Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model mysi eksperymentalnej przerzutowości oraz immunoterapii z adoptywnym transferem limfocytów CTL

19.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2077

⸱

26 listopada 2010

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Medical College of Georgia

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Eksperymentalny mysi model przerzutów do płuc i immunoterapii CTL do analizy oddziaływań komórek nowotworowych z limfocytami T in vivo.

Streszczenie

Eksperymentalny model przerzutów u myszy jest prostym, a jednocześnie istotnym fizjologicznie modelem przerzutowania. Komórki nowotworowe są wstrzykiwane dożylnie (i.v.) do ogonowych żył myszy, gdzie kolonizują płuca, odzwierciedlając tym samym ostatnie etapy spontanicznego przerzutowania komórek nowotworowych: przeżycie w krwiobiegu, ekstrawazację oraz kolonizację w odległych narządach. Z punktu widzenia terapeutycznego, eksperymentalny model przerzutów jest najprostszym i idealnym modelem, ponieważ celem terapii jest często końcowy etap przerzutowania: utrwalony guz przerzutowy w odległym narządzie. W tym modelu komórki nowotworowe wstrzykuje się dożylnie do ogonowych żył myszy i pozwala im na kolonizację oraz wzrost w płucach. Następnie do myszy z przerzutami wstrzykuje się dożylnie swoiste dla nowotworu limfocyty CTL. Liczbę i wielkość przerzutów w płucach można kontrolować poprzez liczbę wstrzykiwanych komórek nowotworowych oraz czas wzrostu guza. Dzięki temu można modelować różne stadia przerzutowania, od przerzutów minimalnych po rozległe. Przerzuty w płucach analizuje się poprzez wypełnienie ich tuszem, co umożliwia łatwiejszą obserwację wizualną i kwantyfikację.

Protokół

1. Eksperymentalny model przerzutów u myszy

  1. Dzień przed iniekcjami komórek nowotworowych zasiej jedną kolbę T75, używając do 1 x 107 komórki CMS4-Met w 10 ml pożywki RPMI zawierającej 10% surowicy, aby uzyskać szybko rosnące komórki nowotworowe. Inkubować przez noc w 37°C.
  2. W dniu iniekcji usunąć medium i raz wypłukać komórki solą PBS, następnie zebrać komórki nowotworowe za pomocą 0,05% trypsyny-EDTA w 37°C przez 5 minut. Reakcję zatrzymano poprzez dodanie 10 ml pożywki RPMI zawierającej 10% surowicy. Komórki przeniesiono do probówki stożkowej.
  3. Odwiruj komórki z prędkością 130 obr./min w wirówce Sorvall Legend RT przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Usuń nadsącz. Resuspenduj komórki w 10 ml świeżego 1X HBSS w celu przemycia, następnie ponownie odwiruj i resuspenduj w ten sam sposób.
  4. Policz komórki nowotworowe za pomocą komory countingowej (hemocytometru). Rozcieńcz komórki w HBSS tak, aby komórki wymagane do każdego wstrzyknięcia zostały zawieszone w całkowitej objętości 100 μL.
  5. Ogrzać myszy BALB/c w wieku 6–8 tygodni, umieszczając je w zlewce zanurzonej w ciepłej wodzie w celu rozszerzenia żyły ogonowej. Umieścić mysz w stabilizatorze do żyły ogonowej na blacie. Za pomocą mikrostrzykawki wstrzyknąć 100 μL komórek nowotworowych do bocznej żyły ogonowej. Należy zastosować technikę aseptyczną, aby uniknąć infekcji. Po wstrzyknięciu należy lekko ucisnąć miejsce iniekcji aż do ustąpienia krwawienia.
  6. Umieść mysz z powrotem w klatce i pozwól guza narastać do pożądanego stadium.

2. Immunoterapia z wykorzystaniem adoptywnego transferu cytotoksycznych limfocytów T (CTL)

  1. W dniu transferu resuspender poprzez pipetowanie w górę i w dół oczyszczone limfocyty T cytotoksyczne (CTL), przygotowane zgodnie z opisem w tekście. Przenieść wszystkie komórki z jednej płytki do probówki stożkowej o pojemności 15 mL, dbając o to, aby objętość nie przekroczyła 2/3 objętości probówki.
  2. Wprowadzić sterylną pipetę Pasteura do probówki stożkowej i ostrożnie nanieść pod komórki medium do separacji limfocytów (LSM), aż całkowita objętość wyniesie blisko 14 mL.
  3. Należy uważać, aby nie naruszyć warstw. Odwirować przy 200 rpm przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu nie używać hamulca w celu spowolnienia rotora.
  4. Przenieść CTL do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 mL. Dodać HBSS do objętości około 10 mL w celu przemycia.
  5. Policzyć komórki. Odwirować przy 130 rpm przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Resuspender w HBSS do wymaganej gęstości komórkowej dla iniekcji, utrzymując całkowitą objętość jednej iniekcji na poziomie 10 μL.
  6. Wykorzystać tę samą technikę iniekcji ogonowej, zaprezentowaną wcześniej w tym filmie, aby wstrzyknąć CTL myszom z guzami nowotworowymi.
  7. Umieścić mysz z powrotem w klatce i pozwolić CTL na interakcję z guzem. Myszy są zazwyczaj uśmiercane w celu analizy 14–21 dni po leczeniu CTL.

3. Wizualizacja przerzutów do płuc

  1. Aby zwizualizować przerzuty do płuc, ułożyć uśpioną mysz na plecach na styropianowej płytce. Przybić kończyny, aby zapewnić swobodny dostęp do tchawicy. Spryskać stronę brzuszną 70% etanolem.
  2. Zaczynając od środka brzucha, przeciąć nożyczkami wzdłuż linii środkowej, przez klatkę piersiową, w górę w stronę ślinianek. Odsłonić tchawicę. Za pomocą pęsety usunąć tkanki otaczające tchawicę.
  3. Przesunąć końcówkę pipety 20 μL pod tchawicę. Trzymając końcówkę jedną ręką, delikatnie unieść tchawicę do góry i odsunąć od ciała.
  4. Obrócić platformę o 180°. Za pomocą strzykawki 50 mL wstrzyknąć tusz indyjski do płuc przez tchawicę. Całkowicie nadmuchać płuca tuszem, aż do momentu wyczucia silnego oporu.
  5. Przeciąć tchawicę nożyczkami. Wsunąć pęsetę pod płuca i wyjąć je z organizmu myszy. Krótko opłukać płuca w zlewce o pojemności 1L z wodą.
  6. W dygestorium przenieść płuca do szklanej fiolki scyntylacyjnej zawierającej 5 mL roztworu Fekete. Po kilku minutach tkanka nowotworowa pojawi się w postaci białych guzków na czarnych płucach. Guzy można teraz policzyć i przechowywać w roztworze Fekete w nieskończoność.

4. Reprezentatywne przerzuty w obrazowanych płucach

  1. Tutaj płuca myszy, którym wstrzyknięto linię komórkową raka piersi 4T1, wykazują białe plamki wskazujące na obecność guzów. Myszy, którym wstrzyknięto komórki 4T1 przetransfekowane dominującym negatywnym mutantem K79E białka IRF8, wykazują zwiększony potencjał przerzutowy komórek nowotworowych.
  2. Obrazy te przedstawiają analizę histologiczną skuteczności immunoterapii z zastosowaniem adoptywnego transferu CTL. U myszy z nowotworem, którym wstrzyknięto sól fizjologiczną, 6 dni później stwierdzono obecność licznych guzów, zaznaczonych żółtymi strzałkami (A). Z kolei u myszy, którym wstrzyknięto swoiste dla guza limfocyty T, zaobserwowano redukcję liczby guzów (B).
  3. W tym samym eksperymencie zastosowanie tuszu kreślarskiego (India ink) stanowi prostszy sposób pomiaru skuteczności adoptywnego transferu CTL. Tutaj białe guzki nowotworowe na płucach z nowotworem wyraźnie odróżniają je od płuc, które przeszły pomyślnie adoptywny transfer CTL, a liczenie guzków pozwala na stopień ilościowania nieosiągalny w badaniu histologicznym.

5. Reprezentatywne wyniki

Schemat modelu mysiego przerzutów nowotworowych; transplantacja komórek nowotworowych, transfer CTL, analiza przerzutów do płuc.
Rysunek 1. Schemat doświadczalny dla modelu mysiego do badania przerzutów nowotworowych oraz immunoterapii z adaptacyjnym transferem limfocytów CTL. Czerwone kropki oznaczają komórki nowotworowe, a zielone kropki oznaczają limfocyty CTL.

Porównanie wzrostu guza w płucach myszy; wyniki eksperymentalne; badania nad rakiem; linie komórkowe 4T1.
Rysunek 2. Zaburzenie funkcji IRF8 zwiększyło potencjał przerzutowy komórek nowotworowych. Linia komórkowa raka piersi myszy 4T1 została stabilnie przetransfekowana wektorem (4T1.Vector) lub wektorem wykazującym ekspresję dominującego negatywnego mutanta IRF8 K79E (4T1.IRF8K79E) (15, 16). Komórki nowotworowe wstrzyknięto dożylnie (i.v.) do bocznych żył ogonowych myszy. Płuca z guzami wypełniono tuszem indyjskim w celu wizualizacji guzków nowotworowych. Guzki nowotworowe są łatwo widoczne jako białe punkty na czarnym tle tkanki płucnej.

Porównanie histologiczne, tkanka płucna, obraz mikroskopowy, analiza struktury komórkowej, barwienie H&E.
Rycina 3. Analiza histologiczna skuteczności immunoterapii z zastosowaniem adopcyjnego transferu limfocytów CTL. Mysią linię komórkową mięsaka CMS4-Met wstrzyknięto dożylnie do bocznych żył ogonowych myszy. Trzy dni później myszom z nowotworem wstrzyknięto sól fizjologiczną (A) lub specyficzne dla nowotworu limfocyty T (B). Płuca przeanalizowano sześć dni po leczeniu CTL za pomocą konwencjonalnego H&E&E barwienie histologiczne. Guzki nowotworowe wskazano strzałkami.

Porównanie wzrostu guza w grupie kontrolnej i grupie CTL, wyniki eksperymentu, analiza zmiany wielkości guza.
Rycina 4. Wizualizacja guzków nowotworowych za pomocą inflacji tuszem indyjskim. Mysia linia komórkowa mięsaków CMS4-Met została wstrzyknięta dożylnie do bocznych żył ogonowych myszy. Trzy dni później myszy z nowotworem otrzymały wstrzyknięcie soli fizjologicznej (kontrola) lub specyficznych dla nowotworu limfocytów T (+CTL). Płuca poddano analizie czternaście dni po zastosowaniu CTL. Białe plamki, będące guzkami nowotworowymi, umożliwiają łatwą kwantyfikację skuteczności leczenia CTL.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Myszy zakupiono z Narodowego Instytutu Raka (National Cancer Institute, Friderick, MD) i przetrzymywano w obiekcie dla zwierząt Medical College of Georgia. Eksperymenty oraz opieka i dobrostan zwierząt były zgodne z przepisami federalnymi oraz protokołem zatwierdzonym przez komisję IACUC Medical College of Georgia.

Podziękowania

Wsparcie finansowe zapewniły granty z National Institutes of Health (CA133085 dla K.L.) oraz American Cancer Society (RSG-09-209-01-TBG dla K.L.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze

Roztwory:

Roztwór tuszu indyjskiego (17):

  1. Wlać 150 ml wody destylowanej do kolby o pojemności 250 ml.
  2. Dodać 4 krople wodorotlenku amonu do wody destylowanej.
  3. Dodać 30 ml roztworu zapasowego tuszu indyjskiego (np. Sanford Black Magic Waterproof Drawing Ink 4465 Item 44011) do mieszaniny amoniaku i wody.
  4. Dopełnić wodą destylowaną do objętości 200 ml. Roztwór jest gotowy do wstrzyknięcia.

Roztwór Fekete'a (17):

Roztwór Fekete'a służy do odbarwiania płuc z guzem, w których zastosowano nadmuchanie tuszem indyjskim, aby odróżnić białe guzki nowotworowe od czarnego tła tkanek prawidłowych.

  1. Dodać 350 ml 95% EtOH do szklanej butelki o pojemności 1L.
  2. Dodać 150 ml wody destylowanej
  3. Dodać 50 ml formaldehydu
  4. Dodać 25 ml kwasu octowego lodowatego

Bibliografia

  1. Ryan, M. H., Bristol, J. A., McDuffie, E., Abrams, S. I. Regression of extensive pulmonary metastases in mice by adoptive transfer of antigen-specific CD8(+) CTL reactive against tumor cells expressing a naturally occurring rejection epitope. J Immunol. 167 (8), 4286-4292 (2001).
  2. Caldwell, S. A., Ryan, M. H., McDuffie, E., Abrams, S. I. The Fas/Fas ligand pathway is important for optimal tumor regression in a mouse model of CTL adoptive immunotherapy of experimental CMS4 lung metastases. J Immunol. 171 (5), 2402-2412 (2003).
  3. Liu, K., Caldwell, S. A., Greeneltch, K. M., Yang, D., Abrams, S. I. CTL Adoptive Immunotherapy Concurrently Mediates Tumor Regression and Tumor Escape. J Immunol. 176 (6), 3374-3382 (2006).
  4. Yang, D., Stewart, T. J., Smith, K. K., Georgi, D., Abrams, S. I., Liu, K. Downregulation of IFN-gammaR in association with loss of Fas function is linked to tumor progression. International journal of cancer. 122 (2), 350-362 (2008).
  5. Pages, F., Berger, A., Camus, M. Effector memory T cells, early metastasis, and survival in colorectal cancer. N Engl J Med. 353 (25), 2654-2666 (2005).
  6. Galon, J., Costes, A., Sanchez-Cabo, F. Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome. Science. 313 (5795), 1960-194 (2006).
  7. Strater, J., Hinz, U., Hasel, C. Impaired CD95 expression predisposes for recurrence in curatively resected colon carcinoma: clinical evidence for immunoselection and CD95L mediated control of minimal residual disease. Gut. 54 (5), 661-665 (2005).
  8. Camus, M., Tosolini, M., Mlecnik, B. Coordination of intratumoral immune reaction and human colorectal cancer recurrence. Cancer research. 69 (6), 2685-2693 (2009).
  9. Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Yang, J. C. Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma. J Clin Oncol. 23 (10), 2346-2357 (2005).
  10. Srivastava, M. K., Sinha, P., Clements, V. K., Rodriguez, P., Ostrand-Rosenberg, S. Myeloid-derived suppressor cells inhibit T-cell activation by depleting cystine and cysteine. Cancer research. 70 (1), 68-77 (2010).
  11. Nagaraj, S., Gabrilovich, D. I. Tumor escape mechanism governed by myeloid-derived suppressor cells. Cancer research. 68 (8), 2561-2563 (2008).
  12. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature reviews. 9 (4), 274-284 (2009).
  13. Heijstek, M. W., Kranenburg, O., Rinkes, B. orel, H, I. Mouse models of colorectal cancer and liver metastases. Digestive surgery. 22 (1-2), 1-2 (2005).
  14. Yang, D., Ud Din, N., Browning, D. D., Abrams, S. I., Liu, K. Targeting lymphotoxin beta receptor with tumor-specific T lymphocytes for tumor regression. Clin Cancer Res. 13 (17), 5202-5210 (2007).
  15. Yang, D., Thangaraju, M., Browning, D. D. IFN Regulatory Factor 8 Mediates Apoptosis in Nonhemopoietic Tumor Cells via Regulation of Fas Expression. J Immunol. 179 (7), 4775-4782 (2007).
  16. Yang, D., Thangaraju, M., Greeneltch, K. Repression of IFN regulatory factor 8 by DNA methylation is a molecular determinant of apoptotic resistance and metastatic phenotype in metastatic tumor cells. Cancer research. 67 (7), 3301-3309 (2007).
  17. Wexler, H. Accurate identification of experimental pulmonary metastases. Journal of the National Cancer Institute. 36 (4), 641-645 (1966).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wstrzykiwanie kom rek nowotworowychprzerzuty do p ucwizualizacja przy u yciu tuszu indyjskiegowstrzykni cie do y y ogonowejcytotoksyczne limfocyty Tilo ciowe oznaczanie guzk w nowotworowychocena skuteczno ci przerzutowania
Model mysi eksperymentalnej przerzutowości oraz immunoterapii z adoptywnym transferem limfocytów CTL
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.