Zakładanie pierwotnych kultur fibroblastów dorosłych gryzoni

Podsumowanie

Niniejszy artykuł opisuje protokół izolacji i hodowli pierwotnych kultur fibroblastów z tkanki skóry oraz płuc dzikich gryzoni.

Streszczenie

Coraz powszechniej dostrzegana jest istotność wykorzystywania komórek pierwotnych zamiast linii komórkowych nowotworowych w badaniach biologicznych. Komórki pierwotne są preferowane w badaniach nad kontrolą cyklu komórkowego, apoptozą i naprawą DNA, ponieważ komórki nowotworowe posiadają mutacje w genach zaangażowanych w te procesy. Komórek pierwotnych nie można hodować w nieskończoność ze względu na wystąpienie senescencji replikacyjnej lub aneuploidyzacji. W związku z tym konieczne jest regularne zakładanie nowych kultur. Procedura izolacji embrionalnych fibroblastów gryzoni jest dobrze opracowana, jednak izolacja kultur fibroblastów dorosłych często stanowi wyzwanie. Fibroblasty dorosłych gryzoni izolowane z mysich modeli ludzkich chorób mogą być preferowaną kontrolą podczas porównywania ich z fibroblastami pobranymi od pacjentów. Co więcej, fibroblasty dorosłych osobników są jedynym dostępnym materiałem w przypadku pracy z dzikimi gryzoniami, gdzie trudno o dostęp do ciężarnych samic. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół izolacji i hodowli fibroblastów dorosłych pobieranych ze skóry i płuc gryzoni. Procedura ta została przez nas z powodzeniem zastosowana do izolacji fibroblastów z ponad dwudziestu gatunków gryzoni, od myszy i szczurów laboratoryjnych po gryzonie dzikie, takie jak bobry, jeżozwierze i wiewiórki.

Protokół

1. Przed rozpoczęciem

1. Zdezynfekuj nożyczki i pęsetę 70% etanolem.
2. Umieść mały mieszadło magnetyczne w zlewce o pojemności 30 mL, przykryj dwiema warstwami folii i wysterylizuj w autoklawie.
3. Przygotuj roztwór zapasowy Liberase Blendzyme 3 o stężeniu 28 Wunsch units/mL w sterylnej wodzie. Przygotuj aliquoty po 0,5 mL i zamroź w temperaturze -20°C. Przed każdym użyciem rozmroź nową aliquot. Po rozmrożeniu roztwór może być mętny. Mieszaj roztwór w wirówce (vortex), aż stanie się klarowny.
4. Podgrzej pożywkę do hodowli komórkowej.

2. Przygotowanie próbek zwierzęcych

Ostrzeżenie: dzikie zwierzęta mogą być nosicielami patogenów, takich jak wirus wścieklizny. Należy zawsze zachować ostrożność podczas pracy z odkrytymi narzędziami ostrymi.

1. Uśmierć zwierzę i umieść truchło w temperaturze 4°C. Najlepiej jest wykorzystać truchło natychmiast, jednak jeśli nie jest to praktyczne, na przykład gdy zwierzęta są zbierane w terenie, z truchła można skorzystać w ciągu 24 godzin. Po upływie 24 godzin wydajność komórek spada.
2. Przeprowadź sekcję zwierzęcia w sali operacyjnej lub w dygestorium chemicznym (nie w komorze do hodowli tkanek).
3. Obszar pod pachą jest dogodnym miejscem do pobierania próbek skóry, ponieważ skóra w tym miejscu jest cieńsza, zawiera mniej tłuszczu, a futro jest rzadsze. Oczyść miejsce nacięcia 70% etanolem. Upewnij się, że futro jest nasączone etanolem.
4. Zgól futro wokół miejsca nacięcia ostrym skalpelem. Zgól obszar większy niż planowane miejsce nacięcia. Staraj się zminimalizować skaleczenia skóry. Spryskaj obszar 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia.
5. Aby pobrać próbkę skóry, wycięty fragment powinien mieć wielkość około 1 cm². Chwyć skórę pęsetą anatomiczną i przetnij nożyczkami. Staraj się nie wycinać warstwy tłuszczu wraz ze skórą, ponieważ tłuszcz utrudnia trawienie kolagenazą. Aby pobrać próbki płuc, przemyj obszar klatki piersiowej 70% etanolem i rozetnij skórę na klatce piersiowej nożyczkami, wykonując nacięcie w kształcie litery T i rozchylając płaty skóry. Przemyj odsłonięty obszar mięśni 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia. Przetnij klatkę piersiową, używając sterylnych pęset i nożyczek (w przypadku większych zwierząt użyj kleszczy do kości). Stosuj techniki sterylne, aby uniknąć zanieczyszczenia narządów wewnętrznych. Nie dotykaj narządów wewnętrznych narzędziami, które miały kontakt z futrem zwierzęcia. Wytnij fragmenty płuc o wielkości około 1 cm², używając sterylnych pęset i nożyczek.
6. Umieść fragmenty tkanek w probówkach 50 mL z jałowym PBS, aby zapobiec ich wysychaniu.
7. Przemyj z zewnątrz probówki 50 mL z fragmentami tkanek etanolem, a następnie przenieś je do komory do hodowli tkanek.
8. Utylizuj truchło zwierzęcia zgodnie z obowiązującymi procedurami.

3. Wyodrębnianie komórek

1. Przenieś fragmenty tkanki do 10 cm naczynia hodowlano-tkankowego za pomocą sterylnego skalpela. Nie przenoś zbyt dużej ilości PBS wraz z próbką.
2. Pokrój tkankę na kawałki o wielkości ~1 mm, używając dwóch skalpeli. Wykonuj ruchy rozdzielające (podobnie jak nożyczkami), zaczynając od środka i rozciągając materiał. Trzymaj tkankę w skupieniu, nie tnij kawałek po kawałku. Gdy cięcie jest wystarczające, skóra przypomina masę plastyczną – nie rozdziela się na kawałki, lecz rozciąga, stając się cienką. Tkanka płucna jest łatwiejsza do cięcia i rozdziela się na drobne fragmenty.
3. Za pomocą skalpela przenieś pociętą tkankę do sterylnego naczynia o pojemności 30 mL z zawartością sterylnego mieszadła magnetycznego. Przemyj płytkę użytą do cięcia tkanki 10 mL pożywki DMEM/F12 z dodatkiem 0,14 jednostek Wunsch/mL Liberase Blendzyme 3 oraz 1X antybiotyków/antymykotyków i dodaj ten roztwór do naczynia 30 mL z fragmentami tkanki.
4. Przykryj naczynie sterylną folią i inkubuj w temperaturze 37°C przy powolnym mieszaniu przez 30 do 90 minut. Długość inkubacji zależy od gatunku i rodzaju tkanki. Należy uważać, aby nie doprowadzić do nadmiernego trawienia tkanki. Najlepsze wydajności uzyskuje się, gdy pod koniec procesu trawienia wciąż obecne są fragmenty tkanki. Skóra trawi się dłużej niż płuca. Skóra dużych zwierząt wymaga dłuższego czasu trawienia. Sprawdzaj stopień trawienia po 30 min, a następnie co 10 min. Po całkowitym strawieniu skóry pożywka staje się mętna, fragmenty skóry oddzielają się od siebie, a krawędzie kawałków stają się „rozmyte”. Trawienie płuc należy przerwać, gdy fragmenty płuc zmienią kolor z czerwonego na biały i zaczną tworzyć lepkie włókna.
5. Przenieś roztwór zawierający fragmenty tkanki pipetą wielokrotnie w górę i w dół, aby rozbić grudki. Przenieś roztwór do sterylnej probówki 50 mL. Jeśli fragmenty łatwo przechodzą przez pipetę 10 mL, oznacza to, że cięcie i trawienie zostały wykonane prawidłowo. Przepłucz naczynie 3 razy 10 mL ciepłej pożywki DMEM/F12 z 15% FBS oraz 1X antybiotykami/antymykotykami i dodaj pożywkę do probówki 50 mL z fragmentami tkanki. Zamknij probówkę 50 mL i wymieszaj poprzez kilka odwrócenia. FBS w pożywce zatrzyma działanie Liberazy.
6. Wiruj przy 524 g w wirówce do hodowli tkankowej z koszykiem wahadłowym przez 5 min. Usuń supernatant. Resuspenduj osad w 10 mL ciepłej pożywki DMEM/F12 z 15% FBS i 1X antybiotykami/antymykotykami. Pipetuj zawiesinę z maksymalną siłą, aby rozbić kawałki tkanki.
7. Dodaj kolejne 30 mL pożywki DMEM/F12 z 15% FBS i 1X antybiotykami/antymykotykami, wymieszaj i wiruj przy 524 g w wirówce do hodowli tkankowej z koszykiem wahadłowym przez 5 min. Powtórz czynność jeszcze raz, aby usunąć resztki Liberazy.
8. Resuspenduj osad w 10 mL pożywki DMEM/F12 z 15% FBS i 1X antybiotykami/antymykotykami, przenieś do 10 cm naczynia hodowlano-tkankowego i umieść w inkubatorze do hodowli tkankowej w temperaturze 37°C, 5%CO₂, 3%O₂.
9. Codziennie sprawdzaj płytki pod kątem obecności fibroblastów oraz koloru pożywki. Jeśli izolacja przebiegła pomyślnie, fibroblasty wyciekają z fragmentów tkanki i przywierają do płytki (Rysunek 1). Fibroblasty zaczynają opuszczać fragmenty tkanki w ciągu 2–5 dni.
10. Jeśli pożywka zmieni kolor na żółty, może to wskazywać na potencjalne zanieczyszczenie lub zbyt duże zagęszczenie komórek. Obejrzyj płytki pod mikroskopem przy dużym powiększeniu. W przypadku obecności bakterii, grzybów lub nicieni zutylizuj płytki (rzadko zdarza się to u zwierząt laboratoryjnych, jednak może wystąpić przy próbkach pobranych z natury). Jeśli brak zanieczyszczeń, a pożywka zmieniła kolor, przyczyną jest zbyt duża liczba komórek lub zbyt wiele fragmentów tkanki w jednym naczyniu. Jeśli więcej niż 60% płytki jest pokryte przytwierdzonymi fibroblastami, wymień pożywkę i przenieś fragmenty tkanki na nową płytkę z nową pożywką. Jeśli do płytki przytwierdziło się niewiele fibroblastów, wymień pożywkę i rozdziel kawałki tkanki na 2–4 płytki.
11. Po 7 dniach, jeśli pożywka nie była wymieniana wcześniej, wymień ją i przenieś fragmenty tkanki na nową płytkę z nową pożywką.
12. Inkubuj komórki i fragmenty tkanki przez kolejne 7 dni. Do 14. dnia wszystkie żywe fibroblasty opuszczają fragmenty tkanki.
13. Po 14 dniach od rozpoczęcia izolacji komórek usuń starą pożywkę oraz fragmenty tkanki, zbierz komórki i wysiej je na nową płytkę w gęstości 5x10⁵ komórek/płytkę w pożywce EMEM z 15% FBS, 1X penicyliną/streptomycyną, niezbędnymi aminokwasami oraz pirogronianem sodu. Pożywka EMEM będzie wspierać wzrost wyłącznie fibroblastów, a inne typy komórek zginą lub przestaną proliferować.
14. Po osiągnięciu przez komórki 80–90% konfluencji, zamroź alikwot komórek do późniejszego użycia.
15. Kontynuuj hodowlę komórek, pasażując je w gęstości 5x10⁵ komórek/płytkę, gdy osiągną 80–90% konfluencji.

4. Reprezentatywne wyniki

Normalne fibroblasty to duże komórki z wyraźnymi wypustkami (lamellipodiami) (Rysunek 2). Fibroblasty rosną w monowarstwie. Zdrowa, rosnąca hodowla zawiera 1-10% komórek w fazie M, rozpoznawalnych jako zaokrąglone komórki uniesione nad powierzchnią płytki, lecz nie oddzielone od niej (Rysunek 3). Zazwyczaj płytka o średnicy 10 cm zasiana 5x10⁵ komórkami osiąga konfluencję w ciągu 3-4 dni. Czas podwojenia liczby komórek znacznie różni się w zależności od gatunku i może być dłuższy u niektórych długowiecznych gatunków gryzoni¹. Gdy komórki wypełnią płytkę, proliferacja zostaje zatrzymana w fazie G1. Typowa konfluenta płytka fibroblastów zawiera gęsto upakowaną warstwę komórek (Rysunek 4). Gdy komórki osiągną 90% konfluencji, są gotowe do pasażowania. W razie potrzeby komórki mogą być utrzymywane na konfluentnej płytce z zahamowanym wzrostem przez dłuższy czas, przy regularnej wymianie pożywki (raz lub dwa razy w tygodniu).

Rysunek 1. Izolacja fibroblastów ze skóry (A) i płuca (B) myszy. Przed wykonaniem zdjęć w 7. dniu wymieniono medium w celu usunięcia nieprzyległych komórek oraz resztek komórkowych.

Rysunek 2. Fibroblasty płuc myszy.

Rysunek 3. Pole fibroblastów mysich zawierające komórki w fazie M, sfotografowane przy 10-krotnym powiększeniu.

Rycina 4. Konfluenta płytka fibroblastów mysich, sfotografowana przy 10-krotnym powiększeniu.

Dyskusja

Normalne pierwotne fibroblasty stanowią doskonałą alternatywę dla utrwalonych linii komórkowych nowotworowych w badaniach biologicznych. Istotną zaletą fibroblastów jest brak mutacji w onkogenach i genach supresorowych oraz zachowanie nienaruszonych punktów kontrolnych cyklu komórkowego. Dzięki temu normalne fibroblasty są preferowanym układem do badań nad regulacją cyklu komórkowego, naprawą DNA i apoptozą. Opisany tutaj protokół zawiera prostą procedurę izolacji i hodowli pierwotnych fibroblastów. Protokół ten został z...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
pożywka DMEM/F12	Invitrogen	11330-032
płytkowa surowica bydlęca (FBS), Qualified	Invitrogen	01437-036	Surowica Qualified została wstępnie przetestowana w celu zapewnienia dobrego wsparcia wzrostu dla fibroblastów pierwotnych.
antybiotyk/antymykotyk	Invitrogen	15420-096
penicylina/streptomycyna	Invitrogen	15140-122
Liberase TM Research Grade	Roche	05401127001	Enzym zamienny.
Uwaga autorów: Ponieważ firma Roche wycofała z oferty Liberase Blendzyme 3 (11814184001), zaleca stosowanie zamiast niego Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (nr kat. 05401119001 – 10 mg, nr kat. 05401127001 – 100 mg). Pomyślnie przeszliśmy na ten enzym bez żadnych problemów.
pożywka EMEM	ATCC	30-203	Pożywka EMEM z ATCC zawiera już nieessentialne aminokwasy oraz pirogronian sodu.
jednorazowy, sterylny skalpel z ostrzem #21	Różni dostawcy
inkubator z kontrolą trzech gazów	Forma lub Heraeus