokładnością do 0-10 mg. W celu zrównoważenia masy należy znaleźć pary o zbliżonej wadze i dodawać lub usuwać minimalne ilości roztworu, aż zostaną one zrównoważone, utrzymując poziom cieczy jak najbliżej podstawy szyjki probówki. Uwaga: do ważenia probówek używamy odwróconej probówki 15-ml z nakrętką, przeciętej na pół, która służy jako uchwyt na wadze.
  3. Uszczelnij probówki za pomocą zatyczek typu „tube topper” zgodnie z instrukcją producenta.
  4. Sprawdź szczelność probówek, odwracając je i wywierając umiarkowany nacisk. Zważ probówki ponownie, aby upewnić się, że po uszczelnieniu nadal są zrównoważone z dokładnością do 0-10 mg.
  5. Dokładnie sprawdź każde gniazdo rotora, aby upewnić się, że są one czyste i wolne od zanieczyszczeń lub kurzu, które mogłyby przebić probówki podczas ultrawirowania.
  6. Włóż probówki do rotora tak, aby zrównoważone pary znajdowały się naprzeciw siebie. Zapisz położenie każdej próbki w rotorze, ponieważ proces ultrawirowania może spowodować uszkodzenie lub starcie napisów. Ostrożnie zamknij gniazda rotora zgodnie z zaleceniami producenta.
  7. Załaduj rotor do ultrawirówki. Zamknij drzwiczki urządzenia i wytworzy próżnię. W przypadku użycia rotora Vti 65.2 ustaw prędkość obrotową na 44,100 rpm (~177,000 x gav), temperaturę na 20°C, a czas ultrawirowania na 36-40 godzin. Wybierz opcję próżni, maksymalne przyspieszenie i wyłącz hamulec (zapobiega to zaburzeniu gradientu podczas zwalniania). Należy pamiętać, że wyłączenie hamulca wydłuży czas pracy o dodatkowe 1-2 godziny. Należy również zauważyć, że krótszy czas wirowania może nie zapewnić wystarczającej rozdzielczości prążków. Zaleca się długi czas ultrawirowania, ponieważ prowadzi on do lepszej rozdzielczości wyraźnych prążków kwasów nukleinowych.
  8. Niezwłocznie po zakończeniu procedury ultrawirowania ostrożnie wyjmij rotor. Unikając przechylania lub uderzania rotorem, delikatnie wyjmij probówki, aby nie zakłócić gradientów w ich wnętrzu. W rzadkich przypadkach probówka może pęknąć podczas wirowania. Jeśli tak się stanie, istnieje ryzyko, że gradienty w pozostałych probówkach nie utworzyły się prawidłowo. Jeśli zastosowano gradient kontrolny, należy dokładnie sprawdzić tę probówkę w świetle UV, aby potwierdzić utworzenie gradientu. Jeśli gradient w probówce kontrolnej nie utworzył się prawidłowo, najlepiej powtórzyć cały krok 5. Należy pamiętać, że probówka kontrolna z EtBr oraz jej kontrola ujemna mogą być przechowywane w ciemności i ponownie wykorzystane przez okres do sześciu miesięcy. Po usunięciu pękniętej probówki należy starannie oczyścić rotor zgodnie z instrukcją producenta. Aby uniknąć zarysowań gniazd rotora, nie wolno używać metalowych szczotek ani środków ściernych! Szczotki dedykowane do konkretnych rotorów oraz roztwory czyszczące można nabyć od firmy Beckman.

6. Frakcjonowanie gradientowe

Obecnie stosuje się dwie metody odzyskiwania DNA z probówek do ultrawirówki: frakcjonowanie oraz ekstrakcję igłową. Niniejszy protokół opisuje wyłącznie proces ekstrakcji DNA z wykorzystaniem techniki frakcjonowania. Wynika to z faktu, że w większości eksperymentów SIP oznakowanego DNA nie można wizualizować za pomocą EtBr, lecz należy je wykrywać poprzez porównywanie równoważnych frakcji lekkich i ciężkich z wielu probówek z próbkami. Do pobierania frakcji gradientu gęstości o jednakowej objętości z probówek do ultrawirówki wysoce zaleca się stosowanie pompy strzykawkowej. W naszych badaniach wykorzystujemy pompę infuzyjną modelu BSP (Braintree Scientific Inc.). Można również zastosować perystaltyczną pompę o niskim przepływie lub pompę HPLC.

  1. Napełnij sterylną strzykawkę o pojemności 60 ml sterylną wodą ddH2O zawierającą wystarczającą ilość barwnika błękitu bromofenolowego, aby uzyskać ciemnoniebieski kolor. Umieść strzykawkę na ramieniu ładującym pompy strzykawkowej. Podłącz dren pompy wyposażony w igłę 23G o długości 1" i włącz pompę, aż niewielka ilość ddH2O wypłynie z końcówki igły. Należy pamiętać, że wszelkie pęcherzyki powietrza w zapasie ddH2O negatywnie wpłyną na proces frakcjonowania.
  2. Przymocuj jedną z probówek do ultrawirówki do statywu z zaciskiem. Upewnij się, że zacisk jest wystarczająco mocny, aby zapobiec przesunięciu probówki, ale nie na tyle, by nacisk na probówkę spowodował wyciek roztworu CsCl podczas jej przebijania. Przebij sam dół probówki wzdłuż jej szwu, używając nowej igły 23G o długości 1". Aby uzyskać najlepsze rezultaty, przebij probówkę w sposób kontrolowany, szybki i pewny. Jest to czynność trudna do wykonania poprawnie; należy poćwiczyć kilkakrotnie przed pierwszą próbą z probówkami zawierającymi próbkę.
  3. Dla każdej próbki przygotuj 12 sterylnych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml z etykietami wskazującymi numer próbki i frakcję (1-12; od ciężkiej do lekkiej). Używając igły podłączonej do drenu pompy (krok 6.1), przebij górną część probówki na jej górnym ramieniu, wzdłuż szwu. Zbieraj roztwór gradientu do probówek do mikrocentryfugi. Podobnie jak w przypadku dna probówki, przebij ją w sposób szybki i kontrolowany. Poćwicz wcześniej i zachowaj szczególną ostrożność, stosując kontrolowany ruch ciągnący, aby zapobiec przebiciu się igły przez probówkę i w palec! Użyj wcześniej skalibrowanej prędkości pompy, która pozwoli uzyskać 12 frakcji po 425 μl w ciągu 12 minut (425 μl min-1).
  4. Użyj cyfrowego refraktometru (np. Reichert AR200; zalecany) lub wagi analitycznej, aby sprawdzić gęstość frakcji z jednego gradientu w celu potwierdzenia prawidłowego utworzenia gradientu. Do tego testu będziesz potrzebować ~50 μl próbki. Często umieszczamy w jednej probówce DNA z czystej kultury (jak opisano przy przygotowywaniu gradientów kontrolnych z EtBr), aby służyło jako kontrola frakcjonowania i używamy go do wyznaczania gęstości. Przewidywane wartości gęstości mieszczą się w zakresie ~1,690-1,760 g ml-1, przy gęstości średniej wynoszącej ~1,725 g ml-1.

7. Wytrącanie DNA

  1. Wytrąć DNA ze wszystkich frakcji, dodając najpierw 20 μg liniowego poliakryloamidu jako nośnika wytrącania. Wymieszaj poprzez odwracanie probówek. Dodaj 2 objętości roztworu PEG (patrz krok 1) i wymieszaj poprzez odwracanie. Należy pamiętać, że nośnik wytrącania (np. glikogen lub liniowy poliakryloamid) jest niezbędny do ilościowego odzyskania DNA z frakcji gradientu, jednak w przypadku stosowania glikogenu jako nośnika w tym protokole należy zachować ostrożność. Wykazano, że preparaty glikogenu mogą być zanieczyszczone bakteryjnymi kwasami nukleinowymi, co może łatwo prowadzić do błędnej interpretacji frakcji gradientu SIP 12.
  2. Pozostaw probówki w temperaturze pokojowej na 2 godziny, aby umożliwić wytrącenie DNA. W razie potrzeby probówki można pozostawić w temperaturze pokojowej na noc.
  3. Wiruj przy 13,000 g przez 30 minut, ustawiając tył probówek na zewnątrz, aby zapewnić spójną orientację probówek w rotorze. Ostrożnie odessaj i usuń nadsącz. Osad powinien być widoczny, ale na tym etapie może być bardzo trudny do dostrzeżenia. Pracuj pod silnym źródłem światła (np. lampką biurkową), aby ułatwić wizualizację osadu.
  4. Przemyj osad 500 μl 70% etanolu. Wiruj przy 13,000 g przez 10 minut. Ostrożnie odessaj i usuń nadsącz. Na tym etapie osad jest zazwyczaj bardziej widoczny, ale łatwiej oddziela się od ścianki probówki.
  5. Pozostaw osad do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  6. Resuspenduj każdy osad w 50 μl buforu TE (patrz krok 1.5). Nałóż 5 μl każdej frakcji na żel agarozowy zgodnie ze standardowymi protokołami laboratoryjnymi.

8. Charakterystyka frakcji

Metoda stosowana do charakterystyki frakcji gradientu w celu oceny powodzenia inkubacji SIP będzie się różnić w zależności od laboratorium i dostępnego sprzętu. Powszechnym podejściem jest zastosowanie metody fingerprintingu ukierunkowanej na gen 16S rRNA, przy czym odpowiednie są takie metody jak polimorfizm długości końcowych fragmentów restrykcyjnych (T-RFLP) lub elektroforeza w żelu z denaturującym gradientem (DGGE) (Rycina 1). Postępując zgodnie z opisanym powyżej protokołem, należy spodziewać się, że lekkie DNA będzie związane z frakcjami 9-11 (~1.705-1.720 g ml-1), a fingerprinty ciężkiego DNA będą występować we frakcjach 5-8 (~1.720-1.735 g ml-1). Unikalne fingerprinty związane z frakcjami 5-8 w próbkach inkubowanych z izotopem stabilnym, które nie występują w kontrolach inkubowanych z naturalnym substratem, stanowią silny dowód łączący konkretne organizmy z metabolizmem danego znakowanego substratu. Jeśli dla niektórych zastosowań (hybrydyzacja, metagenomika) pozostanie niewystarczająca ilość znakowanego DNA, można zastosować amplifikację wielokrotnego przemieszczania (multiple displacement amplification) w celu uzyskania większych ilości 13-15, jednak może to wprowadzić chimery do amplifikowanego DNA 14,16.

9. Wyniki

Typowe wyniki DNA-SIP wykażą rozdzielenie znakowanego i nieznakowanego DNA w gradiencie powstałym w wyniku ultrawirowania. W idealnym przypadku zostanie osiągnięta pełna rozdzielczość materiału genetycznego o wysokiej masie cząsteczkowej (np. 13C, 15N) od materiałów nieznakowanych. Rozdzielczość można zaobserwować wizualnie, monitorując tworzenie się prążków w probówkach kontrolnych z EtBr. Stężenia odzyskanego DNA genomowego zawartego w poszczególnych frakcjach gradientu mogą również służyć do potwierdzenia prawidłowego utworzenia gradientu.

W ramach niniejszego protokołu przedstawiamy reprezentatywne wyniki ultrawirowania w gradiencie gęstości przeprowadzonego z wykorzystaniem kwasów nukleinowych z dwóch czystych kultur (Rysunek 2). Przedstawiony tutaj gradient frakcjonowany został przygotowany z wykorzystaniem genomicznego DNA wyizolowanego z S. meliloti (ATCC 1021) oraz 13C-znakowanego M. capsulatus str. Bath. Po ultrawirowaniu, frakcjonowaniu i odzyskaniu DNA, znakowane i nieznakowane genomiczne DNA rozdzielają się do odpowiednich frakcji gradientu o różnych gęstościach (Rysunek 2A). DNA znakowane ciężkim izotopem można zaobserwować w frakcjach 4-5, natomiast DNA nieznakowane występuje w wysokich stężeniach w frakcjach 9-10. DNA z każdej frakcji charakteryzowano za pomocą elektroforezy w denaturującym gradiencie żelowym 17, a produkty amplifikacji PCR wykazały wyraźne wzory prążków odpowiadające dwóm organizmom wprowadzonym do gradientu (Rysunek 2B). Gęstość frakcji mieściła się w zakresie ~1.580 - 1.759 g ml-1 i są one przedstawione w kolejności malejącej gęstości od lewej do prawej.

Choć rozdział czystego DNA z 13C i 12C może być wyraźny (Rycina 2), interpretacja inkubacji próbek środowiskowych może być trudniejsza. Na przykład inkubowaliśmy gleby tundry z Resolute Bay (Nunavut, Kanada) z glukozą znakowaną 12C lub 13C przez 14 dni w temperaturze 15°C. Żele agarozowe oczyszczonego DNA z frakcji gradientowych wykazały, że DNA genomiczne było „rozsmarowane” w frakcjach 7-10 zarówno dla inkubacji z 12C, jak i 13C (odpowiednio Rycina 3A i 3C). W takim przypadku wzbogacenie biomasy konkretnych taksonów mikrobowych w 13C można określić jedynie za pomocą metody takiej jak DGGE genów 16S rRNA. DNA z gleby inkubowanej z glukozą 12C generuje podobne wzory we wszystkich frakcjach gradientowych (Rycina 3B), natomiast próbka inkubowana z glukozą 13C wygenerowała profile DGGE, które są ściśle powiązane z frakcjami 5-8 (Rycina 3D). Szczególnie interesujące są zachowane prążki wskazane strzałkami. Ten dominujący „filotyp” jest spójny we wszystkich frakcjach gradientowych, ale przesuwa się do cięższych frakcji w przypadku DNA uzyskanego z gleby inkubowanej z glukozą 13C. Dalsze sekwencjonowanie DNA tego prążka i/lub analiza biblioteki klonów pozwoliłyby potwierdzić tożsamość tego konkretnego genu 16S rRNA i ukierunkować późniejsze podejścia metagenomiczne lub oparte na hodowlach.

Schemat ultrawirowania w gradiencie gęstości; przedstawia ekstrakcję kwasów nukleinowych i analizę izotopową.
Rycina 1. Schemat eksperymentu DNA-SIP obejmujący inkubację próbek, ekstrakcję DNA, ultrawirowanie w gradiencie gęstości CsCl oraz charakterystykę DNA za pomocą technik molekularnych.

Wynik elektroforezy żelowej pokazujący fragmenty DNA, analiza ścieżek w celu porównania masy cząsteczkowej.
Rycina 2. Oczekiwane wyniki frakcjonowania gradientowego SIP obejmującego DNA z dwóch kultur czystych. (A) Alikwoty DNA z frakcji gradientu 1-12 naniesiono na 1% żel agarozowy z gradientu zawierającego znakomiony 13C szczep Bath M. capsulatus (frakcje 4-6) oraz znakomiony 12C S. meliloti (frakcje 8-10). Do porównania dołączono drabinkę 1-kb. (B) DNA amplifikowane metodą PCR z tych samych frakcji naniesiono na 10% żel DGGE. Wzory odcisków palców wykazują wyraźne różnice, na przykład między frakcjami 5 i 9.

Wyniki elektroforezy, rozdział DNA, prążki żelowe w ścieżkach, drabinka molekularna, analiza porównawcza.
Rycina 3. Oczekiwane wyniki frakcjonowania gradientowego SIP z inkubacji próbek gleby. Alikwoty frakcji gradientowych z gleby wzbogaconej w glukozę 12C (A) oraz gleby wzbogaconej w glukozę 13C (C) poddano elektroforezie na żelach agarozowych 1%, do porównania dołączono drabinkę 1-kb. Odpowiadające im profile DGGE dla każdej z tych próbek przedstawiono w (B) i (D). Profilowanie frakcji ujawnia wzbogacenie konkretnych taksonów bakteryjnych w próbce wzbogaconej w glukozę 13C w frakcjach 5-8 (D).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Właściwe zaprojektowanie eksperymentów z wykorzystaniem analizy znakowania stabilnymi izotopami (SIP) ma krytyczne znaczenie dla uzyskania znakowanego DNA powyżej poziomu tła nieznakowanej społeczności. Kwestie związane z czasem inkubacji próbek, stężeniami substratów, warunkami inkubacji (np. składnikami odżywczymi, wilgotnością gleby), zjawiskiem cross-feedingu oraz powtórzeniami zostały omówione w innych opracowaniach 10,18, dlatego zalecamy czytelnikom zapoznanie się z tymi publikacjami podczas projektowan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez granty w ramach Projektu Strategicznego oraz granty Discovery przyznane J.D.N. przez Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Błękit bromofenolowyOdczynnikFisher ScientificBP115-25
Chlorek cezuOdczynnikFisher ScientificBP210-500
Ethanol, cz.d.a.OdczynnikSigma-Aldrich652261
Bro מקid etylowyOdczynnikSigma-AldrichE1510
Kwas solnyOdczynnikFisher Scientific351285212
Liniowa poliakrylanamidOdczynnikApplichemA6587
Glikol polietylenowy 6000OdczynnikVWR internationalCAPX1286L-4
Chlorek potasuOdczynnikFisher ScientificAC42409-0010
Chlorek soduOdczynnikFisher ScientificS2711
Wodorotlenek sodu w granulkachOdczynnikFisher ScientificS3181
Tris (zasada)OdczynnikFisher ScientificBP1521
Dark ReaderUrządzenieClare ChemicalDR46B
MikrowirówkaUrządzenieEppendorf5424 000.410
Nanodrop 2000UrządzenieFisher Scientific361013650
Pompa infuzyjnaUrządzenieBraintree Scientific, Inc.N/ANumer modelu: BSP
Szczegóły zamówienia dostępne na stronie www.braintreesci.com.
Zgrzewarka do probówekUrządzenieBeckman Coulter Inc.358312
UltrawirówkaUrządzenieBeckman Coulter Inc.
Rotor do ultrawirówkiUrządzenieBeckman Coulter Inc.362754
Źródło światła ultrafioletowegoUrządzenieUVP Inc.95-0017-09Wystarczy dowolne źródło UV
Przyłbica ochronna UVUrządzenieFisher Scientific114051C
Zatworki z gumy butylowej, szareMateriałSigma-Aldrich27232
Probówki do wirowaniaMateriałBeckman Coulter Inc.342412
Igła hipodermiczna, 23 G, długość 2”MateriałBD Biosciences305145
Probówki do mikrowirówki, 1,5 mLMateriałDiaMedAD151-N500
Uszczelki z otworem centralnym, średnica 20 mmMateriałSigma-Aldrich27230-U
Pipety Pasteura, szklaneMateriałFisher Scientific13-678-6C
Kapturki do pipetMateriałDiaMedBPS340-1000Numer katalogowy dotyczy kapturków 200 μl. Kapturki 10 lub 20 μl można nabyć u tego samego dostawcy
Przewód pompy, otwór 1,5 mm x ścianka 1,5 mmMateriałAppleton Woods
Probówki z nakrętką, 15 mLMateriałDiaMedAD15MLP-S
Fiolki do surowicy, objętość 125 mLMateriałSigma-AldrichZ114014
Strzykawka, 60 mLMateriałBD Biosciences309653

Bibliografia

  1. Neufeld, J. D. DNA stable-isotope probing. Nat. Protocols. 2, 860-866 (2007).
  2. Neufeld, J. D., Boden, R., Moussard, H., Schäfer, H., Murrell, J. C. Substrate-specific clades of active marine methylotrophs associated with a phytoplankton bloom in a temperate coastal environment. Appl. Environ. Microbiol. 74, 7321-7328 (2009).
  3. Nercessian, O., Noyes, E., Kalyuzhnaya, M. G., Lidstrom, M. E., Chistoserdova, L. Bacterial populations active in metabolism of C1 compounds in the sediment of Lake Washington, a freshwater lake. Appl. Environ. Microbiol. 71, 6885-6899 (2005).
  4. Padmanabhan, P. Respiration of 13C-labelled substrates added to soil in the field and subsequent 16S rRNA gene analysis of 13C-labelled soil DNA. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1614-1622 (2003).
  5. Bernard, L. Dynamics and identification of soil microbial populations actively assimilating carbon from 13C-labelled wheat residue as estimated by DNA- and RNA-SIP techniques. Environ. Microbiol. 9, 752-764 (2007).
  6. Haichar, elZ. ahar, F, Identification of cellulolytic bacteria in soil by stable isotope probing. Environ. Microbiol. 9, 625-634 (2007).
  7. Addison, S., McDonald, I., Lloyd-Jones, G. Stable isotope probing: Technical considerations when resolving 15N-labelled RNA in gradients. J. Microbiol. Meth. 80, 70-75 (2009).
  8. Buckley, D. H., Huangyutitham, V., Hsu, S. -F., Nelson, T. A. Stable isotope probing with 15N achieved by disentangling the effects of genome G + C content and isotope enrichment on DNA density. Appl. Environ. Microbiol. 73, 3189-3195 (2007).
  9. Schwartz, E. Characterization of growing microorganisms in soil by stable isotope probing with H218O. Appl. Environ. Microbiol. 73, 2541-2546 (2007).
  10. Neufeld, J. D., Dumont, M. G., Vohra, J., Murrell, J. C. Methodological considerations for the use of stable isotope probing in microbial ecology. Microb. Ecol. 53, 435-442 (2007).
  11. Martineau, C., Whyte, L., Greer, C. Development of a SYBR safe technique for the sensitive detection of DNA in cesium chloride density gradients for stable isotope probing assays. J. Microbiol. Meth. 73, 199-202 (2008).
  12. Bartram, A. K., Poon, C., Neufeld, J. D. Nucleic acid contamination of glycogen used in nucleic acid precipitation and assessment of linear polyacrylamide as an alternative co-precipitant. Biotechniques. 47, 1019-1022 (2009).
  13. Chen, Y. Revealing the uncultivated majority: combining DNA stable-isotope probing, multiple displacement amplification and metagenomic analyses of uncultivated Methylocystis in acidic peatlands. Environ. Microbiol. 10, 2609-2622 (2008).
  14. Neufeld, J. D., Chen, Y., Dumont, M. G., Murrell, J. C. Marine methylotrophs revealed by stable-isotope probing, multiple displacement amplification and metagenomics. Environ. Microbiol. 10, 1526-1535 (2008).
  15. Kalyuzhnaya, M. High-resolution metagenomics targets specific functional types in complex microbial communities. Nat. Biotechnol. 26, 1029-1034 (2008).
  16. Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology. ISME J. 2, 233-241 (2008).
  17. Green, S. J., Leigh, M. B., Neufeld, J. D. Microbiology of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. Timmis, K. N. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 4137-4158 (2010).
  18. Neufeld, J. D., Wagner, M., Murrell, J. C. Who eats what, where and when? Isotope-labelling experiments are coming of age. ISME J. 1, 103-110 (2007).
  19. Gallagher, E., McGuinness, L., Phelps, C., Young, L. Y., Kerkhof, L. J. DNA shortens the incubation time needed to detect benzoate-utilizing denitrifying bacteria by stable-isotope probing. Appl. Environ. Microbiol. 71, 5192-5196 Forthcoming.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ultracentryfugacja w gradiencie gęstościchlorek cezufrakcjonowanie gradientoweekstrakcja DNAinkubacja próbek środowiskowychznakowanie stabilnymi izotopamicharakterystyka molekularnafingerprinting PCRmetagenomika
Analiza stabilnych izotopów w DNA (DNA-SIP)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.