Testy manipulacji nitkami vermicelli i capellini: proste ilościowe pomiary sprawności chwytnej przedniej łapy u szczurów i myszy

Podsumowanie

Testy manipulacji Vermicelli i Capellini służące do oceny sprawności przednich łap wykorzystują naturalną skłonność gryzoni do manipulowania produktami spożywczymi za pomocą precyzyjnych ruchów przednich łap i palców. Zwierzęta są nagrywane podczas manipulowania krótkimi nitkami surowego, suchego makaronu. Odtwarzanie wideo w zwolnionym tempie umożliwia ilościową ocenę korekt ułożenia przednich łap.

Streszczenie

Poprzednie charakterystyki zachowań żywieniowych gryzoni wykazały, że wykorzystują one skoordynowane ruchy przednich łap do manipulowania kawałkami pokarmu. Rozszerzyliśmy te badania, aby opracować prostą ilościową miarę sprawności przednich łap, która jest czuła na zaburzenia lateralizowane oraz zmiany zależne od wieku. Gryzonie uczą się zręcznych ruchów przednimi łapami i palcami, aby radzić sobie z cienkimi kawałkami makaronu, które chętnie spożywają. Opisaliśmy wcześniej metody ilościowego pomiaru manipulowania makaronem typu vermicelli u szczurów i wykazaliśmy, że miary te są bardzo czułe na upośledzenia kończyn przednich wynikające z jednostronnych uszkodzeń niedokrwiennych, zamknięć środkowej tętnicy mózgowej oraz jednostronnego wyczerpania dopaminy w prążkowiu [Allred, R.P., Adkins, D.L., Woodlee, M.T., Husbands, L.C., Maldonado M.A., Kane, J.R., Schallert, T. & Jones, T.A. The Vermicelli Handling Test: a simple quantitative measure of dexterous forepaw function in rats.J. Neurosci. Methods170, 229-244 (2008)]. W niniejszej pracy przedstawiamy bardziej szczegółowy protokół tego testu dla szczurów oraz porównujemy go z nowo opracowaną wersją dla myszy – testem manipulacji makaronem Capellini (Capellini Handling Test). Szczury i myszy są nagrywane podczas manipulowania odpowiednio krótkimi kawałkami surowego makaronu vermicelli lub capellini, przy użyciu kamery ustawionej tak, aby zoptymalizować widoczność ruchów łap. Odtwarzanie wideo w zwolnionym tempie umożliwia identyfikację korekt przednimi łapami, definiowanych jako każde wyraźne odstawienie i ponowne położenie łapy lub dowolnej liczby palców na kawałku makaronu po rozpoczęciu jedzenia. Liczbę korekt przednimi łapami na jeden kawałek uśrednia się z prób w ramach każdej sesji testowej. Powtarzane testy pozwalają na czułą analizę ilościową zmian w zręczności przednich łap w czasie. Opisano protokoły habituacji przed testowaniem i ćwiczeń w manipulacji, a także procedury charakteryzowania nietypowych wzorców manipulacji. Ponieważ szczury i myszy wykonują testy manipulacji makaronem nieco inaczej, podkreślono różnice gatunkowe w przeprowadzaniu i punktacji tych testów. Wszystkie prace z udziałem zwierząt były zgodne z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu Teksańskiego w Austin (University of Texas at Austin Animal Care and Use Committee).

Protokół

1. Przygotowanie do rozpoczęcia testów

1. Kawałki surowego makaronu są przycinane na odpowiednią długość za pomocą żyletki. W przypadku szczurów makaron vermicelli marki Skinner (średnica 1,5 mm) jest przycinany do długości 7 cm. W przypadku myszy makaron capellini marki DeCecco (średnica 1,0 mm) jest przycinany do długości 2,6 cm (Rys. 1C). Ze względu na to, że marki makaronu różnią się teksturą i średnicą, co może wpływać na sposób manipulacji, zaleca się stosowanie makaronu z jednego źródła podczas powtarzalnych testów.
2. Aby przełamać reakcje neofobiczne i wypracować umiejętność manipulacji, zwierzęta są kilkakrotnie wystawiane na kontakt z kawałkami makaronu w ich domowej klatce w tygodniach poprzedzających testy. (Zazwyczaj wystarczające jest 5–10 dni ekspozycji, przy około 4 kawałkach za każdym razem).
3. Jeśli test będzie przeprowadzany w komorze innej niż domowa klatka lub jeśli domowa klatka zostanie przeniesiona na potrzeby testów, przeprowadza się habituację do jedzenia w środowisku testowym. (Zazwyczaj potrzeba 3–5 sesji, zanim zwierzęta zaczną chętnie jeść makaron w tym środowisku).
4. Nawet po tym, jak zwierzęta chętnie przyjmują makaron, mogą nagle stać się powściągliwe, gdy w pobliżu obszaru testowego zostanie umieszczona duża kamera. Pomocne jest ustawienie kamery przed środowiskiem testowym podczas jednej lub większej liczby sesji habituacji.
5. Ponieważ większość zwierząt traktuje makaron jako produkt bardzo smaczny, ograniczenie dostępu do pożywienia przed testami nie jest niezbędne. Jednakże usunięcie pokarmu na kilka godzin przed testem lub na noc może ułatwić jedzenie w obecności eksperymentatora i kamery oraz zapewnić, że zwierzęta nie będą syte w czasie badania.
6. Złamanie kawałka makaronu podczas jedzenia unieważnia próbę. Stwierdzono, że nawyku tego można w dużej mierze uniknąć, jeśli zwierzęta nigdy nie otrzymują kawałków dłuższych niż te używane w testach.
7. Do sesji testowych kawałki makaronu są znakowane markerem z cienką końcówką w określonych odstępach za pomocą szablonu z brystolu (interwały 1,75 cm dla vermicelli i 0,86 cm dla capellini). Ułatwia to wizualizację ruchu nitki makaronu podczas jedzenia.

2. Przygotowanie układu testowego

1. Zwierzęta należy badać w klatce macierzystej lub w innym aparacie z przejrzystymi, nieuszkodzonymi ściankami; podczas sesji testowej zwierzęta powinny być odizolowane od współlokatorów.
2. Choć szczury mogą być badane w czasie rzeczywistym przez doświadczonego eksperymentatora (Allred et al., 2008), kwantyfikację ułatwia rejestracja wideo, która pozwala na zbieranie danych podczas odtwarzania obrazu w zwolnionym tempie. W przypadku myszy nie uznano za możliwe wiarygodne kwantyfikowanie ruchów przednich łap bez zastosowania slow-motion ze względu na niewielki rozmiar łap i szybkość ich ruchów.
3. Należy użyć kamery wideo o wysokiej częstotliwości odświeżania obrazu i odpowiednim zoomie. Stosujemy kamerę Canon XL1S z obiektywem z 16-krotnym przybliżeniem, z prędkością migawki ustawioną na co najmniej 420 s-1 w normalnych warunkach oświetlenia pomieszczenia. Pozycjonowanie kamery ułatwia zastosowanie statywu na kółkach z głowicą panoramiczną i pochylną.
4. Szczury podczas jedzenia makaronu zazwyczaj siedzą wyprostowane na tylnych łapach, a ruchy przednich łap są najlepiej widoczne, gdy kamera znajduje się mniej więcej na poziomie dna komory, pod lekkim kątem skierowanym w górę (Ryc. 1A). W przypadku badania w klatce z wiórkami, pomocne dla optymalizacji widoczności może być usunięcie części ściółki.
5. Myszy podczas jedzenia makaronu mają tendencję do pochylania się do przodu, trzymając kawałek pod większym kątem niż szczury. Dlatego komorę testową z otwartym dnem ustawia się na lustrze. Kamerę umieszcza się nieco powyżej poziomu dna i kieruje w dół, aby skupić się na odbiciu łap w lustrze (Ryc. 1B). Zastosowanie lustra pierwszopowierzchniowego znacznie poprawia klarowność obrazu łap podczas odtwarzania wideo.
6. Każdy kęs kawałka makaronu jest słyszalny, dlatego rejestracja audio jest przydatna do weryfikacji procesu jedzenia.

3. Przeprowadzanie prób manipulacji makaronem

1. Sesje testowe składają się z sekwencyjnych prób, w każdej z których zjadany jest jeden kawałek makaronu. Zazwyczaj rejestrujemy dane z 4-5 prób na szczura oraz 3-4 prób na mysz.
2. Przed rozpoczęciem nagrywania w komorze umieszcza się kawałek makaronu, aby zainicjować jedzenie i skierować zwierzę w odpowiedni obszar widoczności kamery.
3. Niezbędne jest, aby zwierzę było zwrócone przodem do kamery, a ostrość i przybliżenie były ustawione w stopniu wystarczającym (~10-12X), aby można było dostrzec poszczególne ruchy obu przednich łap i wszystkich palców. Kostki obu łap powinny być widoczne. Przynajmniej w przypadku tej kamery uznajemy za przydatne korzystanie z funkcji autofokusa wyłącznie przed rozpoczęciem próby, aby zawęzić obraz do obszaru zainteresowania. Następnie przełączamy na ustawianie ostrości ręcznie.
4. Gdy zwierzę i kamera znajdą się w odpowiedniej pozycji, rozpoczyna się pierwsza próba. Kawałek makaronu jest upuszczany lub zawieszany bezpośrednio przed zwierzęciem, a nagrywanie uruchamia się przed rozpoczęciem jedzenia.
5. Następnie próby przeprowadzane są w bezpośredniej sekwencji. Zaleca się minimalizowanie opóźnień między próbami, aby zwierzęta nie oddalały się z optymalnej pozycji obserwacyjnej.
6. Próby, w których łapy są widoczne z boku lub w których utracono ostrość, nie są punktowane.
7. Sesje testowe można powtarzać w kolejnych dniach, np. w celu udokumentowania czasowych wzorców przed i po leczeniu (np. regeneracja po urazie OUN; Allred et al., 2008).
8. Wyzwanie może stanowić skłonienie zwierząt do jedzenia w pożądanych pozycjach względem kamery. W przypadku zwierząt unikających kamery konieczne może być ich habituacja do obecności sprzętu przez kilka minut przed testem. Zwierzęta można często zachęcić do zajęcia odpowiedniej pozycji, upuszczając lub zawieszając makaron w idealnym obszarze. Może to wymagać kilku kawałków, jednak liczbę podawanych sztuk należy ograniczyć do minimum, aby uniknąć sytości.
9. W przypadku sekwencyjnego testowania kilku szczurów wygodne okazało się ustawienie kilku ich klatek jednocześnie w okręgu, z kamerą na statywie z kółkami w środku. Kawałek makaronu jest upuszczany w optymalny obszar każdej klatki, a następnie kamera jest przesuwana do szczura, który pierwszy zacznie jeść w odpowiedniej pozycji. Pozwala to wolniejszym szczurowi (pod względem zajmowania pozycji do jedzenia) na dłuższą habituację do obecności kamery i eksperymentatora; mogą one również zostać pobudzone do jedzenia dźwiękami gryzienia u szczurów szybszych.

4. Ilościowa analiza wideo korekt przednich łap i czasu jedzenia

1. Analiza korekt przednich łap podczas jedzenia jest prostą miarą ilościową, która wykazuje czułość w wykrywaniu jednostronnych zaburzeń po uszkodzeniu OUN u szczurów (Allred i wsp., 2008; Whishaw & Coles, 1996; Whishaw i wsp., 1997) oraz do zmian związanych ze starzeniem się u myszy (Tennant i wsp.., 2009).
2. Ilościowa część próby rozpoczyna się w momencie umieszczenia kawałka makaronu w pysku i kończy się, gdy ostatnia część makaronu zostaje zwolniona z łap i znika w pysku. 
3. Odtwarzanie wideo odbywa się w zwolnionym tempie (~50% czasu rzeczywistego) lub stosuje się przesuwanie klatka po klatce, w zależności od potrzeb, aby zidentyfikować dokonane korekty.
4. Korektę liczy się za każdym razem, gdy łapa zwalnia i ponownie styka się z kawałkiem makaronu, gdy następuje ponowne uchwycenie kawałka przez łapę lub gdy występuje wyprost-zgięcie lub odwiedzenie-przywodzenie palców (Rys. 2). Każda korekta jest rejestrowana oddzielnie dla lewej i prawej łapy.
5. Korekty są nie liczone, gdy łapa przesuwa się po kawałku makaronu bez ruchu palców lub zmiany ułożenia łapy. Ruchy łapy, gdy nie pozostaje ona w kontakcie z kawałkiem makaronu (t.j. ruchy obok kawałka), również nie są liczone.
6. Czas spożycia jest również rejestrowany dla każdej próby, począwszy od momentu rozpoczęcia jedzenia, a kończąc w chwili zniknięcia makaronu w ustach. Czas rejestrujemy przy użyciu funkcji odtwarzania wideo, ale można go również mierzyć za pomocą stoperem podczas odtwarzania z normalną prędkością.
7. Jeśli zwierzę przerwie jedzenie, ale nadal trzyma kawałek pokarmu, czas tej przerwy odejmuje się od czasu całkowitego. Przerwę w jedzeniu stwierdza się na podstawie przesunięcia kawałka pokarmu poza obszar jamy ustnej lub ustania słyszalnego gryzienia.
8. Próbę pomija się w analizie, jeśli w dowolnym momencie jedzenia widoczność łap zostanie ograniczona lub jeśli zwierzę rozłupie kawałek, ponieważ krótsze fragmenty zmieniają sposób manipulowania pokarmem.
9. Niektóre szczury i myszy konsekwentnie wykonują więcej korekt jedną łapą niż drugą. W przypadku jednostronnych modeli uszkodzeń OUN deficyty lateralizowane są wykrywane z większą czułością, jeżeli uszkodzenia dotyczą łapy, która wykonywała więcej korekt w testach przed uszkodzeniem (Allred i wsp.., 2008).
10. Myszy czasami upuszczają kawałek makaronu w trakcie jedzenia, a po krótkiej przerwie podnoszą go i kontynuują spożywanie. Zjawisko to występuje najczęściej podczas ostatniej próby w ciągu dnia, co może wynikać z częściowego nasycenia i utraty koncentracji na jedzeniu. Ponieważ sytuacja ta zdarza się często nawet u myszy nienaruszonych, nie pomijamy tych prób. Jednak czas, w którym kawałek pozostawał upuszczony, odejmuje się od całkowitego czasu jedzenia.
11. U nienaruszonych szczurów upuszczanie kawałków jest nietypowe, a powrót do jedzenia jest często znacznie opóźniony lub nie występuje. Takie próby są pomijane w analizie korekt i czasu jedzenia.
12. Korekty przed rozpoczęciem jedzenia nie są wliczane. Zachowania manipulacyjne poprzedzające jedzenie są zaburzone w wyniku uszkodzeń OUN (np. Whishaw i wsp.., 1992; Whishaw i wsp.., 1986), jednak nie rozszerzyliśmy jeszcze metod ilościowych dotyczących korekt przednich łap na ten okres.
13. Dane te można podsumować jako: (a) średnią liczbę korekt na jedną łapę na jeden kawałek, (b) średni czas jedzenia jednego kawałka oraz (c) częstotliwość korekt (liczba korekt/czas jedzenia).

5. Analiza wideo nietypowych wzorców manipulacji

1. Nietypowe wzorce manipulacji mogą pozwalać na rozróżnienie różnych rodzajów uszkodzeń OUN u szczurów (Allred et al., 2008), a rejestrowanie tych zachowań może być przydatne jako analiza uzupełniająca.
2. Wzorce manipulacji uznaje się za nietypowe, jeśli są one rzadko obserwowane u zwierząt nienaruszonych. Zwierzęta nienaruszone zazwyczaj rozpoczynają jedzenie od jednej łapy, „łapy chwytnej”, umieszczonej niżej na makaronie, a następnie „łapa prowadząca” zostaje umieszczona w pobliżu pyska (Rys. 3A,C). Zazwyczaj ta sama łapa pełni funkcję łapy chwytnej we wszystkich próbach. Szczury często początkowo ustawiają łapy daleko od siebie wzdłuż długości makaronu, a następnie zbliżają je do siebie w miarę skracania się kawałka. Myszy zazwyczaj ustawiają obie łapy blisko pyska, trzymając kończyny chwytną i prowadzącą blisko siebie, nawet na początku jedzenia. U obu gatunków łapy przyjmują bardziej symetryczne pozycje, obok siebie lub z przeplatanymi palcami, gdy kawałek jest bardzo krótki (Rys. 3B,D). Obie łapy są używane w sposób ciągły do prowadzenia, trzymania lub przesuwania makaronu podczas jedzenia.
3. Nietypowe wzorce ułożenia łap u szczurów i myszy obejmują: (a.) ustawianie łap razem, w symetrycznym chwycie, gdy kawałek makaronu jest długi (więcej niż połowa pierwotnej długości), (b.) brak przejścia łap w pozycję symetryczną przed całkowitym spożyciem kawałka oraz (c.) zamianę pozycji kończyn prowadzącej i chwytnej w trakcie jedzenia.
4. Dwa dodatkowe nietypowe zachowania u szczurów i myszy to: (a.) brak kontaktu jednej łapy z kawałkiem makaronu przez dłuższy czas podczas jedzenia („brak kontaktu”) oraz (b.) używanie pyska do wciągania makaronu przez łapy w celu ich ponownego ustawienia („wciąganie pyszczkiem”).
5. Dwa zachowania uznaje się za nietypowe dla szczurów, ale są one typowe dla myszy: (a.) zgarbiona postawa oraz (b.) upuszczenie kawałka makaronu po rozpoczęciu jedzenia. Jednak częstotliwość upuszczania u myszy może wzrosnąć po uszkodzeniu OUN. Dlatego rejestrujemy częstotliwość upuszczeń u obu gatunków.
6. Inne nietypowe zachowania zaobserwowano w szczurzym modelu jednostronnego wyczerpania dopaminy w prążkowiu: (a.) „żelazny chwyt”, w którym kończyna chwytna pozostaje w nieruchomej, sztywnej pozycji podczas jedzenia, (b.) powtarzający się ruch łapy prowadzącej wokół sztywnej łapy chwytnej oraz (c.) ekstremalne przechylanie głowy podczas kierowania makaronu do pyska (Allred et al., 2008; patrz również Whishaw et al. 1997).
7. Zaobserwowaliśmy, że starsze myszy często wykonują korekty, które są nieskuteczne w przesuwaniu makaronu do pyska. W związku z tym korekty, które nie skutkują widocznym ruchem kawałka makaronu w stronę pyska, są rejestrowane oddzielnie.
8. Zamiany kończyn prowadzącej i chwytnej, brak kontaktu, upuszczenia oraz wciąganie pyszczkiem są rejestrowane dla każdego wystąpienia, natomiast wszystkie pozostałe nietypowe zachowania są rejestrowane raz na próbę.

6. Reprezentatywne wyniki

Wyniki analizy wideo powinny obejmować liczbę korekt każdej łapy w każdej próbie oraz czas potrzebny na zjedzenie każdego kawałka makaronu. Wyniki uzyskane u szczurów z uszkodzeniami kory sensoryczno-motorycznej lub niedokrwieniem mózgu wskazują, że zwierzęta wykonują mniej korekt kończyną upośledzoną (przeciwną do strony uszkodzenia), co jest efektem utrzymującym się co najmniej miesiąc po urazach. Jednostronne wyczerpanie dopaminy prowadzi zarówno do zmniejszenia liczby korekt kończyną przeciwległą, jak i do zwiększenia liczby korekt kończyną ipsilateralną (Allred et al., 2008). Wyniki uzyskane u myszy wykazują, że zwierzęta starsze potrzebują więcej czasu na zjedzenie kawałków makaronu i wykonują więcej korekt, które nie prowadzą do przesunięcia makaronu do pyska, w porównaniu z młodymi dorosłymi myszami (Tennant et al., 2009). Analiza tych testów może obejmować również obserwacje nietypowych zachowań manipulacyjnych. Uszkodzenie prążkowia oraz zamknięcie tętnicy środkowej mózgu skutkowały dodatkowo zwiększoną częstotliwością występowania nieprawidłowych zachowań podczas jedzenia (Allred et al., 2008).

Rysunek 1. Postawa podczas manipulowania makaronem u (A) szczurów i (B) myszy. Należy zauważyć, że szczury siadają na tylnych łapach, podczas gdy myszy garbią się nad makaronem, co wymaga umieszczenia lustra pod myszą w celu obserwacji ruchów łap. (C) Przykłady kawałków makaronu przygotowanych do testów.

Rycina 2. Przykład korekty ułożenia przedniej łapy u (A-C) szczura oraz (D-F) myszy. Pierwszy panel przedstawia zwierzę przed korektą, panel środkowy pokazuje proces korygowania ułożenia przedniej łapy, gdzie gwiazdką zaznaczono łapę( łapy) korygującą, a ostatni panel pokazuje ponowne oparcie łapy na kawałku makaronu.

Rysunek 3. Pozycje kończyny prowadzącej i chwytającej u szczurów i myszy, gdy makaron jest (A,C) długi i (B,D) krótki.

Dyskusja

W tym filmie demonstrujemy, w jaki sposób przeprowadza się testy manipulacji makaronem typu vermicelli (u szczurów) oraz capellini (u myszy). Testy te stanowią prosty, ilościowy sposób badania funkcji łap i palców u zdrowych zwierząt, po uszkodzeniu układów ruchowych mózgu lub w procesie starzenia. Analiza wideo w zwolnionym tempie ruchów łap i palców podczas manipulowania małymi kawałkami surowego makaronu pozwala badaczowi na ilościowe określenie korekt wykonywanych każdą z łap, a także na obserwację nieprawidłowych zachowań, które mogą wystąpić po eksperymentalnie wywołanym uszkodzeniu ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Sesje testowe można powtarzać w różne dni, a większość zwierząt kończy wszystkie próby w ramach jednej sesji w ciągu kilku minut. Dzięki temu test ten nadaje się do włączenia w skład szerszej baterii testów lub projektu eksperymentalnego. Testy te mogą być również wykorzystywane w badaniach nad uczeniem się umiejętności motorycznych (Xu et al., 2009), jednak w niniejszym materiale przedstawiamy protokół służący do oceny zmian w nabytej umiejętności w czasie.

Obecnie testy sprawnego sięgania są najczęściej stosowanymi badaniami zręczności funkcji kończyn przednich u szczurów (np. Whishaw et al., 1986; Ballermann et al., 2001; Montoya et al., 1991) i myszy (Farr & Whishaw, 2002; Tennant & Jones, 2009; Baird et al., 2001). Testy sięgania umożliwiają izolowane badanie każdej kończyny, podczas gdy manipulowanie makaronem jest zadaniem oburęcznym. Niemniej jednak testy te wykazują podobną czułość na upośledzenia funkcji sprawnej przedniej łapy, a nabywanie umiejętności w obu przypadkach wiąże się z plastycznością reprezentacji kończyny przedniej w korze ruchowej (Xu et al., 2009). W naszym doświadczeniu testy sięgania są bardziej skomplikowane i pracochłonne w wykonaniu, a w przypadku niektórych pytań badawczych opisane tutaj testy mogą stanowić bardziej efektywną alternatywę. Jednak w przeciwieństwie do metod opisanych w niniejszym opracowaniu, testy sprawnego sięgania są stosowane od dziesięcioleci (Peterson, 1934) i obejmują obecnie wszechstronny zestaw bardzo czułych miar i parametrów testowych (Ballermann et al., 2001; Farr & Whishaw, 2002; Montoya et al., 1991; Whishaw et al., 1992). Z kolei testy manipulowania Vermicelli i Capellini wywodzą się z relatywnie niedawnych charakterystyk zręcznego zachowania szczurów przy manipulowaniu pożywieniem (Whishaw i Coles, 1996). Zarówno w zakresie przeprowadzania, jak i analizy, testy te mogłyby zostać bez wątpienia dalej udoskonalone i rozszerzone, np. w celu dokładniejszego ilościowego określenia wzorców ruchów palców oraz ruchów oburęcznych, a także kwantyfikacji skoordynowanych ruchów języka, pyska i żuchwy.