Kultura zarodkowych płuc myszy – system do oceny molekularnych mechanizmów rozgałęziania

Podsumowanie

Hodowla organów płuc wczesnego embrionu jest bardzo użytecznym systemem do badania oddziaływań nabłonkowo-mezenchymalnych. Zarówno morfogeneza nabłonka, jak i mezenchymy przebiegają w specyficznych warunkach, które można łatwo manipulować w tym systemie.

Streszczenie

Specyfikacja pierwotnych struktur płuc oraz morfogeneza rozgałęzania, a także formowanie się różnych linii komórkowych płuc wymagają specyficznej interakcji endodermy płuc z otaczającym ją mezenchymem i mezotelium. Wykazano, że mezenchym płuc jest źródłem sygnałów indukcyjnych dla morfogenezy rozgałęzania płuc. Interakcje nabłonkowo-mezenchymalno-mezotelialne są również kluczowe dla morfogenezy płuc w okresie embrionalnym. Hodowla organowa wczesnych płuc embrionalnych jest bardzo użytecznym systemem do badania interakcji nabłonkowo-mezenchymalnych. Zarówno morfogeneza nabłonkowa, jak i mezenchymalna przebiega w specyficznych warunkach, które można łatwo manipulować w tym systemie (przy braku wpływu organizmu matki i przepływu krwi). Co ważniejsze, technikę tę można z łatwością przeprowadzić w bezserwatkowych, chemicznie zdefiniowanych pożywkach hodowlanych. Funkcje typu gain-of-function i loss-of-function można osiągnąć przy użyciu ekspresowanych białek, rekombinowanych wektorów wirusowych i/lub analizy transgenicznych szczepów myszy, antysensownego RNA, a także wyciszania genów za pomocą interferencji RNA.

Protokół

Hodowla organów to bardzo użyteczna i wszechstronna technika służąca do badania ekspresji genów i białek. Te metody hodowli ex vivo mogą być stosowane jako wstępne badania lub uzupełnienie badań in vivo.

1. Izolacja płuc zarodkowych

1. Myszy w ciąży są uśmiercane w 1,5 lub 12,5 dobie po zapłodnieniu (E1,5-12,5) poprzez narkozę CO₂ zgodnie z wytycznymi NIH i OLAW. Zwierzę umieszcza się w komorze, do której wprowadza się 10% CO₂. Po utracie przytomności przez zwierzę zwiększa się przepływ CO₂. Należy upewnić się, że nastąpiła śmierć kliniczna zwierzęcia.
2. Wszystkie kolejne kroki muszą być wykonane w warunkach sterylnych pod laminarnym przepływem powietrza. Macicę usuwa się z ciężarnych samic. Aby usunąć macicę z organizmu, ciężarne samice kładzie się na plecach i spryskuje 70% etanolem. Wykonuje się nacięcie w okolicy brzucha, a skórę usuwa się, odciągając ją do góry przy jednoczesnym trzymaniu tylnych łap zwierzęcia. Otwiera się jamę otrzewnową i usuwa macicę z organizmu zwierzęcia.
3. Krew jest wypłukiwana poprzez umieszczenie macicy w probówce stożkowej o pojemności 50 ml wypełnionej zimnym zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS), a probówką delikatnie kołysze przez 2 minuty.
4. Następnie macicę umieszcza się w szalce Petriego pod stereomikroskopem sekcyjnym, a embriony uwalnia z macicy poprzez nacięcie ściany macicy nożyczkami sprężynowymi. Embriony zbiera się za pomocą łyżki perforowanej i umieszcza na lodzie w nowej szalce Petriego zawierającej HBSS.
5. Pod stereomikroskopem sekcyjnym płuca embrionalne są wycinane pojedynczo w szalce Petriego zawierającej zimny HBSS (Rycina 1).
6. Wyizolowane płuco embrionalne przenosi się za pomocą sterylnej pipety transferowej na lód do szalki Petriego zawierającej HBSS.

2. Hodowla płuc zarodkowych

1. Do płytki polistyrenowej Nunclon dodaje się od 500 µL do 1 mL na dołek pożywki D-MEM/F-12 uzupełnionej o 50 jednostek/ml penicyliny-streptomycyny.
2. Na powierzchni pożywki umieszcza się membranę poliwęglanową z trawionymi otworami Nuclepore. Podczas aplikacji membrany poliwęglanowej z trawionymi otworami Nuclepore należy upewnić się, że strona błyszcząca przylega do pożywki, a strona chropowata jest skierowana do góry.
3. Za pomocą sterylnej pipety transferowej na membranę poliwęglanową z trawionymi otworami Nuclepore nakłada się wypreparowane płuco embrionalne.
4. Za pomocą pęsety koryguje się położenie płuca embrionalnego. Płuco embrionalne umieszczone na filtrze powinno mieć nienaruszoną tchawicę, która musi być ułożona prosto, aby wszystkie płuca miały takie samo ciśnienie wewnętrzne.
5. Płytkę polistyrenową Nunclon przenosi się do inkubatora komórkowego na wymagany czas hodowli (Rycina 2).

3. Materiały

1. Izolacja całych płuc embrionalnych

1. Myszy w ciąży (typ dziki C57BL6 lub transgeniczne), przeznaczone do uboju od 1,5 do 13,5 dnia po zapłodnieniu (E1,5-13,5).
2. Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) (1X), płynny, bez chlorku wapnia, chlorku magnezu lub siarczanu magnezu (Invitrogen, Carlsbad, CA), uzupełniony o 50 jednostek/ml penicyliny-streptomycyny (Invitrogen, Carlsbad, CA). HBSS przechowywać w temperaturze pokojowej oraz w temperaturze 4°C po otwarciu. Penicylinę-streptomycynę rozdzielić na aliquoty i przechowywać w temperaturze -20°C.
3. Stereomikroskop sekcyjny (Leica, Wetzlar, Germany).
4. Narzędzia sekcyjne, w tym pęsety Dumont, cienkie nożyczki irydowe (proste), nożyczki sprężynowe Noyes oraz łyżeczka Moria® (perforowana) (Fine Science Tools, Foster City, CA).

2. Hodowla całych płuc zarodkowych

1. Modyfikowane pożywką Eagle'a Dulbecco: Mieszanka odżywcza F-12 (D-MEM/F-12) (1X), ciecz, 1:1. Zawiera L-glutaminę, ale nie zawiera buforu HEPES. (Invitrogen, Carlsbad, CA) uzupełnione o 50 jednostek/ml penicyliny i streptomycyny (Invitrogen, Carlsbad, CA). Butelkę z DMEM/F-12 należy przechowywać w ciemności (np. owiniętą folią aluminiową) w temperaturze 4°C. Penicylinę i streptomycynę należy podzielić na alikwoty i przechowywać w temperaturze -20°C.
2. Membrana poliwęglanowa Nuclepore z trawionymi kanałami, 8.0-m, 13mm (Whatman Nuclepore Track-Etch membrane (Whatman, Florham Park, NJ).
3. Szalka polistyrenowa Nunclon z pokrywkami, 4 dołki (Rochester, NY).
4. Jednorazowe pipety transferowe, sterylne (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA).

Rysunek 1. Disekcja płuc embrionalnych w 12. dniu rozwoju (E12). (A) Cały embrion w stadium E12.5 widziany z prawej strony. (B) Prawe przedramię zostało usunięte z zarodka. (C) Pinceta trzymana w lewej ręce stabilizuje embrion w naczyniu. Strzałki wskazują plan sekcji. (D) Zarodek płuca znajduje się za sercem (usuniętym) i przed kręgosłupem. Rysunek ten przedstawia płuca po usunięciu skóry i serca. (EUsunięcie gardła umożliwia oddzielenie nienaruszonego płuca od zarodka. (F) Usunięto zbędną tkankę gardła i przełyku. Przedstawiono wypreparowaną płuco embrionalne w stadium E12.5 z nienaruszoną tchawicą i krtanią. (Cr) Płat kranialny, (Med) Płat przyśrodkowy, (Ca) Płat kaudalny, (Acc) Płat dodatkowy, (Le) Płat lewy.

Rycina 2. FGF9 indukuje ekspansję mezenchymy oraz rozszerzenie nabłonka w płucach hodowanych in vitro. (A-C) Płuco w stadium E12.5 hodowano przez 48 godzin wobec braku FGF9. Zwróć uwagę na zwiększone rozgałęzienie. (D-F) Płuco w stadium E12.5 hodowane przez 48 godzin w obecności FGF9. Zwróć uwagę na rozszerzenie nabłonka i mezenchymy już po 24 godzinach hodowli (E)Po 48 godzinach (F), wpływ na nabłonek jest jeszcze bardziej wyraźny. Pasek skali: A-F 400 μm ⁴.

Pełny protokół tekstowy dla tego podejścia eksperymentalnego jest dostępny w Springer Protocols.