In utero operacje przeżycia u myszy umożliwiają molekularną manipulację ekspresją genów podczas rozwoju. W niniejszej pracy opisujemy wykorzystanie obrazowania ultradźwiękowego o wysokiej częstotliwości do prowadzenia iniekcji wektorów retrowirusowych do mózgu myszy w 9,5 dniu embrionalnym (E).
Artykuł metodologiczny
Mikroiniekcja do przedniego mózgu myszy in utero w dniu E9.5 pod kontrolą ultradźwięków
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wewnątrzmacicznie Operacje chirurgiczne z przeżyciem u myszy umożliwiają molekularną manipulację ekspresją genów podczas rozwoju. Jednak ze względu na nieprzezroczystość ściany macicy w fazie wczesnej embriogenezy, możliwość celowania w konkretne części zarodka w celu mikroiniekcji jest znacznie ograniczona. Na szczęście obrazowanie wysokoczęstotliwościowym ultradźwiękami pozwala na generowanie obrazów, które mogą być wykorzystywane w czasie rzeczywistym do naprowadzania igły do mikroiniekcji do interesującego regionu zarodka. W niniejszej pracy opisujemy wykorzystanie takiego obrazowania do naprowadzania iniekcji wektorów retrowirusowych do układu komorowego przedmózgowia myszy w 9,5 dniu embrionalnym (E9.5). Metoda ta wykorzystuje laparotomię w celu uzyskania dostępu do rogów macicy oraz specjalnie zaprojektowaną płytkę, która pozwala na kąpiel zarodków gospodarza w soli fizjologicznej podczas ich obrazowania i iniekcji. Pomyślne operacje często skutkują przeżyciem większości lub wszystkich wstrzykniętych zarodków do dowolnego późniejszego, interesującego punktu czasowego (w okresie embrionalnym lub postnatalnym). Opisane tutaj zasady można zastosować z niewielkimi modyfikacjami w celu wykonania iniekcji do płynu owodniowego zarodków w fazie E8.5 (co umożliwia infekcję wzdłuż przednio-tylnego zasięgu cewy nerwowej, która nie uległa jeszcze zamknięciu) lub do układu komorowego mózgu w fazie E10.5/11.5. Ponadto w środkowym okresie neurogenezy (~E13.5) obrazowanie ultradźwiękowe może być wykorzystane do naprowadzania iniekcji do konkretnych obszarów mózgu w celu infekcji wirusowej lub transplantacji komórek. Wykorzystanie obrazowania ultradźwiękowego do naprowadzania iniekcji in utero u myszy jest bardzo potężną techniką, która umożliwia molekularną i komórkową manipulację zarodkami myszy w sposób, który w przeciwnym razie byłby wyjątkowo trudny, jeśli nie niemożliwy.
Protokół
Część 1. Przygotowanie pola operacyjnego
- W przypadku pracy z odczynnikami biologicznymi (np. wektorami retrowirusowymi), zabieg powinien być przeprowadzony w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II (BSC). Mikroskop ultradźwiękowy z analizą rozproszenia wstecznego (UBM) powinien znajdować się obok komory BSC, przy czym przetwornik musi być umieszczony wewnątrz komory i stabilizowany przez sterowany silnikiem uchwyt na specjalnie zaprojektowanym stole chirurgicznym. Elementy niezbędne do konstrukcji stołu pokazanego w filmie są wymienione w dostępnej w sieci liście. Lista ta, wraz z obrazami stołu pod różnymi kątami (dostępnymi na żądanie), powinna umożliwić jego budowę.
- Otwieranie i zamykanie laparotomii (procedury chirurgicznej, w której jama brzuszna zostaje nacięta w celu uzyskania dostępu do narządów wewnętrznych) wykonuje się zazwyczaj na podkładzie chłonnym z plastikowym spodem. Przed zabiegiem wszystkie niezbędne narzędzia (np. żyletka, nożyczki chirurgiczne, pęseta, załadowany aplikator klipsów autoklipowych itp.) oraz materiały (np. PBS, szwy, środek znieczulający, uchwyt dla myszy i nakładająca go płyta itp.) powinny zostać wysterylizowane i umieszczone w strefie chirurgicznej. Ograniczenie czasu pozostawania nacięcia otwartego jest istotne dla zmaksymalizowania szans powodzenia zabiegu. Wszystkie czynności związane z obsługą zwierząt należy wykonywać w rękawiczkach zdezynfekowanych roztworem MB-10 lub jego odpowiednikiem. Dezynfekcję należy powtarzać w razie potrzeby, aby zapewnić sterylność rękawiczek.
Część 2. Znieczulenie myszy
- Napełnić strzykawkę 1 cc roztworem znieczulającym zawierającym 1 część Nembutalu (50 mg/ml pentobarbitalu) na 4 części przefiltrowanego, wysterylizowanego siarczanu magnezu 25 mg/ml w PBS. W rezultacie powstanie roztwór zawierający 10 mg/ml pentobarbitalu i 20 mg/ml siarczanu magnezu. Każdą mysz należy zważyć indywidualnie i wstrzyknąć 90 mg pentobarbitalu na kg masy ciała (np. myszy o masie 28 gm należy wstrzyknąć 250 μL).
- Wstrzyknąć do jamy brzusznej (dootrzewnowo, IP) ciężarnej myszy w dniu embrionalnym (E) 9,5 (można stosować inne stadia wiekowe w zależności od potrzeb), przebijając skórę i mięśnie brzucha. Odczekać 8-12 minut, aż mysz przestanie reagować. Odpowiednie znieczulenie należy potwierdzić poprzez rozluźnienie postawy zwierzęcia oraz brak ruchu w odpowiedzi na uciskanie ogona i palców u stóp. Delikatne uciskanie między paznokciami jest bardzo czułe, a brak jakiejkolwiek reakcji na taki bodziec wskazuje, że zwierzę jest wystarczająco znieczulone. Należy zauważyć, że nawet zwierzęta całkowicie nie reagujące na uciskanie ogona i palców mogą czasami lekko drgnąć w odpowiedzi na początkowe nacięcie chirurgiczne. Jest to jednak reakcja odruchowa i nie świadczy o niewystarczającym znieczuleniu. Na oczy myszy należy nałożyć maść okulistyczną na bazie wazeliny, aby zapobiec ich wysychaniu podczas operacji.
- Przygotować obszar operacyjny i aparat USG w czasie oczekiwania na znieczulenie myszy. Ponieważ użycie retrowirusów lub lentiwirusów wymaga warunków bezpieczeństwa BSL2, zgodnie z powyższym iniekcje wirusowe powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II. Ponadto wszystkie roztwory i materiały jednorazowe, które miały kontakt z wirusem, należy zdekontaminować 10% roztworem wybielacza. Narzędzia chirurgiczne i sprzęt USG należy przemyć roztworem sterylizującym, takim jak MB-10 (http://www.quiplabs.com/mb10.htm) lub odpowiednikiem stosowanym w danej placówce.
Część 3. Ekspozycja embrionów
- Jeśli to możliwe (w zależności od ograniczeń danej świetlicy dla zwierząt i dostępnej przestrzeni), zaleca się, aby obszar przygotowania chirurgicznego znajdował się w innym miejscu niż obszar operacyjny. Zminimalizuje to ryzyko kontaminacji krzyżowej między zwierzętami. Aby rozpocząć operację, połóż zwierzę na plecach na sterylnej powierzchni chłonnej i dokładnie przemyj obszar brzucha 70% etanolem. Można zastosować bardziej rozbudowane zabiegi przedoperacyjne (np. kolejne rundy przemywania Betadyną i 70% etanolem), jednak w naszym doświadczeniu nie jest to konieczne w przypadku tego typu operacji przeżyciowych u gryzoni. Używając brzytwy dwustronnej, usuń sierść z brzucha na obszarze o szerokości około 1 cala i długości 1,5 cala. Wykonuj krótkie, szybkie ruchy brzytwą pod kątem około 45°. Ważne jest, aby obszar operacyjny został odpowiednio przygotowany, ale nie został nadmiernie zwilżony, ponieważ może to doprowadzić do niepotrzebnego wychłodzenia zwierzęcia, a nawet do hipotermii.
- Używając cienkich nożyczek chirurgicznych, wykonaj najpierw 1-calowe cięcie podłużne przez skórę, a następnie przez mięśnie brzucha zwierzęcia (przecięcie tkanki łącznej wiążącej skórę z mięśniami ułatwi wykonanie drugiego cięcia). Należy pamiętać, że przez cały czas trwania procedury należy dbać o to, aby narzędzia chirurgiczne pozostały sterylne, a w razie potrzeby (np. gdy końcówki narzędzi zetkną się z materiałem niesterylnym) należy przeprowadzić dezynfekcję.
- Używając pęsety, ostrożnie wyciągnij rogi macicy i zanotuj liczbę embrionów po każdej stronie. Pozostawiając odsłonięte dwa sąsiednie embriony (wybór dwóch zależy od konfiguracji po każdej stronie), umieść większość rogów macicy z powrotem wewnątrz zwierzęcia. W tej konfiguracji dwa embriony będą odsłonięte w danym czasie i kąpane w PBS, podczas gdy matka pozostanie w pozycji na plecach.
- Umieść zwierzę na plecach w uchwycie z pleksiglasu, w którym będzie znajdować się podczas operacji (Rycina 1A)*. Następnie opuść 10 cm szalkę do hodowli tkanek** (którą przed użyciem należy zdezynfekować preparatem MB-10) nad matką, używając pęsety umieszczonej lekko przez zieloną membranę silastykową (wykonaną z bazy gumy silikonowej L RTV i utwardzacza; numery produktów Dow-Corning odpowiednio 3142761 i 2156946). Obniżając szalkę nad zwierzęciem, użyj pęsety, aby chwycić tkankę macicy między dwoma embrionami przeznaczonymi do iniekcji i delikatnie przeciągnij je przez membranę. Jednocześnie szalka zostaje całkowicie opuszczona na uchwyt, a pinezki zostają wciśnięte, aby utrzymać ją na miejscu. Do szalki dodaje się następnie uprzednio ogrzany (do 37°C) PBS, aby całkowicie przykryć embriony.
- Umieść stopień iniekcyjny ze zwierzęciem i odsłoniętymi embrionami pod sondą ultrasonograficzną (Rycina 1A), aby uzyskać obrazowanie w czasie rzeczywistym odsłoniętych embrionów przez ścianę macicy (Rycina 1B). Następnie sonda zostaje opuszczona (za pomocą sterowania zmotoryzowanego) do kąpieli w PBS bezpośrednio nad embrionami, które mają zostać zobrazowane. Obrazy można uzyskać, gdy sonda znajduje się w odległości około 2-3 mm od embrionów. Bardzo ważne jest upewnienie się, że głowica sondy nie uderza w embriony podczas oscylacji w przód i w tył w celu gromadzenia obrazów.
* Uchwyt, w którym samica spoczywa podczas operacji, można łatwo wykonać w warsztacie mechanicznym. Powinien on składać się z szerokiej podstawy z pleksiglasu z dwiema przyklejonymi na górze ściankami z pleksiglasu oraz wolną przestrzenią między nimi (wystarczająco szeroką, aby zmieściła się w niej mysz leżąca na grzbiecie). W ściankach powinno zostać wyżłobione wgłębienie, które następnie wypełnia się czarnym woskiem (np. z kuwety sekcyjnej). Wosk ten służy jako materiał, w którym wbija się pinezki, aby przymocować płytkę z PBS, w której kąpią się embriony podczas iniekcji.
W szalkach bakteriologicznych o średnicy 10 cm należy wyciąć w centrum dna otwór (o średnicy ok. 2 cm); można to wykonać za pomocą przenośnego dziurkacza Heavy Duty Portable Punch z końcówką 13/16th okrągła matryca calowa: http://roperwhitney.com/punching/2-1011.cfm). Ponadto, po obu stronach otworu centralnego (w odległości około 1,5 cm) należy wypalić dwa małe otwory za pomocą rozgrzanej w płomieniu igły (lub można je wykonać wiertłem). Otwory te należy następnie pokryć smarem próżniowym; będą one służyć jako miejsca, w których pinezki mocujące płytkę do uchwytu zostaną wbite w czarny wosk. Smar próżniowy ma zapobiegać wyciekowi buforu PBS.
Część 4. Napełnianie igły do mikroiniekcji wirusem
- Przygotuj igłę do mikroiniekcji poprzez ścięcie pod kątem szklanej kapilary wyciąganej o średnicy wewnętrznej 1mm. Ostrość igły jest krytyczna; praca z niewystarczająco ostrą igłą może poważnie utrudnić penetrację ściany macicy i pęcherza owodniowego, co może prowadzić do niepowodzenia eksperymentu. Następnie zaostrzoną igłę umieszcza się w uchwycie do pipety, który jest połączony za pomocą rurek z mikroszystryką o pojemności 25 μL zamontowaną w ręcznej pompie infuzyjno-aspiracyjnej (do regulacji napełniania i opróżniania igły można użyć innych urządzeń, ale to rozwiązanie jest pokazane na filmie). Aby uzyskać optymalną responsywność (i uniknąć rozszerzania oraz sprężania związanych z systemem wypełnionym powietrzem), mikroszystrykę, rurki i igłę należy wypełnić olejem mineralnym.
- Przed napełnieniem igły należy upewnić się, że w systemie — od strzykawki aż po końcówkę igły — nie ma pęcherzyków powietrza. Następnie, przed rozpoczęciem ładowania wirusa, wciągnij do igły mały pęcherzyk powietrza (o długości 1-2 mm). Ta kieszonka powietrzna pomaga utrzymać separację między wirusem a olejem mineralnym. Wstrzykiwany stok wirusa powinien zawierać polybrene w końcowym stężeniu 0,08 mg/ml (więcej informacji na temat produkcji wirusa znajduje się w referencjach 1, 2). Należy pamiętać, że stężone stok retrowirusowe zazwyczaj zawierają znaczną ilość materii cząsteczkowej, w której znajduje się większość materiału zakaźnego, dlatego nie można ich filtrować bez 5- do 10-krotnego spadku miana. Ponadto, w zależności od preparacji, stok wirusa może być lepki ze względu na genomiczne DNA z lizowanych komórek pakujących (szczególnie w przypadku użycia komórek 293 do generowania wirusa pseudotypowanego MLV/VSV). Jeśli alikwot wirusa jest lepki, można i należy dodać niewielką ilość DNAse I, aby rozrzedzić stok, w przeciwnym razie napełnienie igły będzie niezwykle trudne. Kroplę stoku wirusa (8-10 μL) należy umieścić na sterylnym kawałku parafilmu w przygotowaniu do napełnienia igły. Następnie, używając pompy aspiracyjnej, ostrożnie napełnij igłę, dbając o to, aby nie doprowadzić do zatkania. Umieść napełnioną igłę w pozycji mikromanipulatora w obszarze iniekcji, uważając, aby nie złamać igły na embrionach lub sondzie ultradźwiękowej. Należy zauważyć, że jeśli z jakiegoś powodu igła zostanie napełniona znacznie przed planowaną iniekcją, pomocne może być wciągnięcie niewielkiej ilości powietrza do końcówki, którą można wypuścić przed rozpoczęciem iniekcji. Ta kieszonka powietrzna może chronić przed wysychaniem stoku wirusa na końcówce igły (zdarzenie, które prawie zawsze sprawia, że napełniona igła staje się bezużyteczna).
Część 5. Iniekcja wirusowa pod kontrolą ultradźwięków
- Obraz w czasie rzeczywistym generowany przez sondę ultradźwiękową jest wizualizowany na monitorze wideo i może służyć do prowadzenia igły do mikroiniekcji do zarodka. Przy użyciu tego systemu wirusa można wstrzyknąć do pęcherzyka owodniowego w dniu E8.5 lub do pęcherzyka owodniowego bądź układu komorowego w dniach od E9.5 do E11.5 (Rycina 1B). Jest to najtrudniejsza część procedury, która wymaga znacznego doświadczenia praktycznego, aby ją opanować (rzędu 5-20 godzin, w zależności od badacza). Końcówka igły jest widoczna na obrazie USG jako najjaśniejszy punkt na ekranie i powinna poruszać się zgodnie z korektami pozycji sondy (przy użyciu sterowania zmotoryzowanego w płaszczyznach y i z oraz sterowania ręcznego w płaszczyźnie x). Krytycznie ważne jest, aby kierunek oscylacji sondy był równoległy do długości igły. Zapewni to, że końcówka igły pozostanie w płaszczyźnie obrazowania podczas ruchów pozycjonujących ją do iniekcji do zarodka.
- Zarodka należy ustawić tak, aby obszar docelowy (w tym przypadku komora przodomózgowia) był łatwo widoczny i dostępny dla igły przy najmniejszej ilości materiału macicy na drodze iniekcji. Ponadto krytyczne jest, aby nie wstrzykiwać przez łożysko. Gdy docelowy obszar mózgu zostanie wyrównany z kierunkiem posuwania igły (za pomocą pokrętła w mikromanipulatorze), igła powinna jedynie dotykać ściany macicy, a następnie krótkie, szybkie pchnięcie do przodu powinno przebić tkankę. Podobne podejście stosuje się w celu przebicia pęcherzyka owodniowego, a następnie mózgu. W niektórych przypadkach doświadczony badacz może trafić do komory jednym ruchem, szczególnie jeśli igła jest bardzo ostra. Mechanika poruszania sondą, igłą i zarodkami (poprzez przesuwanie matki na stole) wymaga praktyki, aby ją opanować.
- Po wstrzyknięciu odpowiedniej liczby zarodków należy zamknąć ścianę brzuszną szwami z jedwabiu 5.0. Technika szycia nie jest specyficzna dla tego rodzaju operacji. Na koniec należy użyć weterynaryjnych klipsów do zszycia skóry nad szwami w mięśniach brzucha. Szycie skóry nie jest zalecane, ponieważ mysz może wygryźć szwy. W miejscu nacięcia należy zastosować leki przeciwbólowe, aby zmniejszyć ból odczuwany przez mysz podczas budzenia się. Zaleca się podskórne wstrzykiwanie 0,25% roztworu Bupiwakainy (0,8 ml/kg lub 2 mg/kg) co kilka milimetrów wzdłuż miejsca nacięcia.
- Podczas rekonwalescencji myszy należy delikatnie położyć zwierzę na papierze chłonnym w czystej klatce zawierającej żelowy wkład chłodzący (aby ułatwić karmienie i nawadnianie). Klatkę należy umieścić na podgrzewaczu do szkiełek ustawionym na 37°C w celu utrzymania temperatury ciała. Po przebudzeniu mysz wraz z wkładem żelowym należy przenieść do czystej klatki i zwrócić na stojak dla zwierząt.
- Następnego dnia należy sprawdzić, czy u myszy nie występuje krwawienie z pochwy, skurcze brzucha i/lub ogólne oznaki rozstroju, co wskazuje na aborcję. W takim przypadku należy natychmiast uśmiercić mysz. Zadbane futro i ogólny zdrowy wygląd świadczą o pomyślnej rekonwalescencji po operacji. Wstrzyknięte zarodki mogą zostać pobrane w fazie embrionalnej lub po urodzeniu do dalszych analiz. Jeśli wirus wykazuje ekspresję genu reporterowego, takiego jak ludzka fosfataza zasadowa (PLAP) lub GFP, barwienie ujawni obszary pozytywnej infekcji wirusowej (Rycina 1C).
Reprezentatywne wyniki
Wstrzyknięte embriony można uśmiercić od 1-2 dni po iniekcji aż do osiągnięcia przez nie wieku dorosłego. Jeśli wirus wykazuje ekspresję genu reporterowego, takiego jak PLAP lub GFP, to ekspresja reportera służy do identyfikacji komórek zainfekowanych wirusem oraz ich klonów. Na przykład na rysunku 1C przedstawiono przekrój tkanki mózgu postnatalnego, który został zainfekowany in utero w dniu E9.5 wektorem retrowirusowym wykazującym ekspresję PLAP. Zainfekowane komórki są widoczne jako fioletowe skupiska po barwieniu histochemicznym. Poza identyfikacją komórek zainfekowanych wirusem, ekspresja reportera pozwala na badanie morfologii i położenia komórek, a także statusu ekspresji genów.
Rycina 1. Iniekcja wirusowa do komór przedmózgowia myszy w stadium E9.5. A. Zznieczone zwierzę zostaje umieszczone na stole do iniekcji. Dwa zarodki są odsłaniane i ustawiane pod głowicą ultradźwiękową w wskazanym miejscu (strzałka). Igła do mikroiniekcji wypełniona wirusem znajduje się w pobliżu zarodków i jest wyrównana z głowicą ultradźwiękową. B. Zrzut ekranu obrazu ultradźwiękowego w czasie rzeczywistym z zarodka myszy w stadium E9.5. V, komora; AS, pęcherzyk owodniowy; UW, ściana macicy. C. Zarodki zostały wstrzyknięte wirusem wykazującym ekspresję PLAP w stadium E10.5. Barwienie histochemiczne na PLAP ujawnia miejsca infekcji wirusowej.
Dyskusja
Wstrzyknięcia wirusowe z prowadzeniem ultradźwiękowym mogą być przeprowadzane w okresie od E8.5 do E11.5, przy czym w dniu E8.5 możliwe jest wstrzyknięcie wyłącznie do pęcherza owodniowego, natomiast od E9.5 do E11.5 można wstrzykiwać zarówno do pęcherza owodniowego, jak i do układu komorowego. Przy prawidłowym wykonaniu cząsteczki wirusowe wstrzyknięte do układu komorowego z prowadzeniem ultradźwiękowym mają dostęp do komórek wyścielających ten układ, a w konsekwencji mogą infekować różne struktury przedmózwia (neokortex, jądra podstawy, wzgórgowie, oko itp.), śródmózwia oraz tyłomózgu (Rysunek 1C). Wirus wstrzyknięty do pęcherza owodniowego ma dostęp do komórek znajdujących się na zewnętrznej powierzchni zarodka. Oprócz wirusów prowadzenie ultradźwiękowe może być również wykorzystane do wstrzykiwania komórek do rozwijającego się zarodka. Dzięki temu technika ta oferuje wiele możliwości wyboru (okres rozwoju, struktura, wirusy/komórki) podczas projektowania eksperymentu.
Kluczowe jest, aby wstrzyknięty wirus lub komórki wyrażały gen reporterowy, co umożliwia łatwą identyfikację komórek zainfekowanych/wstrzykniętych. Historycznie stosowano ludzką fosfatazę alkaliczną łożyska (PLAP) lub GFP. Z doświadczenia wiemy, że PLAP może być bardzo użytecznym genem reporterowym, ponieważ zarówno barwienie histochemiczne, jak i immunohistochemiczne PLAP daje wyraźne i ostry sygnał w pojedynczych komórkach, co pozwala na analizę morfologii i położenia komórek oraz przeprowadzenie analizy klonalnej. Ponieważ wirusowa ekspresja GFP może być słaba, reporter GFP może nie być idealny do barwienia tkanek, ale jest przydatny, jeśli celem jest uzyskanie pojedynczych komórek za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS).
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Mikromanipulator | Narishige International | 91084361683D | |
| uchwyt do pipety HI-7 | Narishige International | 9108436141 | |
| ramię wsporcze 10 mm | Carl Zeiss, Inc. | 9108436206 | |
| podkładka bazowa IP z żelaza | Carl Zeiss, Inc. | 9108436167 | |
| Złącze CI-1 dla uchwytu pipety | Carl Zeiss, Inc. | 9108436257 | |
| przewód o średnicy wewnętrznej 1 mm | Carl Zeiss, Inc. | 911013 | |
| trójdrożny kurek z przyłączem Luer-Lock (opakowanie 10 szt.) | Carl Zeiss, Inc. | K420163-4503 | |
| Kontroler silników, 2-4 osie | Newport Corp. | 860-c2 | |
| Joystick | Newport Corp. | PMC200-J | |
| Adapter mikrometryczny | Newport Corp. | ADAPT-BM17-375 | |
| Napęd zmotoryzowany | Newport Corp. | CMA-25CC | |
| Zespół przewodów | Newport Corp. | 860I-10 | |
| stół translacyjny 25 mm | Newport Corp. | UMR8-25 | |
| Mikrometr | Newport Corp. | BM17-25 | |
| Płyta podstawowa | Newport Corp. | M-PBN8 | |
| Wewnętrzny wspornik montażowy | Newport Corp. | EQ80-I | |
| Zewnętrzny uchwyt montażowy | Newport Corp. | EQ80-E | |
| Pompa do manualnego wstrzykiwania/odsysania | Stoelting Co. | 51222 | |
| 25 μmikrostrzykawka | Stoelting Co. | 51113 | |
| 24"x12"x0,5" płyta pomiarowa | Edmund Scientific | NT03-640 | |
| Zestaw stopek z regulacją wysokości | Edmund Scientific | NT34-841 | |
| Uchwyt soczewki typu prętowego | Edmund Scientific | NT03-669 | |
| Kątowy zacisk do stabilizacji postu | Edmund Scientific | NT53-357 | |
| 2" uchwyt do probówek | Edmund Scientific | NT03-646 | |
| 4” stojak stalowy | Edmund Scientific | NT36-499 | |
| 6” stojak stalowy | Edmund Scientific | NT36-503 | |
| zestaw śrub imbusowych 12 szt./opak., 1/4-20 x 1/2" | Edmund Scientific | NT03-644 | |
| PBS, pH 7,4 | Invitrogen | 10010049 | |
| Podgrzewacz do szkiełek | Fisher Scientific | Liczne opcje | |
| Żyletki dwustronne | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Szkło borokrzemianowe średnica zewnętrzna (O.D.): 1,0 mm, średnica wewnętrzna (I.D.): 0,05 mm | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | |
| Strzykawka insulinowa 1 cm³ U-100 27G 5/8 | BD Biosciences | 329412 | |
| Aplikator automatycznych klipsów | BD Biosciences | 427630 | |
| Klamry chirurgiczne, 9 mm (do zamknięcia nacięcia skóry) | BD Biosciences | 427631 | |
| Szwy jedwabne 5.0 | Fisher Scientific | S-1173 | |
| Maść okulistyczna Sterilube | Fera pharmaceuticals | 48102-012-35 | |
| środek dezynfekujący MB-10 lub równoważny | Quip labs | ||
| 10% roztwór wybielacza | Wielu dostawców | ||
"Do tej procedury można wykorzystać jeden z poniższych mikroskopów do obrazowania rozproszenia wstecznego ultradźwięków. Chociaż w filmie użyto modelu P40 firmy Paradigm-Medical, urządzenie P40 nie jest już dostępne w sprzedaży i zostało zastąpione modelem P60, który ma podobną cenę i może być stosowany w tych samych zastosowaniach. Dodatkowe materiały opisane w sekcji budowy platformy są przeznaczone do użytku z urządzeniami Paradigm-Medical. System Vevo 2100 jest wyposażony w sprzęt do obrazowania małych zwierząt.
Środki znieczulające i przeciwbólowe Roztwór Nembutalu (wstrzykiwalny pentobarbital sodu w stężeniu 50 mg/ml; wytwarzany przez Abbott laboratories) można nabyć w firmie Bulter Schein Animal Health. Należy pamiętać, że jest to substancja kontrolowana z grupy II, której nabycie wymaga licencji Drug Enforcement Agency (DEA). Roztwór bupiwakainy (0,25%; produkowany m.in. przez Hospira, Inc.) można nabyć od wielu dystrybutorów, w tym od Moore Medical. |
Bibliografia
- Yee, J. K. Generation of high-titer pseudotyped retroviral vectors with very broad host range. Methods Cell Biol. 43, 99-112 (1994).
- Gaiano, N. A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system. Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).
Przedruki i uprawnienia
