Obrazowanie pojedynczych cząsteczek w transporcie jądrowym

Podsumowanie

Podejście oparte na mikroskopii pojedynczych cząsteczek dostarczyło nowych informacji na temat transportu jądrowego.

Streszczenie

Użyteczność metod fluorescencyjnej mikroskopii pojedynczych cząsteczek została w ciągu ostatniej dekady udowodniona jako niezwykle pomocna w zrozumieniu reakcji biologicznych. Badanie oddziaływań molekularnych z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w głębi komórek pozostawało wyzwaniem ze względu na naturalnie słabe sygnały pochodzące od poszczególnych cząsteczek. Niedawne prace Yang i współpracowników wykazały, że mikroskopia epifluorescencyjna w wąskim polu pozwala na wizualizację transportu nukleocytoplazmatycznego na poziomie pojedynczych cząsteczek. Dzięki podejściu opartemu na pojedynczych cząsteczkach uzyskano istotne dane kinetyczne, takie jak czas i wydajność transportu jądrowego dla cząsteczek ładunku zależnych i niezależnych od sygnału. W niniejszej pracy opisaliśmy protokół podejścia metodologicznego z poprawioną rozdzielczością czasoprzestrzenną wynoszącą odpowiednio 0,4 ms i 12 nm. Poprawiona rozdzielczość umożliwiła nam zarejestrowanie przejściowych zdarzeń aktywnego transportu i dyfuzji pasywnej przez kompleksy porów jądrowych (NPC) w komórkach półzachowanych. Przewidujemy, że metoda ta znajdzie zastosowanie w wyjaśnianiu innych zdarzeń wiązania i transportu wewnątrzkomórkowego.

Protokół

1. Przygotowanie układu komórkowego do eksperymentu z pojedynczymi cząsteczkami

1. Przynajmniej tydzień wcześniej należy rozpocząć hodowlę świeżej kultury linii komórkowej HeLa z zapasu poprzez rozmrożenie w 37°C i umieszczenie w 25 cm² kolba hodowlana z 5 ml pożywki, inkubować komórki w 37°C w atmosferze 5% CO₂ inkubować przez 24 godziny i pasażować co najmniej 3 razy, aby zapewnić komórkom optymalne warunki. Komórek nie należy jednak pasażować więcej niż 20 razy ze względu na tendencję do znacznego spowolnienia tempa ich wzrostu. Komórki HeLa zostały wcześniej zmodyfikowane genetycznie tak, aby GFP (białko fluorescencyjne zielone) było połączone z białkiem membrany porów otoczki jądrowej POM 121. Jest to niezbędne do precyzyjnej lokalizacji otoczki jądrowej.
2. Na dzień przed eksperymentem komórki przeznaczone do eksperymentu z pojedynczą cząsteczką należy wysiać na autoklawowaną lamellkę umieszczoną w sterylnej szalce Petriego. Lamellkę należy zanurzyć w DMEM (pożywka Eagle’a modyfikowana przez Dulbecco, Grand Island, NY) uzupełnionej o 4,5 g/L glukozy, 862 mg/L GlutaMAX-I, 15 mg/mL czerwieni fenolowej, 100 U/mL penicyliny, 100μg/mL streptomycyną i 10% płodową surowicą z noworodka cielęcia. Objętość hodowli powinna wynosić 1 ml na szkiełko nakrywkowe, rozmieszczoną równomiernie na całej powierzchni. Płytki Petri ze szkiełkami nakrywowymi są następnie umieszczane w CO₂ inkubatorze i przechowywano przez 24 godziny przed eksperymentem. Aby hodowla komórkowa nadawała się do eksperymentu z pojedynczymi cząsteczkami, konfluencja komórek na szkiełku podstawowym nie powinna przekraczać 70%, co zapewnia odpowiednią swobodę przepływu buforów płuczących oraz białek zainteresowania podlegających transportowi jądrowemu.
3. W dniu eksperymentu przygotowano komory przepływowe, dodając szkiełko nakrywkowe oraz dwie linie smaru silikonowego pełniące funkcję dystansów. Należy upewnić się, że komórki nie wyschną podczas przygotowania. Zazwyczaj preferujemy wykonanie dwóch komór na jednym szkiełku nakrywowym, aby umożliwić zastosowanie dwóch różnych warunków eksperymentalnych. Górne szkiełka nakrywkowe — małe fragmenty szkła wycięte nożem diamentowym o powierzchni około 6 mm² — umieszczono odwrócone stroną górną do dołu na chusteczce Kimwipe. Dwie linie smaru silikonowego nanieśliśmy precyzyjnie wzdłuż krawędzi szkiełek nakrywek za pomocą plastikowej strzykawki o pojemności 10 ml, do której szczelnie przymocowano za pomocą Parafilmu końcówkę do pipety, aby kontrolować wielkość kropel smaru.
4. Prześlizg pokryty komórkami HeLa został następnie wysuszony poprzez odparowanie kropel i zamontowany za pomocą smaru pełniącego rolę kleju w samodzielnie wykonanej aluminiowej ramce hartowanej, która służyła do utrzymania prześlizgu w uchwycie na próbki mikroskopu.
5. Przykrywkę z dwiema liniami smaru podniesiono pęsetą z ostrym końcem, a następnie odwrócono i nałożono na szkiełko z naniesioną warstwą komórek, tworząc komorę przepływową. Stabilne mocowanie uzyskano poprzez delikatne dociśnięcie krawędzi przykrywki w miejscach nałożenia smaru.
6. Ponieważ na jednym szkiełku pokrytym komórkami przygotowano dwie oddzielne komory, niezbędne jest zapewnienie szczelności w celu zapobiegania kontaminacji krzyżowej. W tym celu między komorami, od górnej do dolnej krawędzi szkiełka, nanieś kilka linii smaru silikonowego, aby je od siebie odizolować. Kilka linii smaru należy nanieść również na zewnętrzne krawędzie komór.
7. Następnie do komory przepływowej dodano pożywkę DMEM, aby zapobiec wysychaniu komórek. Przepływ roztworu wymuszono za pomocą niewielkiego kawałka papieru filtracyjnego, który absorbował ciecz z wylotu komór przepływowych. Przy zachowaniu stabilności dłoni roztwór można było dodawać mikropipetą do jednej strony komory przepływowej jedną ręką, jednocześnie absorbując go papierem filtracyjnym z drugiej strony.
8. Po przygotowaniu preparatu spód szkiełka przedmiotowego przemyto zwilżonym patyczkiem bawełnianym – dwukrotnie wodą, a następnie dwukrotnie 100% etanolem.
9. Po umieszczeniu preparatu na mikroskopie, komórki przemyto 2 X 25 μL bufor importujący (20 mM Hepes, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7,3). Następnie komórki permeabilizowano przez ok. 2 minuty za pomocą 2 X 25 μL 40 μg/mL digitonin w buforze do importu i ponownie przemyto 2 x 25 μL bufor importowy (20 mM HEPES, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7,3) uzupełniony o 1,5% poliwinilopirolydonu (PVP; 360 kDa). Może być konieczne monitorowanie permeabilizacji w czasie rzeczywistym przy użyciu jasnego pola. PVP dodawano do wszystkich roztworów buforu importowego po zastosowaniu digitoniny, aby zapobiec osmotycznemu pęcznieniu jąder. Nienaruszone jądro, wraz z kontrolowanym środowiskiem cytoplazmatycznym, stanowi znacznie uproszczony system transportowy, który pozwala na krokowe wyjaśnienie skomplikowanego transportu jądrowego. Wcześniejsze eksperymenty zespołowe oraz jedno cząsteczkowe przeprowadzone w tym systemie dostarczyły cennych informacji na temat transportu jądrowego.

2. Przygotowanie kluczowych białek do eksperymentu transportu jądrowego

1. Za pomocą konwencjonalnej transformacji bakteryjnej zmodyfikowano specjalne szczepy E.coli (JM109) w celu nadekspresji genów odpowiedzialnych za produkcję wspomnianych białek docelowych; szczepy te przechowywane są w temperaturze -80°C. (W przypadku NLS-2xGFP zastosowano wektor pTrcHisB firmy Invitrogen). Pętlę lub ok. 50 μL zamrożonych kultur komórek E.coli eksprymujących białka fluorescencyjne lub cargo przeniesiono do 5 mL pożywki LB z dodatkiem 5 μL ampicyliny (U 1000) i inkubowano tlenowo z wytrząsaniem przez noc w temperaturze 37°C przy 225 rpm.
2. Po 24 godzinach 500 μL nasyconej kultury przeniesiono do 500 mL pożywki LB i inkubowano w inkubatorze w temperaturze 37°C z wytrząsaniem przez 5-6 godzin po dodaniu 250 μL IPTG (izopropyl-β-D-1-tiogalaktopiranozyd), a następnie inkubowano przez kolejne 5-6 godzin. Jest to konieczne, ponieważ IPTG jest metabolitem laktozy, który wyzwala transkrypcję operonu lac, w którym gen lacZ został zastąpiony genem docelowym, a IPTG służy następnie do indukcji ekspresji genu.
3. Kulturę wirowano następnie w chłodzącej wirówce wysokoobrotowej przy 12000 rpm przez 15 minut, po czym odrzucono nadsącz. Komórki resuspendowano w 40 mL roztworu CelLytic B (CelLytic B zapewnia szybką i wydajną ekstrakcję białek nadających się do oczyszczania powinowactwem i analizy). Objętość powinna wynosić 10 mL na 1 gram osadu. W celu rozbicia mostków dwusiarczkowych dodano 28 μl merkaptoetanolu oraz 400 μl fluorku fenylometanosulfonylowego, aby dezaktywować proteazy zapobiegając trawieniu białek docelowych po lizie komórek. Dodano również „koktajl proteazowy” (400 μL pepstatyny A 0,2 mg/mL, 400 μL leupeptyny 0,2 mg/mL, 400 μL inhibitora trypsyny 2 mg/ml), aby zapewnić, że ekstrakty białkowe nie ulegną degradacji przed analizą białek docelowych. Następnie dodano 400 μL 1M imidazolu, stosowanego do elucji białek z etykietą związanych z jonami Ni przytwierdzonymi do powierzchni kulek w kolumnie chromatograficznej, oraz 1 mM DNazy I, stosowanej do degradacji niepożądanego jednoniciowego i dwuniciowego DNA do fragmentów 5'-fosfodinukleotydowych i oligonukleotydowych.
4. Mieszaninę mieszano w ciemności na lodzie przez 30 minut, aby zapewnić odpowiedni czas reakcji, a następnie wirowano przy 10000 rpm przez 60 minut w chłodzącej wirówce. Zebrano nadsącz i w celu przygotowania do chromatografii przeprowadzono infuzję z Ni-NTA (nickel-nitrilotriacetic acid Superflow firmy Qiagen), wirowując w probówkach do mikrowirówki z maksymalną prędkością przez 3 minuty i przemywając buforem do lizy; powtarzano wirowanie i przemywanie, aż mieszanina straciła niebieski odcień. Uzyskaną mieszaninę mieszano powoli w ciemnym pojemniku na lodzie przez 60 minut.
5. Przeprowadzono chromatografię kolumnową, zbierając 12 frakcji w następujący sposób: pierwsza frakcja to przelot 10 mL nadsączu zmieszanego z Ni-NTA w poprzednim kroku; druga to 10 mL buforu do lizy (50 mM fosforanu sodu, 300 mM NaCl, 20 mM imidazolu, pH 8,0); trzecia to 10 mL buforu (10 mM imidazolu, 100 mM NaCl, pH 8,0); czwarta i pozostałe to po 0,5 mL buforu elucyjnego (250 mM imidazolu, 100 mM NaCl, pH 8,0).
6. Przygotowano żel poliakryloamidowy do SDS-PAGE oraz przygotowano próbki, mieszając 4 μL frakcji i 1 μL 5X SB (300 mM Tris 6,8, 25% BME, 10% SDS, 50% glicerolu). Jako standardu użyto drabinki DNA 100 kb firmy Invitrogen. Przed nałożeniem próbki gotowano przez 5 minut. Po nałożeniu elektroforezę prowadzono przy 120 V przez 60 minut. Następnie żel barwiono, odbarwiano i ostatecznie suszono w specjalnej suszarce do żeli przez 2 godziny w temperaturze 80°C.
7. Następnie przeanalizowano wyniki na żelu i zlokalizowano frakcje, które dały najlepszy rezultat. W zależności od białka docelowego, prążki powinny znajdować się zgodnie z wielkością białka. Frakcję tę należy wybrać do dalszego oczyszczania białek za pomocą MonoQ i Superdex 200 (Amersham Pharmacia).
8. Koncentrację przeprowadzono poprzez wirowanie najbardziej stężonych frakcji w filtrach Nanosep o rozmiarze porów 10K przy 14 rpm przez 5 minut, przemywając je za każdym razem buforem elucyjnym. Konieczne jest określenie końcowego stężenia białka za pomocą testu BSA w celu przeprowadzenia dalszej procedury znakowania białek.
9. Wewnętrzna zielona fluorescencja NLS-2xGFP nie może być wykorzystana do obrazowania pojedynczych cząsteczek transportu jądrowego ze względu na niską fotostabilność i nakładanie się widma z autofluorescencją komórki. Dlatego znakujemy cząsteczki cargo nadmiarem organicznego barwnika reaktywnego wobec cysteiny (maleimid Alexa555 lub Alexa 647 firmy Molecular Probes) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w 50 mM fosforanie sodu i 150 mM NaCl, po redukcji za pomocą TCEP tris (2-karboksyetylu) przez 20 minut. Reakcje zatrzymano za pomocą 2-merkaptoetanolu, a roztwory białek poddano dializie w celu usunięcia wolnego barwnika.

3. Mikroskopia pojedynczych cząsteczek

1. Nasz zestaw mikroskopowy obejmuje Olympus IX81 wyposażony w obiektyw imersyjny olejowy 100x o aperturze numerycznej 1.4 NA (UPLSAPO 100XO, Olympus), laser He-Ne 633 nm o mocy 35 mW (Melles Griot), lampę rtęciową z zestawem filtrów GFP, kamerę CCD z wzmocnieniem mnożnikowym na chipie (Cascade 128+, Roper Scientific) oraz pakiet oprogramowania Slidebook (Intelligent Imaging Innovations) do akwizycji i przetwarzania danych. Do generowania trybu włącz/wyłącz wzbudzenia laserowego użyto przerywacza optycznego (Newport). Fluorescencję GFP i Alexa647 wzbudzano odpowiednio lampą rtęciową oraz laserem 633 nm. Emisję fluorescencji zielonej i czerwonej zbierano tym samym obiektywem, filtrowano za pomocą filtra dichroicznego (Di01-R405/488/561/635-25x36, Semrock) oraz filtra emisyjnego (NF01-405/488/561/635-25X5.0, Semrock), a następnie obrazowano za pomocą identycznej kamery CCD.
2. W eksperymentach z pojedynczymi cząsteczkami zapewniamy, aby czas fotowybielania fluorescencji pojedynczej cząsteczki ładunku był dłuższy niż czas transportu. Aby określić czas fotowybielania, cząsteczki ładunku o stężeniu 0.1 nM naniesiono na szklaną lamellkę, gdzie po 30 minutach stały się nieruchome w wyniku niespecyficznej adsorpcji. Następnie zmierzono przebieg czasowy fluorescencji. W zależności od badanego białka czasy fotowybielania będą się różnić w zależności od liczby cystein zdolnych do reakcji z maleimidami, dlatego natężenie i obszar oświetlenia należy dostosować tak, aby nie wywołać przedwczesnego fotowybielania i zapewnić, że cząsteczki ładunku znakowane Alexa 647 wykazują fluorescencję przez czas dłuższy niż interakcja ładunków z NPC.
3. W eksperymentach z importem w komórkach permeabilizowanych ładunek i niezbędne kofaktory transportowe dodawano razem. Typowe reakcje importu ładunku zawierały 1 mM GTP, 0.5 μM Importyny-, 0.5 μM Importyny- 1, 2 μM Ran oraz 1 μM NTF2 dla transportu ułatwionego oraz 0.1 nM Dekstranu 10KDa dla transportu pasywnego. Stężenia fluorescencyjnego ładunku wynosiły > 100 nM w eksperymentach zbiorczych i ~ 100 pM w analizach pojedynczych cząsteczek. Przy tych stężeniach oczekiwano, że >99% ładunku utworzy kompleksy z Importyną i Importyną. Szybkość transportu monitorowano za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej (jeśli istotne były tylko szybkości względne) lub konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej (jeśli pożądane były szybkości bezwzględne).
4. Najpierw pozycję otoczki jądrowej określono za pomocą szerokopolowej mikroskopii epifluorescencyjnej, używając lampy rtęciowej HBO z zestawem filtrów GFP do wykonania zdjęcia NE. Intensywności pikseli w rzędzie lub kolumnie znajdujących się w przybliżeniu prostopadle do NE dopasowano do rozkładu Gaussa. Pozycje szczytowe funkcji Gaussa dla danego zestawu intensywności pikseli uznano za pozycję NE dla tego rzędu i kolumny. Pozycje szczytowe serii takich funkcji Gaussa dopasowano następnie wielomianem drugiego stopnia, co pozwoliło wyznaczyć przebieg NE w całym obrazie.
5. Po zlokalizowaniu NE niezbędne jest usunięcie całej autofluorescencji za pomocą lasera He-Ne 633 nm aż do jej całkowitego fotowybielenia; zazwyczaj wystarczające jest 60 sekund.
6. Cząsteczki próbek należy następnie przechowywać w 1.5% roztworze PVP, a mieszaninę dodać do komory przepływowej w objętości 25 L, a następnie przeciągnąć przez komorę, stosując knot z papieru filtracyjnego. Należy zachować szczególną ostrożność podczas dodawania białek ładunku importowego do permeabilizowanych komórek bezpośrednio po lokalizacji otoczki jądrowej, ponieważ ostrość może zostać łatwo zaburzona przez każdy gwałtowny ruch.
7. Niezwłocznie po dodaniu cząsteczek ładunku użyto lasera He-Ne 633 nm do oświetlenia trajektorii transportu przechodzących cząsteczek. Przerywacz optyczny (Newport) należy ustawić na około 5 Hz, aby uniknąć fotowybielania spowodowanego wysoką gęstością mocy lasera, a także aby umożliwić nowej porcji niefotowybielonych pojedynczych cząsteczek zbliżenie się do NE. Serię filmów z translokacjami pojedynczych cząsteczek należy zarejestrować za pomocą szybkiej kamery CCD, która może pracować z częstotliwością do 2500 Hz.

4. Reprezentatywne wyniki

Przy prawidłowym wykonaniu nasz protokół pozwolił na zarejestrowanie serii filmów demonstrujących translokację pojedynczych cząsteczek ładunku oddziałujących z kompleksem porów jądrowych w permeabilizowanych komórkach HeLa POM 121 (Rys. 1). Naszym celem było obrazowanie i śledzenie przejściowych etapów transportu cząsteczek dekstranu przez NPC w komórkach HeLa permeabilizowanych digitoniną, stabilnie eksponujących GFP-POM121. Komórki inkubowano z niskimi stężeniami znakowanych cząsteczek dekstranu. Płaszczyznę równikową jądra ustawiono w ostrości, uzyskując wyraźny obraz zielonego pierścienia fluorescencji GFP wzbudzanej światłem lampy rtęciowej o długości fali 488 nm. Długi czas ekspozycji GFP-NE umożliwia uzyskanie doskonałego stosunku sygnału do szumu (SNR) w celu zlokalizowania płaszczyzny środkowej NE. Wcześniej stwierdzono, że cząsteczki dekstranu 10 kDa dyfundują przez NE w czasie około 2 ms przy rozdzielczości przestrzennej około 20-40 nm i częstotliwości klatek detekcji wynoszącej 500 lub 1000 Hz. Taka rozdzielczość czasoprzestrzenna pozwala na zarejestrowanie zaledwie jednego do dwóch kroków dyfuzji cząsteczek dekstranu przez NPC, co jest niewystarczające do wyjaśnienia szerszych informacji przestrzennych dotyczących dyfuzji pasywnej. Aby zarejestrować dokładniejsze etapy ruchu cząsteczek dekstranu w obrębie NPC przy lepszej rozdzielczości czasoprzestrzennej, wprowadziliśmy dwie główne ulepszenia: (i) zastosowanie szybszej częstotliwości klatek detekcji 2500 Hz w celu uchwycenia dokładniejszych kroków dyfuzji oraz (ii) zastosowanie wyższej gęstości optycznej oświetlenia, aby wzbudzić więcej fotonów z pojedynczych cząsteczek w celu uzyskania wyższej rozdzielczości przestrzennej. Ulepszenia te umożliwiły nam zarejestrowanie wielu etapów przejściowej dyfuzji cząsteczek dekstranu znakowanych alexa647 przez NE przy użyciu światła lasera 633 nm o natężeniu 100 kW/cm² z rozdzielczością czasoprzestrzenną 12 nm i 400 ms.

Jak pokazano na Rysunku 1, zarejestrowano serię obrazów statycznych typowych zdarzeń transportu cząsteczek dekstranu. Poprzez śledzenie trajektorii przestrzennych poszczególnych przechodzących cząsteczek dekstranu wyróżniono drobne etapy dyfuzji przez NE. Stwierdzono, że około 30% zdarzeń oddziaływania z NE ma rozpoznane przedziały początkowe i docelowe. spośród nich cząsteczki dekstranu przemieszczające się z cytoplazmy do NE mają dwa cele: kończą w jądrze po dyfuzji przez NE lub wracają do cytoplazmy po oddziaływaniu z NE. Podobne sytuacje wystąpiły w przypadku zdarzeń eksportu: cząsteczki dekstranu startujące z jądra przedostają się do cytoplazmy lub dyfundują z powrotem do jądra po oddziaływaniu z NE. Takie serie obrazów zawierają informacje o położeniu przestrzennym pojedynczych cząsteczek względem NPC, a także informacje czasowe dotyczące czasu przebywania cząsteczek w NPC. Poprzez analizę trajektorii cząsteczek dekstranu w obszarze NE można określić czas transportu, wydajność oraz częstotliwość wchodzenia. Czas transportu w naszej pracy można zidentyfikować jako czas importu lub eksportu. Zdefiniowano go jako średni czas przebywania cząsteczek dekstranu w NPC, które podlegają importowi lub eksportowi. Wydajność importu lub eksportu zdefiniowano jako procent pełnych zdarzeń importu lub eksportu w stosunku do sumy zdarzeń pełnych i przerwanych. Częstotliwość wchodzenia w imporcie lub eksporcie odnosi się do liczby cząsteczek oddziałujących z NE w ciągu jednej sekundy.

Rycina 1. Wybrane klatki wideo typowych zdarzeń transportu cząsteczek dekstranu przez NE. (A) Zdarzenie transportu z cytoplazmy do jądra. Pojedyncza cząsteczka dekstranu (czerwona plamka) rozpoczęła ruch w cytoplazmie, weszła w interakcję z NE (zielona linia pikseli) i zakończyła ruch w jądrze. Trajektorie zdarzenia (niebieskie linie i puste kropki) zostały wyznaczone i nałożone na NE (czarna linia). Zielona i czerwona linie reprezentują odległość 100 nm od NE po stronie cytoplazmy i jądra. C, cytoplazma. N, jądro. Pasek skali: 2 mm. (B) Zdarzenie transportu z cytoplazmy do cytoplazmy. (C) Zdarzenie transportu z jądra do jądra. (D) Zdarzenie transportu z jądra do cytoplazmy.

Dyskusja

Należy zadbać o zapewnienie właściwej kolokalizacji NE oraz pojedynczych cząsteczek podczas eksperymentu. Istotne jest również zapewnienie wysokiego stosunku sygnału do szumu, szczególnie gdy sygnał jest niski z powodu słabego znakowania lub fotoblaknięcia. Precyzja lokalizacji jest ograniczona przez szum tła (wynikający z fluorescencji poza ogniskową, szumu odczytu CCD, prądu ciemnego i innych czynników).