Testy manipulacji nitkami vermicelli i capellini: proste ilościowe pomiary sprawności chwytnej przedniej łapy u szczurów i myszy

Podsumowanie

Testy manipulacji Vermicelli i Capellini służące do oceny sprawności przednich łap wykorzystują naturalną skłonność gryzoni do manipulowania produktami spożywczymi za pomocą precyzyjnych ruchów przednich łap i palców. Zwierzęta są nagrywane podczas manipulowania krótkimi nitkami surowego, suchego makaronu. Odtwarzanie wideo w zwolnionym tempie umożliwia ilościową ocenę korekt ułożenia przednich łap.

Streszczenie

Poprzednie charakterystyki zachowań żywieniowych gryzoni wykazały, że wykorzystują one skoordynowane ruchy przednich łap do manipulowania kawałkami pokarmu. Rozszerzyliśmy te badania, aby opracować prostą ilościową miarę sprawności przednich łap, która jest czuła na zaburzenia lateralizowane oraz zmiany zależne od wieku. Gryzonie uczą się zręcznych ruchów przednimi łapami i palcami, aby radzić sobie z cienkimi kawałkami makaronu, które chętnie spożywają. Opisaliśmy wcześniej metody ilościowego pomiaru manipulowania makaronem typu vermicelli u szczurów i wykazaliśmy, że miary te są bardzo czułe na upośledzenia kończyn przednich wynikające z jednostronnych uszkodzeń niedokrwiennych, zamknięć środkowej tętnicy mózgowej oraz jednostronnego wyczerpania dopaminy w prążkowiu [Allred, R.P., Adkins, D.L., Woodlee, M.T., Husbands, L.C., Maldonado M.A., Kane, J.R., Schallert, T. & Jones, T.A. The Vermicelli Handling Test: a simple quantitative measure of dexterous forepaw function in rats.J. Neurosci. Methods170, 229-244 (2008)]. W niniejszej pracy przedstawiamy bardziej szczegółowy protokół tego testu dla szczurów oraz porównujemy go z nowo opracowaną wersją dla myszy – testem manipulacji makaronem Capellini (Capellini Handling Test). Szczury i myszy są nagrywane podczas manipulowania odpowiednio krótkimi kawałkami surowego makaronu vermicelli lub capellini, przy użyciu kamery ustawionej tak, aby zoptymalizować widoczność ruchów łap. Odtwarzanie wideo w zwolnionym tempie umożliwia identyfikację korekt przednimi łapami, definiowanych jako każde wyraźne odstawienie i ponowne położenie łapy lub dowolnej liczby palców na kawałku makaronu po rozpoczęciu jedzenia. Liczbę korekt przednimi łapami na jeden kawałek uśrednia się z prób w ramach każdej sesji testowej. Powtarzane testy pozwalają na czułą analizę ilościową zmian w zręczności przednich łap w czasie. Opisano protokoły habituacji przed testowaniem i ćwiczeń w manipulacji, a także procedury charakteryzowania nietypowych wzorców manipulacji. Ponieważ szczury i myszy wykonują testy manipulacji makaronem nieco inaczej, podkreślono różnice gatunkowe w przeprowadzaniu i punktacji tych testów. Wszystkie prace z udziałem zwierząt były zgodne z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu Teksańskiego w Austin (University of Texas at Austin Animal Care and Use Committee).

Protokół

1. Przygotowanie do rozpoczęcia testowania

1. Kawałki surowego makaronu są przycinane na odpowiednią długość za pomocą żyletki. W przypadku szczurów makaron vermicelli marki Skinner (średnica 1,5 mm) jest przycinany do długości 7 cm. W przypadku myszy makaron capellini marki DeCecco (średnica 1,0 mm) jest przycinany do długości 2,6 cm (Rys. 1C). Ponieważ marki makaronu różnią się teksturą i średnicą, co może wpływać na sposób manipulacji, zaleca się stosowanie makaronu z jednego źródła podczas powtarzalnych testów.
2. Aby przełamać reakcje neofobiczne i wykształcić umiejętność manipulowania makaronem, zwierzęta są wielokrotnie eksponowane na kawałki makaronu w ich domowej klatce na kilka tygodni przed testami. (Zazwyczaj wystarczy 5–10 dni ekspozycji, podając około 4 kawałków za każdym razem).
3. Jeśli test będzie przeprowadzany w komorze innej niż domowa klatka lub jeśli domowa klatka zostanie przeniesiona na potrzeby testów, zapewnia się habituację do jedzenia w środowisku testowym. (Zazwyczaj potrzeba 3–5 sesji, aż zwierzęta zaczną chętnie jeść makaron w tym środowisku).
4. Nawet po tym, jak zwierzęta z chęcią przyjmują makaron, mogą nagle stać się niechętne w momencie przesunięcia dużej kamery obok obszaru testowego. Pomocne jest umieszczenie kamery przed środowiskiem testowym podczas jednej lub więcej sesji habituacji.
5. Ponieważ większość zwierząt traktuje makaron jako wysoce smakowity, ograniczenie dostępu do pożywienia przed testami nie jest niezbędne. Jednak usunięcie jedzenia na kilka godzin przed testem lub na noc może ułatwić jedzenie w obecności eksperymentatora i kamery oraz zapewnić, że zwierzęta nie będą syte w czasie testu.
6. Złamanie kawałka makaronu podczas jedzenia unieważnia próbę. Stwierdzono, że można w dużej mierze uniknąć tego nawyku, jeśli zwierzęta nigdy nie otrzymują kawałków dłuższych niż te stosowane w testach.
7. Na potrzeby sesji testowych kawałki makaronu są znakowane markerem z ultracienką końcówką w określonych odstępach przy użyciu szablonu z brystolu (interwały 1,75 cm dla vermicelli i 0,86 cm dla capellini). Ułatwia to wizualizację ruchu nitki makaronu podczas jedzenia.

2. Konfiguracja testu

1. Zwierzęta powinny być badane w klatce domowej lub w innym aparacie z gładkimi, przezroczystymi ściankami i powinny być odizolowane od współlokatorów podczas sesji testowej.
2. Choć doświadczony eksperymentator może badać szczury w czasie rzeczywistym (Allred et al., 2008), kwantyfikacja jest ułatwiona dzięki nagrywaniu wideo, co pozwala na zbieranie danych podczas odtwarzania obrazu w zwolnionym tempie. W przypadku myszy nie stwierdzono możliwości wiarygodnej kwantyfikacji ruchów przednich łap bez odtwarzania wideo w zwolnionym tempie ze względu na niewielki rozmiar łap i szybkość ruchów.
3. Stosowana jest kamera wideo o wysokiej częstotliwości klatek i odpowiednim zbliżeniu. Używamy kamery Canon XL1S z obiektywem z 16-krotnym zoomem, z prędkością migawki ustawioną na co najmniej 420 s-1 w normalnych warunkach oświetlenia pomieszczenia. Użycie statywu na kółkach z głowicą panoramiczną i pochylaną ułatwia pozycjonowanie kamery.
4. Szczury zazwyczaj siedzą wyprostowane na tylnych łapach, jedząc makaron, a łapy są najlepiej widoczne przy ustawieniu kamery mniej więcej na poziomie dna komory pod lekkim kątem w górę (Rys. 1A). W przypadku testowania w klatce z trocinami, usunięcie części ściółki może być pomocne w optymalizacji widoku.
5. Myszy mają tendencję do pochylania się do przodu podczas jedzenia makaronu, trzymając kawałek pod większym kątem niż szczury. Dlatego komorę testową z otwartym dnem umieszcza się na lustrze. Kamera jest ustawiona nieco powyżej poziomu dna i skierowana w dół, aby skupić się na odbiciu łap w lustrze (Rys 1B). Zastosowanie lustra z pierwszą powierzchnią znacząco poprawia wyraźność łap podczas odtwarzania wideo.
6. Każdy kęs kawałka makaronu jest słyszalny, dlatego nagrywanie audio jest przydatne do weryfikacji procesu jedzenia.

3. Przeprowadzanie prób manipulacji makaronem

1. Sesje testowe składają się z sekwencyjnych prób, w których podczas każdej próby zjadany jest jeden kawałek makaronu. Zazwyczaj rejestrujemy dane z 4-5 prób na szczura i 3-4 prób na mysz.
2. Przed rozpoczęciem nagrywania w komorze umieszcza się kawałek makaronu, aby zainicjować jedzenie i doprowadzić zwierzę do odpowiedniego pola widzenia kamery.
3. Konieczne jest, aby zwierzę było zwrócone przodem do kamery oraz aby zastosować odpowiednie ogniskowanie i powiększenie (~10-12X), umożliwiające obserwację poszczególnych ruchów obu przednich łap i wszystkich palców. Kostki obu łap powinny być widoczne. Przynajmniej w przypadku tej kamery uważamy za pomocne używanie funkcji autofokusa wyłącznie przed rozpoczęciem próby w celu precyzyjnego ustawienia na obszarze zainteresowania. Następnie przełączamy się na ustawianie ostrości ręcznie.
4. Gdy tylko zwierzę i kamera znajdą się w odpowiedniej pozycji, rozpoczyna się pierwszą próbę. Kawałek makaronu jest upuszczany lub zawieszany bezpośrednio przed zwierzęciem, a nagrywanie rozpoczyna się przed momentem rozpoczęcia jedzenia.
5. Następnie próby są przeprowadzane bezpośrednio jedna po drugiej. Zaleca się minimalizowanie opóźnień między próbami, aby zwierzęta nie oddalały się z optymalnej pozycji obserwacyjnej.
6. Próby, w których łapy są widoczne z boku lub w których utracono ostrość obrazu, nie są oceniane.
7. Sesje testowe można powtarzać w odstępach wielodniowych, np. w celu udokumentowania wzorców czasowych przed i po leczeniu (np. regeneracja po urazie OUN; Allred et al., 2008).
8. Wyzwaniem może być skłonienie zwierząt do jedzenia w pożądanych pozycjach względem kamery. W przypadku zwierząt unikających kamery może być konieczna habituacja do jej obecności przez kilka minut przed testem. Zwierzęta można często nakłonić do zajęcia odpowiedniej pozycji, upuszczając lub zawieszając makaron w idealnym obszarze. Osiągnięcie pożądanej pozycji może wymagać podania kilku kawałków, jednak liczbę ta powinna być minimalna, aby uniknąć sytości.
9. W przypadku sekwencyjnego testowania kilku szczurów uznaliśmy za wygodne ustawienie kilku ich klatek naraz w okręgu, z kamerą na statywie z kółkami w środku. Do idealnego obszaru każdej klatki upuszcza się kawałek makaronu, a następnie kamerę przesuwa się do szczura, który pierwszy zacznie jeść w odpowiedniej pozycji. Pozwala to wolniejszym (w kontekście jedzenia w pozycji) szczurom na dłuższą habituację do obecności kamery i eksperymentatora; mogą być one również stymulowane do jedzenia dźwiękami gryzienia wydawanymi przez szybsze osobniki.

4. Ilościowa analiza wideo korekt przedniej łapy i czasu jedzenia

1. Analiza korekt przednich kończyn podczas jedzenia jest prostym pomiarem ilościowym, który jest czuły na lateralizowane upośledzenia po urazie ośrodkowego układu nerwowego u szczurów (Allred i wsp., 2008; Whishaw & Coles, 1996; Whishaw i wsp., 1997) oraz do zmian związanych ze starzeniem się u myszy (Tennant i wsp.., 2009).
2. Kwantyfikowana część próby rozpoczyna się w momencie umieszczenia kawałka makaronu w pyszczku i kończy się, gdy ostatnia część makaronu zostanie wypuszczona z łap i zniknie w pyszczku. 
3. Odtwarzanie wideo zostało spowolnione (do ok. 50% czasu rzeczywistego) lub zastosowano przesuwanie klatka po klatce, w zależności od potrzeb, aby zidentyfikować dokonane korekty.
4. Korektę liczy się za każdym razem, gdy łapa puszcza i ponownie styka się z kawałkiem makaronu, gdy następuje ponowne uchwycenie elementu przez łapę lub gdy występuje wyprost-zgięcie bądź odwiedzenie-przywodzenie palców (Ryc. 2). Każda korekta jest rejestrowana oddzielnie dla lewej i prawej łapy.
5. Korekty są nie zlicza się w momencie, gdy łapa przesuwa się po kawałku makaronu bez ruchu palców lub zmiany ułożenia łapy. Ruchy łapy w czasie, gdy nie ma ona kontaktu z kawałkiem makaronu (np. ruchy obok elementu), również nie są zliczane.
6. Czas spożycia jest również rejestrowany dla każdej próby, począwszy od momentu rozpoczęcia jedzenia, a kończąc w chwili zniknięcia makaronu w ustach. Czas rejestrujemy przy użyciu funkcji wyświetlania odtwarzania wideo, ale można go również pomierzyć za pomocą stopera podczas odtwarzania z normalną prędkością.
7. Jeśli zwierzę przerwie jedzenie, ale nadal trzyma kawałek, czas tej przerwy odejmuje się od czasu całkowitego. Przerwa w jedzeniu jest widoczna w przypadku przesunięcia kawałka poza jamę ustną lub ustania słyszalnego gryzienia.
8. Próbę pomija się w analizie, jeśli w dowolnej części procesu jedzenia widoczność łap zostanie ograniczona lub jeśli zwierzę rozłamie kawałek, ponieważ krótsze fragmenty zmieniają schematy manipulacji.
9. Niektóre szczury i myszy konsekwentnie wykonują więcej korekt jedną łapą niż drugą. W modelach jednostronnych uszkodzeń OUN deficyty lateralizowane są wykrywane z większą czułością, jeśli uszkodzenia obejmują łapę, która wykonywała więcej korekt podczas testów przed uszkodzeniem (Allred i wsp.., 2008).
10. Myszy czasami upuszczają kawałek makaronu w trakcie jedzenia, a po krótkiej przerwie podnoszą go i kontynuują spożywanie. Zjawisko to występuje najczęściej podczas ostatniej próby w ciągu dnia, co może wynikać z częściowego nasycenia i utraty koncentracji na jedzeniu. Ponieważ zdarza się to również u myszy nienaruszonych, nie pomijamy tych prób. Jednak czas, w którym kawałek został upuszczony, odejmuje się od całkowitego czasu jedzenia.
11. U nienaruszonych szczurów upuszczanie kawałków pokarmu jest nietypowe, a powrót do jedzenia jest często znacznie opóźniony lub nie występuje. Takie próby są pomijane w analizie korekt i czasu jedzenia.
12. Korekty przed rozpoczęciem jedzenia nie są wliczane. Zachowania manipulacyjne przed jedzeniem ulegają zmianom w wyniku uszkodzeń OUN (np. Whishaw i wsp.., 1992; Whishaw i wsp.., 1986), jednak nie rozszerzyliśmy jeszcze ilościowych metod analizy korekt przednich kończyn na ten okres.
13. Dane te można podsumować jako: (a) średnią liczbę korekt na jedną łapę na jeden kawałek, (b) średni czas jedzenia jednego kawałka oraz (c) tempo korekt (liczba korekt/czas jedzenia).

5. Analiza wideo nietypowych wzorców manipulacji

1. Atypowe wzorce manipulacji mogą pozwolić na rozróżnienie różnych typów uszkodzeń OUN u szczurów (Allred et al., 2008), a rejestrowanie tych zachowań może być przydatne jako analiza uzupełniająca.
2. Wzorce manipulacji uznaje się za atypowe, jeśli są one rzadko obserwowane u zwierząt zdrowych. Zdrowe zwierzęta zazwyczaj rozpoczynają jedzenie od jednej łapy, tzw. „łapy chwytnej”, umieszczonej niżej na makaronie, a następnie „łapa prowadząca” zostaje umieszczona w pobliżu pyska (Ryc. 3A,C). Ta sama łapa zazwyczaj pełni funkcję łapy chwytnej we wszystkich próbach. Szczury często początkowo ustawiają łapy szeroko wzdłuż długości makaronu, a następnie zbliżają je do siebie w miarę skracania się kawałka. Myszy zazwyczaj ustawiają obie łapy blisko pyska, trzymając kończynę chwytną i prowadzącą blisko siebie, nawet na początku jedzenia. U obu gatunków łapy przyjmują bardziej symetryczne pozycje, obok siebie lub z przeplatającymi się palcami, gdy kawałek jest bardzo krótki (Ryc. 3B,D). Obie łapy są stale wykorzystywane do prowadzenia, trzymania lub przesuwania makaronu podczas jedzenia.
3. Atypowe wzorce ułożenia łap u szczurów i myszy obejmują: (a.) ustawienie łap razem, w symetrycznym chwycie, gdy kawałek makaronu jest długi (więcej niż połowa pierwotnej długości), (b.) brak przejścia łap w pozycję symetryczną przed całkowitym zjedzeniem kawałka oraz (c.) zamianę pozycji kończyn prowadzącej i chwytnej w trakcie jedzenia.
4. Dwa dodatkowe atypowe zachowania u szczurów i myszy to: (a.) brak kontaktu jednej z łap z kawałkiem makaronu przez dłuższy czas podczas jedzenia („brak kontaktu”) oraz (b.) używanie pyska do wciągania makaronu przez łapy w celu ich repositionowania („wciąganie pyskiem”).
5. Dwa zachowania uznaje się za atypowe dla szczurów, ale są one typowe dla myszy: (a.) zgarbiona postawa oraz (b.) upuszczenie kawałka makaronu po rozpoczęciu jedzenia. Jednakże częstotliwość upuszczania u myszy może wzrosnąć po uszkodzeniu OUN. Dlatego rejestrujemy częstotliwość upuszczania u obu gatunków.
6. Inne atypowe zachowania zaobserwowano w modelu jednostronnego wyczerpania dopaminy w prążkowiu u szczurów: (a.) „żelazny chwyt”, w którym kończyna chwytna pozostaje w nieruchomej, sztywnej pozycji podczas jedzenia, (b.) powtarzające się ruchy łapy prowadzącej wokół sztywnej łapy chwytnej oraz (c.) ekstremalne przechylanie głowy w momencie kierowania makaronu do pyska (Allred et al., 2008; patrz również Whishaw et al. 1997).
7. Zaobserwowaliśmy, że starsze myszy często wykonują korekty, które są nieskuteczne w prz przesuwaniu makaronu do pyska. Dlatego korekty, które nie skutkują widocznym przesunięciem kawałka makaronu w stronę pyska, są rejestrowane oddzielnie.
8. Zamiany kończyn prowadzącej i chwytnej, braki kontaktu, upuszczenia oraz wciąganie pyskiem są rejestrowane dla każdego wystąpienia, natomiast wszystkie inne atypowe zachowania są rejestrowane raz na próbę.

6. Reprezentatywne wyniki

Wyniki analizy wideo powinny obejmować liczbę korekt każdej łapy w każdej próbie oraz czas potrzebny na zjedzenie każdego kawałka makaronu. Wyniki uzyskane u szczurów z uszkodzeniami kory sensoromotorycznej lub niedokrwieniem mózgu wskazują, że zwierzęta wykonują mniej korekt kończyną upośledzoną (przeciwległą do miejsca uszkodzenia), co jest efektem utrzymującym się przez co najmniej miesiąc po urazach. Jednostronne wyczerpanie dopaminy prowadzi zarówno do zmniejszenia liczby korekt kończyną przeciwległą, jak i do zwiększenia liczby korekt kończyną ipsilateralną (Allred et al., 2008). Wyniki uzyskane u myszy pokazują, że zwierzęta w starszym wieku potrzebują więcej czasu na zjedzenie kawałków makaronu i wykonują więcej korekt, które nie prowadzą do przesunięcia makaronu do pyszczka, w porównaniu z młodymi dorosłymi myszami (Tennant et al., 2009). Analiza tych testów może obejmować również obserwacje nietypowych zachowań manipulacyjnych. Uszkodzenie prążkowia oraz okluzja środkowej tętnicy mózgowej spowodowały dodatkowo zwiększenie częstotliwości występowania nieprawidłowych zachowań podczas jedzenia (Allred et al., 2008).

Rysunek 1. Postawa podczas chwytania makaronu u (A) szczurów i (B) myszy. Należy zauważyć, że szczury siadają na tylnych łapach, podczas gdy myszy pochylają się nad makaronem, co wymaga umieszczenia lustra pod myszą w celu obserwacji ruchów łap. (C) Przykłady kawałków makaronu przygotowanych do testu.

Rysunek 2. Przykład korekty ułożenia przedniej łapy u (A-C) szczura i (D-F) myszy. Pierwszy panel przedstawia zwierzę przed korektą, panel środkowy pokazuje proces korekty ułożenia przedniej łapy, gdzie gwiazdką oznaczono łapę(łapy) korygowane, a ostatni panel pokazuje ponowne ułożenie na kawałku makaronu.

Rysunek 3. Pozycje kończyny prowadzącej i chwytnej u szczurów i myszy, gdy makaron jest (A,C) długi oraz (B,D) krótki.

Dyskusja

W tym filmie demonstrujemy, w jaki sposób przeprowadza się testy manipulacji makaronem typu vermicelli (u szczurów) oraz capellini (u myszy). Testy te stanowią prosty, ilościowy sposób badania funkcji łap i palców u zdrowych zwierząt, po uszkodzeniu układów ruchowych mózgu lub w procesie starzenia. Analiza wideo w zwolnionym tempie ruchów łap i palców podczas manipulowania małymi kawałkami surowego makaronu pozwala badaczowi na ilościowe określenie korekt wykonywanych każdą z łap, a także na obserwację nieprawidłowych zachowań, które mogą wystąpić po eksperymentalnie wywołanym uszkodzeniu ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Sesje testowe można powtarzać w różne dni, a większość zwierząt kończy wszystkie próby w ramach jednej sesji w ciągu kilku minut. Dzięki temu test ten nadaje się do włączenia w skład szerszej baterii testów lub projektu eksperymentalnego. Testy te mogą być również wykorzystywane w badaniach nad uczeniem się umiejętności motorycznych (Xu et al., 2009), jednak w niniejszym materiale przedstawiamy protokół służący do oceny zmian w nabytej umiejętności w czasie.

Obecnie testy sprawnego sięgania są najczęściej stosowanymi badaniami zręczności funkcji kończyn przednich u szczurów (np. Whishaw et al., 1986; Ballermann et al., 2001; Montoya et al., 1991) i myszy (Farr & Whishaw, 2002; Tennant & Jones, 2009; Baird et al., 2001). Testy sięgania umożliwiają izolowane badanie każdej kończyny, podczas gdy manipulowanie makaronem jest zadaniem oburęcznym. Niemniej jednak testy te wykazują podobną czułość na upośledzenia funkcji sprawnej przedniej łapy, a nabywanie umiejętności w obu przypadkach wiąże się z plastycznością reprezentacji kończyny przedniej w korze ruchowej (Xu et al., 2009). W naszym doświadczeniu testy sięgania są bardziej skomplikowane i pracochłonne w wykonaniu, a w przypadku niektórych pytań badawczych opisane tutaj testy mogą stanowić bardziej efektywną alternatywę. Jednak w przeciwieństwie do metod opisanych w niniejszym opracowaniu, testy sprawnego sięgania są stosowane od dziesięcioleci (Peterson, 1934) i obejmują obecnie wszechstronny zestaw bardzo czułych miar i parametrów testowych (Ballermann et al., 2001; Farr & Whishaw, 2002; Montoya et al., 1991; Whishaw et al., 1992). Z kolei testy manipulowania Vermicelli i Capellini wywodzą się z relatywnie niedawnych charakterystyk zręcznego zachowania szczurów przy manipulowaniu pożywieniem (Whishaw i Coles, 1996). Zarówno w zakresie przeprowadzania, jak i analizy, testy te mogłyby zostać bez wątpienia dalej udoskonalone i rozszerzone, np. w celu dokładniejszego ilościowego określenia wzorców ruchów palców oraz ruchów oburęcznych, a także kwantyfikacji skoordynowanych ruchów języka, pyska i żuchwy.