Testy manipulacji nitkami vermicelli i capellini: proste ilościowe pomiary sprawności chwytnej przedniej łapy u szczurów i myszy

Podsumowanie

Testy manipulacji Vermicelli i Capellini służące do oceny sprawności przednich łap wykorzystują naturalną skłonność gryzoni do manipulowania produktami spożywczymi za pomocą precyzyjnych ruchów przednich łap i palców. Zwierzęta są nagrywane podczas manipulowania krótkimi nitkami surowego, suchego makaronu. Odtwarzanie wideo w zwolnionym tempie umożliwia ilościową ocenę korekt ułożenia przednich łap.

Streszczenie

Poprzednie charakterystyki zachowań żywieniowych gryzoni wykazały, że wykorzystują one skoordynowane ruchy przednich łap do manipulowania kawałkami pokarmu. Rozszerzyliśmy te badania, aby opracować prostą ilościową miarę sprawności przednich łap, która jest czuła na zaburzenia lateralizowane oraz zmiany zależne od wieku. Gryzonie uczą się zręcznych ruchów przednimi łapami i palcami, aby radzić sobie z cienkimi kawałkami makaronu, które chętnie spożywają. Opisaliśmy wcześniej metody ilościowego pomiaru manipulowania makaronem typu vermicelli u szczurów i wykazaliśmy, że miary te są bardzo czułe na upośledzenia kończyn przednich wynikające z jednostronnych uszkodzeń niedokrwiennych, zamknięć środkowej tętnicy mózgowej oraz jednostronnego wyczerpania dopaminy w prążkowiu [Allred, R.P., Adkins, D.L., Woodlee, M.T., Husbands, L.C., Maldonado M.A., Kane, J.R., Schallert, T. & Jones, T.A. The Vermicelli Handling Test: a simple quantitative measure of dexterous forepaw function in rats.J. Neurosci. Methods170, 229-244 (2008)]. W niniejszej pracy przedstawiamy bardziej szczegółowy protokół tego testu dla szczurów oraz porównujemy go z nowo opracowaną wersją dla myszy – testem manipulacji makaronem Capellini (Capellini Handling Test). Szczury i myszy są nagrywane podczas manipulowania odpowiednio krótkimi kawałkami surowego makaronu vermicelli lub capellini, przy użyciu kamery ustawionej tak, aby zoptymalizować widoczność ruchów łap. Odtwarzanie wideo w zwolnionym tempie umożliwia identyfikację korekt przednimi łapami, definiowanych jako każde wyraźne odstawienie i ponowne położenie łapy lub dowolnej liczby palców na kawałku makaronu po rozpoczęciu jedzenia. Liczbę korekt przednimi łapami na jeden kawałek uśrednia się z prób w ramach każdej sesji testowej. Powtarzane testy pozwalają na czułą analizę ilościową zmian w zręczności przednich łap w czasie. Opisano protokoły habituacji przed testowaniem i ćwiczeń w manipulacji, a także procedury charakteryzowania nietypowych wzorców manipulacji. Ponieważ szczury i myszy wykonują testy manipulacji makaronem nieco inaczej, podkreślono różnice gatunkowe w przeprowadzaniu i punktacji tych testów. Wszystkie prace z udziałem zwierząt były zgodne z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu Teksańskiego w Austin (University of Texas at Austin Animal Care and Use Committee).

Protokół

1. Przygotowanie do rozpoczęcia testów

1. Surowe kawałki makaronu są przycinane na odpowiednią długość za pomocą żyletki. W przypadku szczurów makaron typu vermicelli marki Skinner (średnica 1,5 mm) jest cięty na odcinki o długości 7 cm. W przypadku myszy makaron typu capellini marki DeCecco (średnica 1,0 mm) jest cięty na odcinki o długości 2,6 cm (Rys. 1C). Ponieważ marki makaronów różnią się teksturą i średnicą, co może wpływać na sposób manipulowania nimi, zaleca się stosowanie makaronu z jednego źródła podczas powtarzalnych testów.
2. Aby przełamać reakcje neofobiczne i wypracować umiejętność manipulowania pokarmem, zwierzęta są kilkakrotnie eksponowane na kawałki makaronu w klatkach domowych w tygodniach poprzedzających testy. (Zazwyczaj wystarczające jest 5-10 dni ekspozycji, podając około 4 kawałków za każdym razem).
3. Jeśli test ma być przeprowadzony w komorze innej niż klatka domowa lub jeśli klatka domowa jest przenoszona w celu przeprowadzenia testu, zapewnia się habituację do jedzenia w środowisku testowym. (Zazwyczaj potrzeba 3-5 sesji, aż zwierzęta zaczną chętnie jeść makaron w tym środowisku).
4. Nawet po tym, jak zwierzęta chętnie przyjmują makaron, mogą nagle stać się niechętne, gdy w pobliżu obszaru testowego zostanie ustawiona duża kamera. Pomocne jest umieszczenie kamery przed środowiskiem testowym podczas jednej lub większej liczby sesji habituacyjnych.
5. Ponieważ większość zwierząt zachowuje się tak, jakby makaron był bardzo smaczny, ograniczanie dostępu do pokarmu przed testami nie jest niezbędne. Jednakże usunięcie pokarmu na kilka godzin przed testem lub na noc może ułatwić jedzenie w obecności eksperymentatora i kamery oraz zapewnić, że zwierzęta nie będą syte w czasie testu.
6. Przełamanie kawałka makaronu podczas jedzenia unieważnia próbę. Stwierdzono, że nawyku tego można w dużej mierze uniknąć, jeśli zwierzęta nigdy nie otrzymują kawałków dłuższych niż te używane w testach.
7. Na potrzeby sesji testowych kawałki makaronu są znakowane cienkopisem w określonych odstępach przy użyciu szablonu z brystolu (co 1,75 cm w przypadku vermicelli i co 0,86 cm w przypadku capellini). Ułatwia to wizualizację ruchu nitki makaronu podczas jedzenia.

2. Przygotowanie układu testowego

1. Zwierzęta powinny być badane w klatce domowej lub w innym aparacie z gładkimi, przezroczystymi ściankami i powinny być odizolowane od współlokatorów podczas sesji testowej.
2. Choć doświadczony eksperymentator może badać szczury w czasie rzeczywistym (Allred et al., 2008), kwantyfikacja jest ułatwiona dzięki rejestracji wideo, co pozwala na zbieranie danych podczas odtwarzania obrazu w zwolnionym tempie. W przypadku myszy, ze względu na niewielki rozmiar łap i szybkość ich ruchów, nie uznano za możliwe wiarygodne określenie ilościowe ruchów przednich łap bez użycia wideo w zwolnionym tempie.
3. Należy użyć kamery wideo o wysokiej częstotliwości klatek i odpowiednim przybliżeniu. Stosujemy kamerę Canon XL1S z obiektywem z 16-krotnym zoomem, z czasem otwarcia migawki ustawionym na co najmniej 420 s-1 w normalnych warunkach oświetlenia pomieszczenia. Pozycjonowanie kamery ułatwia zastosowanie statywu na kółkach z głowicą panoramiczną i pochyłą.
4. Szczury zazwyczaj siedzą wyprostowane na tylnych łapach, jedząc makaron; łapy są najlepiej widoczne, gdy kamera znajduje się mniej więcej na poziomie dna komory, pod lekkim kątem skierowanym w górę (Rys. 1A). W przypadku testów w klatce z trocinami, usunięcie części ściółki może być pomocne w optymalizacji widoku.
5. Myszy podczas jedzenia makaronu mają tendencję do pochylania się do przodu, trzymając kawałek pod większym kątem niż szczury. Dlatego komorę testową z otwartym dnem umieszcza się na lustrze. Kamerę ustawia się nieco powyżej poziomu podłoża i kieruje w dół, aby skupić się na odbiciu łap w lustrze (Rys. 1B). Zastosowanie lustra pierwszopowierzchniowego znacznie poprawia wyraźność obrazu łap podczas odtwarzania wideo.
6. Każdy kęs kawałka makaronu jest słyszalny, dlatego rejestracja audio jest przydatna do weryfikacji procesu jedzenia.

3. Przeprowadzenie prób manipulowania makaronem

1. Sesje testowe składają się z sekwencyjnych prób, w każdej z których zwierzę zjada jeden kawałek makaronu. Zazwyczaj rejestrujemy dane z 4–5 prób na szczura i 3–4 prób na mysz.
2. Przed rozpoczęciem nagrywania w komorze umieszcza się kawałek makaronu, aby zainicjować jedzenie i wprowadzić zwierzę w odpowiednie pole widzenia kamery.
3. Konieczne jest, aby zwierzę było zwrócone przodem do kamery, a ostrość i powiększenie zostały ustawione w stopniu wystarczającym (~10-12X), aby widzieć poszczególne korekty wykonywane obiema przednimi łapami i wszystkimi palcami. Kostki obu łap powinny być widoczne. Przynajmniej w przypadku tej kamery uważamy za przydatne używanie funkcji autofokusa wyłącznie przed rozpoczęciem próby, aby zawęzić pole widzenia do obszaru zainteresowania. Następnie przełączamy się na manualne ustawianie ostrości.
4. Gdy tylko zwierzę i kamera znajdą się w odpowiedniej pozycji, rozpoczyna się pierwsza próba. Kawałek makaronu jest upuszczany lub zawieszany bezpośrednio przed zwierzęciem, a nagrywanie jest uruchamiane przed rozpoczęciem jedzenia.
5. Następnie próby są przeprowadzane bezpośrednio jedna po drugiej. Zaleca się minimalizowanie opóźnień między próbami, aby zwierzęta nie oddalały się od optymalnej pozycji widoczności.
6. Próby, w których łapy są widoczne z boku lub w których utracono ostrość, nie są punktowane.
7. Sesje testowe można powtarzać w kolejne dni, np. w celu udokumentowania czasowych wzorców przed i po leczeniu (np. regeneracja po uszkodzeniu OUN; Allred et al., 2008).
8. Wyzwaniem może być skłonienie zwierząt do jedzenia w pożądanych pozycjach względem kamery. Może być konieczne przyzwyczajenie zwierząt unikających kamery do jej obecności przez kilka minut przed testowaniem. Zwierzęta można często nakłonić do zajęcia odpowiedniej pozycji, upuszczając lub zawieszając makaron w idealnym obszarze. Aby osiągnąć pożądane ustawienie, może być potrzebnych kilka kawałków, choć liczbę podawanych porcji należy zminimalizować, aby uniknąć sytości.
9. W przypadku sekwencyjnego testowania kilku szczurów uznaliśmy za wygodne ustawienie kilku ich klatek naraz w kole, z kamerą na statywie z kółkami w środku. Kawałek makaronu jest upuszczany w idealny obszar każdej klatki, a następnie kamera jest przesuwana do szczura, który pierwszy zacznie jeść w odpowiedniej pozycji. Pozwala to wolniejszym (pod kątem jedzenia w pozycji) szczurom na dłuższe przyzwyczajenie się do obecności kamery i eksperymentatora, a dodatkowo mogą one zostać pobudzone do jedzenia dźwiękami gryzienia u szybszych osobników.

4. Ilościowa analiza wideo korekt przednich łap i czasu jedzenia

1. Analiza korekt przednich łap podczas jedzenia jest prostą miarą ilościową, która wykazuje czułość na lateralizowane deficyty po uszkodzeniu OUN u szczurów (Allred i wsp., 2008; Whishaw & Coles, 1996; Whishaw i wsp., 1997) oraz do zmian związanych ze starzeniem się u myszy (Tennant i wsp.., 2009).
2. Kwantyfikowana część próby rozpoczyna się w momencie umieszczenia kawałka makaronu w pysku i kończy się, gdy ostatnia część makaronu zostanie zwolniona z łap i zniknie w pysku. 
3. Odtwarzanie wideo jest spowolnione (~ 50% czasu rzeczywistego) lub stosowane jest przesuwanie klatka po klatce, w zależności od potrzeb, aby zidentyfikować konieczne korekty.
4. Korektę odnotowuje się za każdym razem, gdy łapa puszcza i ponownie kontaktuje się z kawałkiem makaronu, gdy następuje ponowne uchwycenie elementu przez łapę lub gdy występuje wyprost-zgięcie bądź odwiedzenie-przywodzenie palców (Rys. 2). Każda korekta jest rejestrowana oddzielnie dla lewej i prawej łapy.
5. Korekty są nie liczone, gdy łapa przesuwa się po kawałku makaronu bez ruchu palców lub zmiany ułożenia łapy. Ruchy łapy, gdy nie ma ona kontaktu z kawałkiem makaronu (tzn. ruchy obok kawałka), również nie są liczone.
6. Czas spożycia jest również rejestrowany dla każdej próby, rozpoczynając od momentu rozpoczęcia jedzenia i kończąc w chwili znikania makaronu w ustach. Czas rejestrujemy za pomocą funkcji wyświetlania odtwarzania wideo, ale można go również mierzyć stoperem podczas odtwarzania z normalną prędkością.
7. Jeśli zwierzę przerwie jedzenie, ale nadal trzyma kawałek, czas przerwy odejmuje się od czasu całkowitego. O przerwaniu jedzenia świadczy albo przesunięcie kawałka poza jamę ustną, albo ustanie słyszalnego gryzienia.
8. Próbę pomija się w analizie, jeśli w dowolnym momencie spożywania pokarmu widoczność łap jest ograniczona lub jeśli zwierzę rozłamie kawałek, ponieważ krótsze fragmenty zmieniają wzorce manipulacji.
9. Niektóre szczury i myszy konsekwentnie wykonują więcej korekt jedną łapą niż drugą. W modelach jednostronnych uszkodzeń OUN deficyty lateralizowane są wykrywane z większą czułością, jeśli uszkodzenia dotyczą łapy, która wykonywała więcej korekt podczas testów przed uszkodzeniem (Allred i wsp.., 2008).
10. Myszy czasami upuszczają kawałek makaronu w trakcie jedzenia, a po krótkiej przerwie podnoszą go i kontynuują posiłek. Zjawisko to występuje najczęściej podczas ostatniej próby w ciągu dnia, co może wynikać z częściowego nasycenia i utraty koncentracji na jedzeniu. Ponieważ jest to powszechne nawet u myszy nienaruszonego stanu, nie pomijamy tych prób. Czas, w którym kawałek został upuszczony, jest jednak odejmowany od całkowitego czasu jedzenia.
11. U szczurów nienaruszonych upuszczanie kawałków pokarmu jest nietypowe, a powrót do jedzenia jest często znacznie opóźniony lub nie występuje. Takie próby są pomijane w analizie korekt i czasu jedzenia.
12. Korekty dokonywane przed rozpoczęciem jedzenia nie są wliczane. Zachowania manipulacyjne poprzedzające jedzenie są zaburzone w wyniku uszkodzeń ośrodkowego układu nerwowego (np. Whishaw i wsp.., 1992; Whishaw i wsp.., 1986), jednak nie rozszerzyliśmy jeszcze ilościowych metod analizy korekt przednich łap na ten okres.
13. Dane te można podsumować jako: (a) średnią liczbę korekt na łapę na sztukę, (b) średni czas jedzenia jednej sztuki oraz (c) częstość korekt (liczba korekt/czas jedzenia).

5. Analiza wideo nietypowych wzorców manipulacji

1. Atypowe wzorce chwytania mogą pozwolić na rozróżnienie różnych typów uszkodzeń OUN u szczurów (Allred et al., 2008), a rejestrowanie tych zachowań może być przydatne jako analiza uzupełniająca.
2. Wzorce chwytania są uznawane za atypowe, jeśli rzadko obserwuje się je u zwierząt zdrowych. Zwierzęta zdrowe zazwyczaj rozpoczynają jedzenie od jednej łapy, tzw. „łapy chwytającej”, umieszczonej niżej na kawałku makaronu, podczas gdy „łapa prowadząca” zostaje umieszczona bliżej pyska (Rys. 3A,C). Zazwyczaj ta sama łapa pełni funkcję łapy chwytającej we wszystkich próbach. Szczury często na początku ustawiają łapy w dużej odległości od siebie wzdłuż długości makaronu, a następnie zbliżają je do siebie w miarę skracania się kawałka. Myszy zazwyczaj ustawiają obie łapy blisko pyska, trzymając kończynę chwytającą i prowadzącą blisko siebie, nawet na początku jedzenia. U obu gatunków łapy przyjmują bardziej symetryczne pozycje, obok siebie lub z przeplatanymi palcami, gdy kawałek jest bardzo krótki (Rys. 3B,D). Obie łapy są stale wykorzystywane do prowadzenia, trzymania lub przesuwania makaronu podczas jedzenia.
3. Atypowe wzorce ułożenia łap u szczurów i myszy obejmują: (a.) ustawienie łap razem, w symetrycznym chwycie, gdy kawałek makaronu jest długi (więcej niż połowa pierwotnej długości), (b.) brak przejścia łap w pozycję symetryczną przed całkowitym zjedzeniem kawałka oraz (c.) zamianę pozycji kończyny prowadzącej i chwytającej w trakcie jedzenia.
4. Dwiema dodatkowymi atypowymi zachowaniami u szczurów i myszy są: (a.) brak kontaktu jednej z łap z kawałkiem makaronu przez dłuższy czas podczas jedzenia („brak kontaktu”) oraz (b.) używanie pyska do przeciągania makaronu przez łapy w celu ich repozycjonowania („przeciąganie pyskiem”).
5. Dwa zachowania są uznawane za atypowe dla szczurów, ale typowe dla myszy: (a.) przygarbiona postawa oraz (b.) upuszczenie kawałka makaronu po rozpoczęciu jedzenia. Jednakże częstotliwość upuszczania u myszy może wzrosnąć po uszkodzeniu OUN. Dlatego rejestrujemy częstotliwość upuszczania u obu gatunków.
6. Inne atypowe zachowania zaobserwowano w modelu jednostronnej deplecji dopaminy w prążkowiu u szczurów: (a.) „żelazny chwyt”, w którym kończyna chwytająca pozostaje w nieruchomej, sztywnej pozycji podczas jedzenia, (b.) powtarzające się ruchy łapy prowadzącej wokół sztywnej łapy chwytającej oraz (c.) ekstremalne przechylanie głowy, gdy makaron jest wprowadzany do pyska pod kątem (Allred et al., 2008; patrz również Whishaw et al. 1997).
7. Zaobserwowaliśmy, że starsze myszy często wykonują korekty, które są nieskuteczne w przemieszczaniu makaronu do pyska. W związku z tym korekty, które nie skutkują widocznym przesunięciem kawałka makaronu w stronę pyska, są rejestrowane osobno.
8. Zamianę kończyn prowadzącej i chwytającej, brak kontaktu, upuszczenia oraz przeciąganie pyskiem rejestruje się dla każdego wystąpienia, natomiast wszystkie pozostałe atypowe zachowania rejestruje się raz na próbę.

6. Reprezentatywne wyniki

Wyniki analizy wideo powinny obejmować liczbę korekt każdej łapy w każdej próbie oraz czas potrzebny na zjedzenie każdego kawałka makaronu. Wyniki uzyskane u szczurów z uszkodzeniami kory sensorimotorycznej lub niedokrwieniem mózgu wskazują, że zwierzęta wykonują mniej korekt kończyną upośledzoną (przeciwległą do miejsca uszkodzenia), co jest efektem utrzymującym się przez co najmniej miesiąc po urazach. Jednostronna deplekcja dopaminy skutkuje zarówno zmniejszeniem liczby korekt kończyną przeciwległą, jak i zwiększeniem liczby korekt kończyną ipsilateralną (Allred et al., 2008). Wyniki uzyskane u myszy wykazują, że zwierzęta w starszym wieku potrzebują więcej czasu na zjedzenie kawałków makaronu i wykonują więcej korekt, które nie prowadzą do przesunięcia makaronu do pyska, w porównaniu z młodymi dorosłymi myszami (Tennant et al., 2009). Analiza tych testów może obejmować również obserwacje nietypowych zachowań manipulacyjnych. Uszkodzenia prążkowia oraz okluzja środkowej tętnicy mózgowej skutkowały dodatkowo zwiększoną częstotliwością nieprawidłowych zachowań podczas jedzenia (Allred et al., 2008).

Rysunek 1. Postawa podczas manipulowania makaronem u (A) szczurów i (B) myszy. Zauważmy, że szczury siadają na tylnych łapach, podczas gdy myszy pochylają się nad makaronem, co wymaga umieszczenia lustra pod myszą w celu obserwacji ruchów łap. (C) Przykłady kawałków makaronu przygotowanych do testów.

Rysunek 2. Przykład korekty przedniej łapy u (A-C) szczura oraz (D-F) myszy. Pierwszy panel przedstawia zwierzę przed korektą, środkowy panel pokazuje proces korekty przedniej łapy, gdzie gwiazdką oznaczono łapę (lub łapy) korygowaną, a ostatni panel przedstawia ponowne ustawienie na kawałku makaronu.

Rysunek 3. Pozycje kończyny prowadzącej i chwytnej u szczurów i myszy w przypadku (A,C) długiego i (B,D) krótkiego makaronu.

Dyskusja

W tym filmie demonstrujemy, w jaki sposób przeprowadza się testy manipulacji makaronem typu vermicelli (u szczurów) oraz capellini (u myszy). Testy te stanowią prosty, ilościowy sposób badania funkcji łap i palców u zdrowych zwierząt, po uszkodzeniu układów ruchowych mózgu lub w procesie starzenia. Analiza wideo w zwolnionym tempie ruchów łap i palców podczas manipulowania małymi kawałkami surowego makaronu pozwala badaczowi na ilościowe określenie korekt wykonywanych każdą z łap, a także na obserwację nieprawidłowych zachowań, które mogą wystąpić po eksperymentalnie wywołanym uszkodzeniu ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Sesje testowe można powtarzać w różne dni, a większość zwierząt kończy wszystkie próby w ramach jednej sesji w ciągu kilku minut. Dzięki temu test ten nadaje się do włączenia w skład szerszej baterii testów lub projektu eksperymentalnego. Testy te mogą być również wykorzystywane w badaniach nad uczeniem się umiejętności motorycznych (Xu et al., 2009), jednak w niniejszym materiale przedstawiamy protokół służący do oceny zmian w nabytej umiejętności w czasie.

Obecnie testy sprawnego sięgania są najczęściej stosowanymi badaniami zręczności funkcji kończyn przednich u szczurów (np. Whishaw et al., 1986; Ballermann et al., 2001; Montoya et al., 1991) i myszy (Farr & Whishaw, 2002; Tennant & Jones, 2009; Baird et al., 2001). Testy sięgania umożliwiają izolowane badanie każdej kończyny, podczas gdy manipulowanie makaronem jest zadaniem oburęcznym. Niemniej jednak testy te wykazują podobną czułość na upośledzenia funkcji sprawnej przedniej łapy, a nabywanie umiejętności w obu przypadkach wiąże się z plastycznością reprezentacji kończyny przedniej w korze ruchowej (Xu et al., 2009). W naszym doświadczeniu testy sięgania są bardziej skomplikowane i pracochłonne w wykonaniu, a w przypadku niektórych pytań badawczych opisane tutaj testy mogą stanowić bardziej efektywną alternatywę. Jednak w przeciwieństwie do metod opisanych w niniejszym opracowaniu, testy sprawnego sięgania są stosowane od dziesięcioleci (Peterson, 1934) i obejmują obecnie wszechstronny zestaw bardzo czułych miar i parametrów testowych (Ballermann et al., 2001; Farr & Whishaw, 2002; Montoya et al., 1991; Whishaw et al., 1992). Z kolei testy manipulowania Vermicelli i Capellini wywodzą się z relatywnie niedawnych charakterystyk zręcznego zachowania szczurów przy manipulowaniu pożywieniem (Whishaw i Coles, 1996). Zarówno w zakresie przeprowadzania, jak i analizy, testy te mogłyby zostać bez wątpienia dalej udoskonalone i rozszerzone, np. w celu dokładniejszego ilościowego określenia wzorców ruchów palców oraz ruchów oburęcznych, a także kwantyfikacji skoordynowanych ruchów języka, pyska i żuchwy.