Metoda izolacji błon zewnętrznych Francisella tularensis

Podsumowanie

Protokół oddzielania błon wewnętrznych i zewnętrznych Francisella tularensis poprzez sferoplastykę, lizę osmotyczną i ultrawirowanie w gradiencie gęstości sacharozy.

Streszczenie

Francisella tularensisjest Gram-ujemnym wewnątrzkomórkowym pałeczkowcem i czynnikiem etiologicznym tularemii, choroby odzwierzęcej. W porównaniu z innymi patogenami bakteryjnymi, niezwykle niska dawka zakaźna (<10 CFU), szybki postęp choroby oraz wysokie wskaźniki zachorowalności i śmiertelności sugerują, że wirulentne szczepyFrancisellakodują nowe czynniki wirulencji. Wykazano, że cząsteczki eksponowane na powierzchni, a mianowicie białka błony zewnętrznej (OMPs), sprzyjają wiązaniu bakterii do komórek gospodarza, ich wnikaniu, przeżywalności wewnątrzkomórkowej, wirulencji oraz unikaniu odpowiedzi immunologicznej. Znaczenie badania OMPs jest dodatkowo podkreślane przez fakt, że mogą one służyć jako ochronne szczepionki przeciwko wielu chorobom bakteryjnym. Choć OMPs można ekstrahować z bakterii gram-ujemnych za pomocą technik masowej ekstrakcji błon, w tym sonikacji komórek z następującą po niej wirówką i/lub ekstrakcji detergentem, preparaty te są często zanieczyszczone białkami periplazmatycznymi i/lub zanieczyszczeniami z błony cytoplazmatycznej (wewnętrznej) (IM). Przez lata „złotym standardem” metody biochemicznej i biofizycznej separacji błon wewnętrznych (IM) i zewnętrznych (OM) bakterii gram-ujemnych było poddawanie bakterii sferoplastyce i lizie osmotycznej, a następnie wirowaniu w gradiencie gęstości sacharozy. Po nałożeniu na gradient sacharozy, OM mogą zostać oddzielone od IM na podstawie różnic w gęstości wyporności, co prawdopodobnie wynika głównie z obecności lipopolisacharydu (LPS) w OM. W niniejszej pracy opisujemy rygorystyczną i zoptymalizowaną metodę ekstrakcji, wzbogacania i izolacjiF. tularensisbłony zewnętrzne oraz powiązane z nimi OMP.

Protokół

Dzień 1: Inokulacja płytek F. tularensis

1. Wysiać zamrożone kultury stokowe F. tularensis na agar Mueller-Hinton uzupełniony o 2,5% (vol/vol) surowicy z cieląt donora, 2% (vol/vol) IsoVitaleX, 0,1% (wt/vol) glukozy oraz 0,025% (wt/vol) pirofosforanu żelaza. Hodować F. tularensis w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO₂ przez około 24 h.

Dzień 2: Inokulacja F. tularensis w pożywce płynnej

1. Przygotować i wysterylizować w autoklawie 1 litr podłoża Mueller-Hinton z dostosowaną zawartością kationów (zawierającego 1,23 mM chlorku wapnia dwuwodnianego i 1,03 mM chlorku magnezu sześciowodnianego). Po ochłodzeniu do 37°C uzupełnić podłoże o 0,1% (mas/obj) glukozy, 0,025% (mas/obj) pirofosforanu żelaza oraz 2% (obj/obj) IsoVitaleX. Podłoże wysterylizować przez filtr (0,22 μ) i rozdzielić na dwie porcje po 500 ml.
2. Odlać 12 ml uzupełnionego podłoża Mueller-Hinton i przenieść do sterylnej probówki Falcon o pojemności 50 ml.
3. Za pomocą sterylnej pętli szczepiącej o pojemności 10 μ pobrać znaczną ilość wzrostu F. tularensis z płytek agarowych (z Dnia 1) i przenieść bakterie do 12 ml podłoża Mueller-Hinton (patrz Krok 2). Kilkakrotnie pipetować roztwór, aby rozbić grudki i przygotować jednorodną zawiesinę bakteryjną. Nie używać wortexa.
4. Za pomocą sterylnej pipety zaszczepić każde naczynie o pojemności 500 ml 5 ml zawiesiny bakteryjnej z Kroku 3. Hodować kultury w bulionie w temperaturze 37°C przez 14 do 18 h przy delikatnym wytrząsaniu (190-200 rpm na wytrząsarce New Brunswick serii Innova 2300).

Dzień 3: Sferoplastyka, liza osmotyczna i wirowanie w gradiencie gęstości sacharozy

1. Uzyskać *F. tularensis* wyjmij kultury z inkubatora wytrząsowego i pobierz 1-ml alikwot z każdej 500-ml kultury w celu sprawdzenia odpowiednich gęstości optycznych. Optymalne wyniki ekstrakcji membranowej i izolacji uzyskano przy zastosowaniu *F. tularensis* komórki we wczesnej fazie logarytmicznej wzrostu, co koreluje z wartością OD₆₀₀ od 0,2 do 0,4 (~10⁷ do 10⁸ CFU/ml). Kultury o OD₆₀₀ wartość poniżej 0,2 nie zapewni wystarczającej ilości całkowitego materiału błonowego do późniejszego zastosowania w gradientach sacharozy. Z kolei hodowle o OD₆₀₀ stwierdzono, że wartości powyżej 0,4 (zbliżanie się do fazy stacjonarnej) prowadzą do uzyskania mieszanych fuzji błon.
2. Wirować hodowle z prędkością 7 500 x g przez 30 min w temperaturze 15°C w celu zebrania komórek. Zaleca się wirowanie kultur w czterech butelkach wirówkowych o pojemności 250 ml, ponieważ ułatwia to późniejszą resuspensję osadu.
3. Ostrożnie usuń nadsącz z pożywki z każdej butelki do wirowania, a następnie mocno uderz butelkami o materiał chłonny, aby usunąć nadmiar pożywki hodowlanej.
4. W ciągu 10 min po zakończeniu wirowania każdy osad bakteryjny należy zawiesić w 8,75 ml 0,75 M sacharozy (w 5 mM Tris, pH 7,5). Wszystkie cztery osady bakteryjne powinny zostać zawieszone i przeniesione (łącznie 35 ml zawiesiny bakteryjnej) do sterylnej kolby o pojemności 250 ml (z małym mieszadełkiem magnetycznym) w ciągu 10 min.
5. Podczas delikatnego mieszania zawiesiny komórkowej na mieszalce magnetycznej powoli dodaj 70 ml (2 objętości) 10 mM EDTA dwusodowego (w 5 mM Tris, pH 7,8) w ciągu 10 min. Roztwór EDTA należy dodawać tak, aby końcówka pipety znajdowała się poniżej poziomu zawiesiny komórkowej, aby uniknąć powstania wysokich lokalnych stężeń EDTA. Prędkość obrotowa mieszadła powinna być wystarczająca do dokładnego wymieszania zawiesiny komórkowej, lecz nie na tyle duża, aby doprowadzić do spienienia lub powstania pęcherzyków powietrza. Po dodaniu roztworu EDTA inkubuj go przez 30 min w temperaturze pokojowej.
6. Po 30-minutowej inkubacji powoli dodać 11 ml (1/10^th objętość) roztworu lizozymu o stężeniu 2 mg/ml do końcowego stężenia 200 μg/mlKontynuuj mieszanie zawiesiny komórkowej podczas dodawania roztworu lizozymu. Jak wspomniano powyżej, dodawaj roztwór lizozymu tak, aby końcówka pipety znajdowała się poniżej poziomu cieczy zawiesiny komórkowej, aby uniknąć powstania wysokich lokalnych stężeń lizozymu. Roztwory stokowe lizozymu (2 mg/ml) można przygotować w jednorazowych alikwotach i przechowywać w temperaturze -20°C przez trzy do czterech miesięcy. Otrzymany roztwór inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej.
7. Podczas 30-minutowej inkubacji przygotować sterylną kolbę o pojemności 1 l z małym mieszadełkiem magnetycznym i 530 ml wody dH Cellgro Molecular Grade o temperaturze pokojowej.₂O (4,5 obj.).
8. Przeprowadzić lizę osmotyczną zawiesiny komórkowej (z kroku 6) poprzez powolne rozcieńczanie (przepływ około 11 ml/min) w 530 ml wody destylowanej klasy molekularnej (Molecular Grade dH2O).₂O (z kroku 7) w ciągu 10 do 15 min przy łagodnym mieszaniu. Ze względu na większą objętość roztworu w tym kroku, należy zwiększyć prędkość mieszadła magnetycznego, aby zapewnić prawidłowe mieszanie. Mieszadło powinno obracać się z prędkością wystarczającą do całkowitego rozproszenia zawiesiny komórkowej po dodaniu jej do dH₂W tempie umiarkowanym, jednak niewystarczająco szybkim, aby doprowadzić do spienienia lub powstania pęcherzyków. Należy dodać zawiesinę komórkową, opierając końcówkę pipety o dno kolby, w bezpośrednim sąsiedztwie magnesu mieszającego, aby ułatwić jednorodne rozcieńczenie zawiesiny. Stwierdzono, że na tym etapie najlepiej sprawdzają się pipety o pojemności 25 ml. Należy uważnie monitorować proces rozcieńczania i w razie potrzeby przerywać przepływ, aby rozproszyć lokalne skupiska komórek, aglomeraty oraz pasma komórkowe. Otrzymany roztwór inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej. Należy zauważyć, że krok ten wydaje się być jednym z najtrudniejszych i najbardziej krytycznych dla ogólnego sukcesu eksperymentu.
9. Po 30-minutowej inkubacji przenieś 40-ml aliquoty roztworu do lizy osmotycznej do 50-ml probówek stożkowych i wiruj przy 7500 x g przez 30 min w temperaturze 10°C aby usunąć nieuszkodzone komórki oraz debris.
10. Po odwirowaniu należy ostrożnie pobrać od 27 do 30 ml supernatantu z każdej probówki stożkowej i połączyć supernatanty w sterylnej kolbie o pojemności 1L.
11. Przenieś po 25 ml połączonego supernatantu do 16 probówek do ultrawirowania i wiruj przy 200 000 x g (44 400 obr./min w wirniku do ultrawirówki FiberLite F50L-8x39) przez 2 h w temperaturze 4°CNależy pamiętać, że każdy wirnik mieści 8 probówek, zatem ten krok wymaga zastosowania dwóch wirników i dwóch ultrawirówek. Alternatywnie, drugi zestaw 8 probówek należy przechowywać w 4°C do momentu wirowania.
12. W ciągu 10 min od zakończenia wirowania w ultrawirowarce należy przygotować zmodyfikowany bufor do resuspensji błon. Przenieść 8 ml buforu do suspensji błon (25% [masowych] sacharoza, 5 mM Tris, 30 mM MgCl₂) do sterylnej probówki i dodać 1 tabletkę koktajlu inhibitorów proteaz bez EDTA oraz 375 U Benzonazy. Delikatnie wymieszać roztwór, aby rozpuścić tabletkę inhibitora proteaz.
13. Po ultrawirowaniu ostrożnie zlej nadsączyny, odwróć probówki do ultrawirowania na materiale chłonnym i energicznie opukaj probówki, aby usunąć nadmiar nadsączyny. Zaznacz markerem miejsce każdego osadu błonowego, aby ułatwić jego wizualizację. Delikatnie resuspenduj osiem osadów błonowych w 600 μl każdego zmodyfikowanego buforu do resuspensji błon. Przenieś każdą resuspensję błon do kolejnego zestawu ośmiu probówek, delikatnie zresuspenduj te osiem pelletów, a następnie połącz otrzymane resuspensje błon w sterylnej probówce. Pellety błon są trudne do resuspensji, dlatego należy kontynuować przepuszczanie zmodyfikowanego buforu do resuspensji błon przez pellet, aż ten oddzieli się od ścianki probówki. Często konieczne jest użycie końcówki mikropipety do zeskrobania pelletu błony ze ścianki probówki i wspomagania procesu resuspensji. Podczas pipetowania należy unikać pienienia się lub tworzenia pęcherzyków powietrza. Należy zauważyć, że krok ten wydaje się być jednym z najtrudniejszych i krytycznych dla ogólnego sukcesu eksperymentu.
14. Po resuspensji i usunięciu osadów błonowych ze wszystkich 16 probówek, przemyj każdą grupę czterech probówek za pomocą 600 μl zmodyfikowanego buforu do resuspensji błon. Płukanie powinno być skoncentrowane wokół zaznaczonego obszaru (osadu błonowego) w każdej probówce. Przenieś płuczkę do probówki z buforem do resuspensji błon. Powtórz etap płukania dla pozostałych trzech zestawów czterech probówek.
15. Inkubować resuspensję membrany przez 30 min w temperaturze pokojowej, delikatnie kołysząc naczyniem, aby zdegradować DNA i wspomóc redukcję materiału kłaczkowatego.
16. Pobrać niewielką alikwot zawiesiny błon i przeprowadzić oznaczanie ilości białka w celu określenia całkowitej wydajności uzyskania błon. Zazwyczaj przygotowujemy próbki błon nierozcieńczone, rozcieńczone 1:1 (w 2,5% SDS) oraz rozcieńczone 1:3 (w 2,5% SDS), a następnie poddajemy próbki działaniu ciepła w temperaturze 90°C przez 10 min, a następnie należy użyć testu BioRad DC Protein Assay w celu ilościowego oznaczenia stężenia białek w resuspensji błon. Całkowita wydajność białka wynosi zazwyczaj od 1,0 mg/ml do 1,6 mg/ml. Zastosowanie ciepła oraz SDS jest niezbędne do uwolnienia białek błonowych zewnętrznych (OMP) z wyekstrahowanych błon, co pozwala na uzyskanie dokładniejszej wartości oznaczenia białka.
17. Przygotuj liniowe gradienty sacharozy, nakładając kolejno po 1,8 ml roztworów sacharozy (masowych, przygotowanych w 5 mM EDTA, pH 7,5) do probówek do ultrawirówki Ultra-Clear o wymiarach 14 x 95 mm w następującej kolejności: 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%. Nakładanie gradientów sacharozy jest najłatwiejsze przy użyciu pipety z gruszką, a nie pipety automatycznej.
18. Na podstawie oznaczania ilości białka w resuspensji błon (krok 16), nanieś 1,5 mg resuspensji błon na górę każdego gradientu. Każda probówka do ultrawirówki o wymiarach 14 x 95 mm ma maksymalną pojemność 12,5 ml; biorąc pod uwagę, że 10,8 ml stanowią roztwory sacharozy z kroku 17, nie należy nanosić więcej niż 1,7 ml resuspensji błon na jeden gradient. Zważ każdą probówkę z gradientem sacharozy i ostrożnie skoryguj jej końcową masę (poprzez dodanie lub usunięcie resuspensji błon), tak aby wszystkie probówki miały taką samą masę (± 0,01 g).
19. Przenieś gradienty sacharozy do rotora z ruchomymi koszyczkami SW-40Ti i wiruj przy 256 000 x g (38 000 obr./min) przez minimum 17 h w temperaturze 4°C.

Dzień 4: Pobieranie frakcji z gradientu sacharozy

1. Po 17 h wirowania zatrzymaj wirówkę i ostrożnie wyjmij gradienty sacharozy z rotora SW-40Ti.
2. Ostrożnie przemyj dno probówki z gradientem sacharozy 70% etanolem, przebij dno probówki igłą 21g i zbierz sekwencyjne frakcje o objętości 500 μl z gradientu do sterylnych probówek do mikrowirówki. Powtórz czynność dla kolejnych gradientów. Należy pozwolić na spływanie gradientu pod wpływem siły grawitacji, aby nie zaburzyć struktury gradientu sacharozy. Jeśli jednak kapanie z dna probówki ustanie, można lekko nacisnąć górę probówki palcem.
3. Wyznacz współczynnik załamania światła dla każdej frakcji gradientu sacharozy za pomocą refraktometru i przypisz współczynnik załamania do konkretnej gęstości w g/ml ¹. Oceń lokalizację białek, przygotowując reprezentatywne frakcje gradientu sacharozy (przyrosty gęstości 0,01; od 1,11 g/ml do 1,26 g/ml) do rozdziału metodą SDS-PAGE, transferu na membranę nitrocelulozową i immunoblottingu.

Reprezentatywne wyniki

Prawidłowo przeprowadzona procedura ta pozwala na całkowitą separację pęcherzyków błony wewnętrznej (IM) i zewnętrznej (OM) szczepów typu A (np. SchuS4) oraz typu B (np. LVS) F. tularensis. Jak pokazano na reprezentatywnych immunoblotach na Rysunku 1, białka błony zewnętrznej (OMPs) F. tularensis lokalizują się w zakresie gęstości od 1.17 do 1.20 g/ml. Dla porównania, białka błony wewnętrznej (IMPs) lokalizują się w zakresie gęstości od 1.13 do 1.14 g/ml.

Rycina 1. Immunoblotting gradientów gęstości sacharozy F. tularensis. Kolejne frakcje zbierano z gradientów, a gęstości (g/ml) obliczano na podstawie współczynników załamania światła. Białka rozdzielano metodą SDS-PAGE, przenoszono na nitrocelulozę i poddawano immunoblottingowi w celu wykrycia frakcjonowania OMP i IMP. mw, wstępnie zabarwione standardy masy cząsteczkowej o wielkościach (w kDa) zaznaczonych po lewej stronie każdego blotu. LVS, lizaty całych komórek F. tularensis LVS. Odpowiadające im gęstości frakcji gradientu sacharozy są zaznaczone nad właściwymi ścieżkami. OMP i IMP, zaznaczone na lewym marginesie, wykryto za pomocą poliklonalnych, monospecyficznych antyser. Podobne wyniki uzyskano dla F. tularensis SchuS4.

Dyskusja

Niniejszy protokół opisuje wariant „złotego standardu” sferoplastyzacji, lizy osmotycznej i wirowania w gradiencie gęstości sacharozy w celu fizycznej separacji i wzbogacania błon zewnętrznych (OM) bakterii Gram-ujemnych w odróżnieniu od innych składników komórkowych ^{2, 3, 4}. Podczas gdy wcześniej opisaliśmy zastosowanie tej metody do izolacji OM z obu typów szczepów F. tularensis (typ A i typ B) ⁵, niniejsza prezentacja oferuje bardziej szczegółową i zoptymalizowaną procedurę izolacji OM. Stanowi to istotny postęp w identyfikacji potencjalnie eksponowanych na powierzchni i domniemanych czynników wirulencji tego śmiertelnego patogenu. Znaczenie tej procedury wykazano w badaniach przeprowadzonych w naszym laboratorium, które wykazały, że immunizacja myszy oczyszczonymi białkami błony zewnętrznej (OMP) zapewniła znaczną ochronę przed zakażeniem płuc wirulentnym szczepem F. tularensis typu A ⁶. Jak wspomniano powyżej, faza wzrostu komórek bakteryjnych, uważne monitorowanie podczas lizy osmotycznej oraz delikatne resuspensowanie osadów błonowych są krytycznymi krokami, które wydają się korelować z sukcesem lub niepowodzeniem tej procedury separacji błon. Chociaż ta zoptymalizowana metoda jest rygorystyczna i obarczona pewną zmiennością eksperymentalną, otrzymane błony zewnętrzne wydają się mieć znacznie wyższą czystość w porównaniu z błonami uzyskanymi przy użyciu detergentów, chlorku litu lub węglanu sodu ^{7, 8, 9, 10, 11, 12}.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Surowica cielęca od dawcy	Mediatech, Inc.	35-022-CV
IsoVitaleX	BD Biosciences	211876
Woda destylowana klasy molekularnej Cellgro dH2O	Mediatech, Inc.	46-000-CM
Butelka poliwęglanowa 38,5 ml	FiberLite	010-0514
Rotor do ultrawirówki F50L-8x39	FiberLite	096-087051
Kompletny koktajl inhibitorów proteaz bez EDTA	Roche Group	04693132001
Benzonukleaza	Novagen, EMD Millipore	70664-3
Zestaw do oznaczania białek DC	Bio-Rad	500-0116
Probówki do wirówki Ultra-Clear 14x95mm	Beckman Coulter Inc.	344060
Rotor z koszykami SW-40Ti	Beckman Coulter Inc.	331301
Refraktometr stołowy Abbe	Fisher Scientific	13-964-10