1. Przygotowanie roztworów wzorcowych i podstawowych inhibitorów
- Aby przygotować AMP, odważyć 0,00345 g AMP i rozpuścić go w 5 ml pożywki bez surowicy, aby uzyskać 2 mM roztwór wzorcowy AMP.
- Aby przygotować ADO, odważyć 0,00265 g ADO i rozpuścić go w 5 ml pożywki niezawierającej surowicy, aby uzyskać 2 mM roztwór wzorcowy ADO.
- Aby przygotować INO, odważyć 0,00268 g INO i rozpuścić go w 5 ml pożywki niezawierającej surowicy, aby uzyskać 2 mM roztwór wzorcowy INO.
- Przygotować 400 μM roztwór AMP, ADO i INO, mieszając 1 ml 2 mM roztworu podstawowego w 4 ml pożywki wolnej od surowicy (5 ml końcowej objętości).
- Rozcieńczyć 1:4 każdy roztwór wzorcowy o stężeniu 400 μM w celu uzyskania stężenia 100 μM, pipetując 500 μl roztworu 400 μM w 1500 μl pożywki wolnej od surowicy (2 ml końcowej objętości).
- Przygotować seryjne rozcieńczenia każdego związku w podłożu bez surowicy, aby uzyskać następujące stężenia: 100 μM - 50 μM - 25 μM - 10 μM - 5 μM - 2,5 μM - 1 μM - 0,5 μM - 0,25 μM,
Uwaga: Na przykład, odpipetować 1 ml roztworu 100 μM w 1 ml pożywki wolnej od surowicy (rozcieńczenie 1:2) w celu uzyskania stężenia 50 μM i postępować z pozostałymi rozcieńczeniami.
- Przygotować 10 mM roztwór podstawowy APCP rozpuszczony w PBS; podwielokrotność i podtrzymanie w temperaturze -30 °C.
- Przygotować 10 mM roztwory podstawowe chlorowodorku EHNA, dCF i dipirydamolu rozpuszczone w dimetylosulfotlenku (DMSO); podwielokrotność i roztwór podstawowy w temperaturze -30 °C.
2. Zaprogramuj metodę HPLC
- Przygotować bufor octanu amonu o pojemności 7 mM, rozpuszczając 0,770 g octanu amonu w 2 litrach podwójnie dejonizowanej wody (bufor A). Dostosuj do pH 3,0 za pomocą kwasu solnego.
- Przygotować szklaną butelkę zawierającą co najmniej 2 litry ultraczystego acetonitrylu do HPLC (bufor B) i podłączyć kolumnę ochronną i kolumnę do HPLC.
Uwaga: Kolumny i mają wartość RT podczas użytkowania.
- Zaloguj się do oprogramowania HPLC i wybierz przycisk "przeglądaj projekt". Przejdź do menu "plik" i wybierz "nowa metoda", a następnie "metoda instrumentu".
- Zaprogramuj metodę kolumny równowagi zgodnie z tabelą 1. Ustaw natężenie przepływu na 1,00 ml/min i zaprogramuj detektor UV tak, aby odczytywał przy 260 nm. Zapisz metodę instrumentu i ponownie wybierz "nowa metoda" z menu "plik", a następnie "zestaw metod". Wybierz poprzednio zapisaną metodę instrumentu i zapisz bieżący zestaw metod o tej samej nazwie.
- Powtórz krok 2.3, aby zaprogramować przebieg przykładowej metody wskazanej w Tabeli 2. Ustaw natężenie przepływu na 1,00 ml/min i zaprogramuj detektor UV tak, aby odczytywał przy 260 nm. Zapisz metodę przyrządu i powtórz tę samą procedurę, jak opisano w kroku 4.4, aby zapisać zestaw metod.
- Wybierz przycisk "uruchom próbki", wybierz "nowa metoda zestawu próbek" z menu "plik".
- Należy wybrać opcję "pusta" i wprowadzić numer fiolki (w autosamplerze), nazwę próbki, objętość wstrzyknięcia (50 μl). Wybierz zapisany wcześniej zestaw metod dla kolumny "zestaw metod" i wprowadź całkowity czas wykonania (min).
Uwaga: Wprowadzić metodę kolumny równowagi (tabela 1) w kolumnie "zestaw metod" przed każdym przebiegiem próbki i wprowadzić całkowity czas trwania (min).
3. Generowanie wzorcowej krzywej kalibracyjnej dla każdego związku
- Wstrzyknąć 50 μl ślepej próby (specyficznej pożywki niezawierającej surowicy, która nie zawiera deaminazy adenozyny) i każdej próbki wzorcowej zgodnie z metodami opisanymi w tabelach 1 i 2.
- Przed każdym badaniem próbki należy zastosować metodę kolumny równowagi (tabela 1) i ustawić warunki gradientu opisane w tabeli 2 w celu uzyskania odpowiedniej separacji pików. Patrz Tabela 3, aby zapoznać się z raportowanymi czasami retencji AMP, ADO i INO w tych warunkach HPLC.
- Określ obszar pików AMP, ADO i INO przy różnych stężeniach, wybierając przycisk "proces" w oprogramowaniu HPLC, a następnie opcję "integruj". Alternatywnie można ręcznie wybrać punkt początkowy i końcowy każdego szczytu.
- Wykreślić powierzchnie pików w stosunku do nominalnego stężenia każdego wzorca, aby uzyskać dziewięciopunktową krzywą kalibracyjną (100, 50, 25, 10, 5, 2,5, 1, 0,5, 0,25 μM).
- Oblicz równanie linii prostej dla AMP, ADO i INO: y = mx + b,
gdzie x jest stężeniem μM, a y odpowiada powierzchni piku.
szt.
szt.
| Godzina | Natężenie przepływu (ml/min) | %A | %B |
| godz. 1.00 | 100 | 0 |
| Pytanie 1,24 | godz. 1.00 | 100 | 0 |
| Lokal 6,22 | godz. 1.00 | cyfra arabska | Rozdział 98 |
| godz. 18.65 | godz. 1.00 | cyfra arabska | Rozdział 98 |
Tabela 1: Metoda kolumny równowagi. Schematyczne przedstawienie zmian rozpuszczalnika dla równowagi kolumny. Bufor A: 7 mM octanu amonu, pH 3,0. Bufor B: acetonitryl.
szt.
pkt.
szt.
szt.
szt.
| Godzina | Natężenie przepływu (ml/min) | %A | %B |
| godz. 1.00 | 0 | 100 |
| 3,74 | godz. 1.00 | 0 | 100 |
| godz. 13.71 | godz. 1.00 | 15 | Rozdział 85 |
| godz. 17.00 | godz. 1.00 | 100 | 0 |
| godz. 20.00 | godz. 1.00 | 100 | 0 |
Tabela 2: Uruchom przykładową metodę. Schematyczne przedstawienie zmian rozpuszczalnika do pomiaru związków purynowych metodą HPLC. Bufor A: 7 mM octanu amonu, pH 3,0. Bufor B: acetonitryl.
.
szt.
szt.
szt.
| Czas przechowywania | λmaks |
| Amp | 8,00 min | 260 |
| Ino | godz. 11.00 min | 260 |
| zamieszanie | 11,90 min | 260 |
Tabela 3: Czasy retencji związków purynowych. Typowe czasy retencji obserwowane dla AMP, ADO i INO. Detektor UV jest zaprogramowany do odczytu przy 260 nm.
4. Wstępne traktowanie inhibitorami i inkubacja z substratem (AMP)
- Aby przetestować zużycie AMP, wytwarzanie ADO i INO bez hamowania transporterów CD73, ADA i nukleozydów, ponownie zawieś oczyszczone komórki CLL 2 x 106 CD19 + / CD5 + w 250 μl pożywki wolnej od surowicy i komórek płytkowych na płytce 48-dołkowej (lub w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml).
- Dodać 250 μl 400 μM inhibitorów AMP lub AMP plus, aby uzyskać końcowe stężenie 200 μM AMP. Uwzględnić warunek braku substratu, który ma być użyty jako ślepa próbka.
- Inkubować od 30 do 60 minut w temperaturze 37 °C.
- Pod koniec czasu inkubacji zebrać 500 μl supernatantów w zimnych probówkach do mikrowirówek (na lodzie) i natychmiast odwirować przy 17 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
- Przenieść supernatanty do nowych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i natychmiast przechowywać w temperaturze -80 °C lub przystąpić do przygotowania próbek do serii HPLC.
5. Przygotowanie próbek do HPLC
- Przefiltrować supernatanty w nowych probówkach mikrowirówkowych o pojemności 1,5 ml z filtrami strzykawkowymi 0,2 μm. Do filtrowania należy użyć strzykawek o pojemności 1 ml.
- Jeżeli system HPLC jest wyposażony w automatyczny podajnik próbek, należy przygotować szklane fiolki do HPLC i użyć mikrowkładek o pojemności 0,1 ml do małych objętości próbki.
- Przenieść co najmniej 100 μl próbki do szklanej fiolki za pomocą mikropipety lub szklanej pipety Pasteura. Należy uważać, aby przenieść się bez pęcherzyków powietrza i zamknąć fiolkę zakrętką.
- Próbki są teraz gotowe do analizy za pomocą RP-HPLC.
6. Pomiary puryn metodą HPLC
- Wybierz przycisk "uruchom próbki"; wybierz "nowa metoda zestawu próbek" z menu "plik".
- Wybrać opcję "pusta" i wskazać: numer fiolki (w autosamplerze), nazwę próbki, objętość wstrzyknięcia (50 μl).
- Należy wybrać metodę kolumny równowagi i metodę próby próbnej opisaną odpowiednio w tabeli 1 i tabeli 2 dla wszystkich kolejnych ślepych prób i próbnych serii.
nuta: Ustawić metodę kolumny równowagi (tabela 1) przed każdym przebiegiem próbki.
- Wstrzyknąć 50 μl ślepej próby (pożywki niezawierającej surowicy) i każdej próbki.
- Oznaczyć stężenie puryn w każdej próbce, określić ilościowo AMP, ADO i INO, uzyskując powierzchnie pików w czasach retencji opisanych w tabeli 3.
- Wybierz przycisk "proces", a następnie opcję "integruj". Alternatywnie można ręcznie wybrać punkt początkowy i końcowy każdego pojedynczego szczytu, aby uzyskać pomiar powierzchni. Odbywa się to poprzez narysowanie linii między punktem początkowym i końcowym szczytu.
- Określić stężenie μM, stosując równanie otrzymane dla krzywej standardowej: y = mx + b, gdzie x oznacza stężenie μM, a y jest obszarem piku zmierzonym z nieznanej próbki.
UWAGA: Przykładowa krzywa wzorca kalibracji ADO jest przedstawiona na rysunku 1, gdzie: x = (obszar y - 981.02)/40026
- Biorąc pod uwagę, że 2 x 106 komórek zostało ponownie zawieszonych w 0,500 ml pożywki, obliczyć μmole AMP, ADO i INO zużyte i/lub wytworzone przez 106 komórek CLL, stosując następującą proporcję:
μmol : 1 000 ml = x μmol : 0,250 ml
nuta: Μmole w 1,000 ml (liczba μmoli w 1 l) są równoważne stężeniu μM, a x to μmole nukleotydu lub nukleozydu wytwarzanego przez 106 komórek. Na koniec przekształć μmole w nmole zużyte i/lub wytworzone przez 106 komórek CLL: nmole = μmole x 1,000
