Model mysi eksperymentalnej przerzutowości oraz immunoterapii z adoptywnym transferem limfocytów CTL

Podsumowanie

Eksperymentalny mysi model przerzutów do płuc i immunoterapii CTL do analizy oddziaływań komórek nowotworowych z limfocytami T in vivo.

Streszczenie

Eksperymentalny model przerzutów u myszy jest prostym, a jednocześnie istotnym fizjologicznie modelem przerzutowania. Komórki nowotworowe są wstrzykiwane dożylnie (i.v.) do ogonowych żył myszy, gdzie kolonizują płuca, odzwierciedlając tym samym ostatnie etapy spontanicznego przerzutowania komórek nowotworowych: przeżycie w krwiobiegu, ekstrawazację oraz kolonizację w odległych narządach. Z punktu widzenia terapeutycznego, eksperymentalny model przerzutów jest najprostszym i idealnym modelem, ponieważ celem terapii jest często końcowy etap przerzutowania: utrwalony guz przerzutowy w odległym narządzie. W tym modelu komórki nowotworowe wstrzykuje się dożylnie do ogonowych żył myszy i pozwala im na kolonizację oraz wzrost w płucach. Następnie do myszy z przerzutami wstrzykuje się dożylnie swoiste dla nowotworu limfocyty CTL. Liczbę i wielkość przerzutów w płucach można kontrolować poprzez liczbę wstrzykiwanych komórek nowotworowych oraz czas wzrostu guza. Dzięki temu można modelować różne stadia przerzutowania, od przerzutów minimalnych po rozległe. Przerzuty w płucach analizuje się poprzez wypełnienie ich tuszem, co umożliwia łatwiejszą obserwację wizualną i kwantyfikację.

Protokół

1. Eksperymentalny model mysi przerzutów

1. Dzień przed iniekcjami komórek nowotworowych, zasiać w jednej kolbie T75 do 1 x 10⁷ komórek CMS4-Met w 10 mL pożywki RPMI zawierającej 10% surowicy, aby uzyskać szybko rosnące komórki nowotworowe. Inkubować przez noc w temperaturze 37°C.
2. W dniu iniekcji usunąć pożywkę i raz przepłukać komórki roztworem PBS, a następnie zebrać komórki nowotworowe przy użyciu 0,05% trypsyny-EDTA w temperaturze 37°C przez 5 minut. Zatrzymać reakcję, dodając 10 mL pożywki RPMI zawierającej 10% surowicy. Przenieść komórki do probówki stożkowej.
3. Odwirować komórki przy 1300 rpm w wirówce Sorvall Legend RT przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Usunąć nadosad. Resuspendować komórki w 10 mL świeżego 1X HBSS w celu przemycia, następnie ponownie odwirować i resuspendować w ten sam sposób.
4. Policzyć komórki nowotworowe za pomocą hemocytometru. Rozcieńczyć komórki w HBSS w taki sposób, aby liczba komórek wymagana do każdej iniekcji była zawieszona w całkowitej objętości 100 μL.
5. Ogrzać myszy BALB/c w wieku 6-8 tygodni w zlewce zanurzonej w ciepłej wodzie, aby rozszerzyć żyłę ogonową. Umieścić mysz w stabilizatorze do żyły ogonowej na blacie. Za pomocą mikrosyringi wstrzyknąć 100 μL komórek nowotworowych do bocznej żyły ogonowej. Stosować technikę aseptyczną, aby uniknąć zakażenia. Po iniekcji wywrzeć lekki nacisk na miejsce wkłucia, aż krwawienie ustanie.
6. Przenieść mysz z powrotem do klatki i pozwolić nowotworowi urosnąć do pożądanego stadium.

2. Immunoterapia z wykorzystaniem adoptywnego transferu cytotoksycznych limfocytów T (CTL)

1. W dniu transferu kilkukrotnie pipetuj w górę i w dół, aby resuspender oczyszczone cytotoksyczne limfocyty T (CTL), przygotowane zgodnie z opisem w tekście. Przenieś wszystkie komórki z jednej płytki do stożkowej probówki o pojemności 15 mL, dbając, aby objętość nie przekroczyła 2/3 objętości probówki.
2. Wprowadź sterylną pipetę Pasteura do probówki stożkowej i delikatnie nałóż pod warstwę komórek medium do separacji limfocytów (LSM), aż całkowita objętość zbliży się do 14 mL.
3. Należy uważać, aby nie naruszyć warstw. Wirować z prędkością 2000 rpm przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu nie należy używać hamulca w celu zatrzymania rotora.
4. Przenieś CTL do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 mL. Dodaj HBSS do objętości około 10 mL w celu przemycia.
5. Policz komórki. Wirować z prędkością 1300 rpm przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Resuspender w HBSS do wymaganej gęstości komórkowej dla iniekcji, utrzymując całkowitą objętość jednej iniekcji na poziomie 100 μL.
6. Użyj tej samej techniki iniekcji ogonowej, którą zaprezentowano wcześniej w tym filmie, aby wstrzyknąć CTL myszom z nowotworem.
7. Wróć mysz do klatki i pozwól limfocytom CTL na oddziaływanie z guzem. Myszy są zazwyczaj uśmiercane do analizy 14-21 dni po leczeniu CTL.

3. Wizualizacja przerzutów do płuc

1. Aby zwizualizować przerzuty do płuc, ułożone na plecach uśpnięte myszy umieść na styropianowej płytce. Przymocuj kończyny szpilkami, aby zapewnić niezakłócony dostęp do tchawki. Spryskaj stronę brzuszną 70% etanolem.
2. Zacznij od środkowej części brzucha i za pomocą nożyczek przetnij skórę wzdłuż linii środkowej, przez klatkę piersiową, aż do gruczołów ślinowych. Odsłoń tchawkę. Za pomocą pincety usuń tkanki otaczające tchawkę.
3. Przesuń końcówkę pipety 200 μL pod tchawkę. Trzymając końcówkę jedną ręką, delikatnie unieś tchawkę do góry, oddalając ją od ciała.
4. Obróć platformę o 180°. Użyj strzykawki 50 mL, aby wstrzyknąć tusz indyjski do płuc przez tchawkę. Całkowicie rozdmuchaj płuca tuszem, aż poczujesz silny opór.
5. Za pomocą nożyczek przetnij tchawkę. Wsuń pęsetę pod płuca i wyjmij je z organizmu myszy. Krótko opłucz płuca w zlewce 1L z wodą.
6. W wyciągu chemicznym przenieś płuca do szklanej fiolki scyntylacyjnej zawierającej 5 mL roztworu Fekete. Po kilku minutach tkanka nowotworowa pojawi się w postaci białych guzków na czarnych płucach. Guzy można teraz policzyć i przechowywać w roztworze Fekete w nieskończoność.

4. Reprezentatywne przerzuty w wizualizowanych płucach

1. W tym przypadku płuca myszy, którym wstrzyknięto linię komórkową raka piersi 4T1, wykazują białe plamki wskazujące na obecność guzów. Myszy, którym wstrzyknięto komórki 4T1 przetransfekowane dominującym negatywnym mutantem K79E białka IRF8, wykazują zwiększony potencjał metastatyczny komórek nowotworowych.
2. Obrazy te przedstawiają analizę histologiczną skuteczności immunoterapii z wykorzystaniem adoptywnego transferu CTL. U myszy z nowotworem, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną, 6 dni później stwierdzono liczne guzy, wskazane żółtymi strzałkami (A). Z kolei u myszy, którym wstrzyknięto swoiste dla nowotworu limfocyty T, zaobserwowano redukcję guzów (B).
3. W tym samym eksperymencie zastosowanie tuszu chińskiego stanowi prostszy sposób pomiaru skuteczności adoptywnego transferu CTL. Tutaj białe guzki nowotworowe na płucach z nowotworem wyraźnie odróżniają je od płuc, w których pomyślnie przeprowadzono adoptywny transfer CTL, a zliczanie guzków umożliwia stopień kwantyfikacji nieosiągalny w przypadku badania histologicznego.

5. Reprezentatywne wyniki

Rycina 1. Schemat eksperymentalny dla modelu mysiego do badania przerzutowania nowotworu i immunoterapii z adaptacyjnym transferem CTL. Czerwone kropki oznaczają komórki nowotworowe, a zielone kropki oznaczają CTL.

Rycina 2. Zaburzenie funkcji IRF8 zwiększyło potencjał przerzutowy komórek nowotworowych. Linia komórkowa raka gruczołu mlekowego myszy 4T1 została stabilnie przetransfekowana wektorem (4T1.Vector) lub wektorem wykazującym mutant dominująco-negatywny IRF8 K79E (4T1.IRF8K79E) (15, 16). Komórki nowotworowe wstrzyknięto dożylnie (i.v.) do bocznych żył ogonowych myszy. Płuca z guzami wypełniono tuszem chińskim w celu wizualizacji guzków nowotworowych. Guzki nowotworowe są łatwo widoczne jako białe plamki na czarnym tle tkanki płucnej.

Rycina 3. Analiza histologiczna skuteczności immunoterapii z wykorzystaniem adoptywnego transferu CTL. Mysia linia komórek mięsaka CMS4-Met została wstrzyknięta dożylnie do bocznych żył ogonowych myszy. Trzy dni później myszom z nowotworem wstrzyknięto sól fizjologiczną (A) lub specyficzne dla nowotworu limfocyty T (B). Płuca przeanalizowano sześć dni po leczeniu CTL przy użyciu konwencjonalnego barwienia histologicznego H&E. Guzki nowotworowe zaznaczono strzałkami.

Rysunek 4. Wizualizacja guzków nowotworowych poprzez nadmuchanie tuszem chińskim. Mysia linia komórkowa mięsaka CMS4-Met została wstrzyknięta dożylnie (i.v.) do bocznych żył ogonowych myszy. Trzy dni później myszom z nowotworem wstrzyknięto sól fizjologiczną (Kontrola) lub swoiste dla nowotworu limfocyty T (+CTL). Płuca przeanalizowano czternaście dni po leczeniu CTL. Białe plamki, będące guzkami nowotworowymi, umożliwiają łatwą kwantyfikację skuteczności leczenia CTL.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Roztwory:
Roztwór tuszu indyjskiego (17):
Wlać 150 ml wody destylowanej do kolby o pojemności 250 ml. Dodać 4 krople wodorotlenku amonu do wody destylowanej. Dodać 30 ml roztworu zapasowego tuszu indyjskiego (np. Sanford Black Magic Waterproof Drawing Ink 4465 Item 44011) do mieszaniny amoniaku i wody. Dopełnić wodą destylowaną do objętości 200 ml. Roztwór jest gotowy do wstrzyknięcia.
Roztwór Fekete'a (17):
Roztwór Fekete'a służy do odbarwiania płuc z guzem, w których zastosowano nadmuchanie tuszem indyjskim, aby odróżnić białe guzki nowotworowe od czarnego tła tkanek prawidłowych.
Dodać 350 ml 95% EtOH do szklanej butelki o pojemności 1L. Dodać 150 ml wody destylowanej Dodać 50 ml formaldehydu Dodać 25 ml kwasu octowego lodowatego