DIOLISTYCzne znakowanie neuronów w skrawkach mózgu gryzoni i naczelnych niebędących ludźmi

Podsumowanie

Prezentujemy zastosowanie pistoletu genowego do wprowadzania barwników fluorescencyjnych, takich jak DiI, do neuronów wyrytych z plastrów mózgu gryzoni oraz naczelnych innych niż człowiek w różnym wieku. W tym konkretnym przypadku wykorzystujemy dorosłe myszy (w wieku 3–6 miesięcy) oraz dorosłe makaki krabikowate (w wieku 9–15 lat). Technika ta, pierwotnie opisana przez laboratorium dr. Lichtmana (Gan et al., 2000), jest odpowiednia do badania rozgałęzień dendrytycznych oraz morfologii kolców dendrytycznych i może być łączona z tradycyjnym barwieniem immunologicznym, pod warunkiem zachowania niskiego stężenia detergentów.

Streszczenie

Barwienie metodą DiOLISTIC wykorzystuje pistolet genowy do wprowadzania barwników fluorescencyjnych, takich jak DiI, do neuronów w skrawkach mózgu (Gan et al., 2009; O'Brien i Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Przedstawiamy tutaj szczegółowy opis każdego wymaganego kroku wraz z przykładowymi obrazami prawidłowych i nieprawidłowych wyników, które pomogą w optymalizacji techniki. W naszym doświadczeniu kilka etapów okazało się krytycznych dla skutecznego zastosowania metody DiOLISTICS. Uwagi te obejmują jakość mikrokulek powlekanych DiI, czas ekspozycji na utrwalacz oraz stężenie detergentu zastosowanego w roztworach inkubacyjnych. Przedstawiono również wskazówki i rozwiązania powszechnie występujących problemów.

Jest to wszechstronna technika znakowania, którą można zastosować u wielu gatunków zwierząt w szerokim zakresie wieku. W przeciwieństwie do innych technik znakowania fluorescencyjnego, które są ograniczone do preparatów z młodych zwierząt lub ograniczone do myszy z powodu zależności od ekspresji fluorescencyjnego transgenu, znakowanie DiOLISTIC może być stosowane u zwierząt w każdym wieku, gatunku i genotypie, a dodatkowo może być używane w połączeniu z immunostainingiem w celu identyfikacji konkretnej subpopulacji komórek. Przedstawiamy tutaj zastosowanie metody DiOLISTICS do znakowania neuronów w skrawkach mózgu dorosłych myszy oraz dorosłych naczelnych niebędących ludźmi w celu ilościowego określenia rozgałęzień dendrytów oraz morfologii kolców dendrytycznych.

Protokół

1. Przygotowanie pocisków DiI/wolframowych kulek: Pociski DiI (1-1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate) należy przygotować z wyprzedzeniem przed przystąpieniem do cięcia plasterków mózgu. Procedura trwa około 2–4 godziny, w zależności od liczby jednoczesnie przygotowywanych pocisków.

1. Jeśli rozpoczyna się od nowej partii kulek wolframowych, przygotuj porcje po 300 mg każda. Porcje przygotowuje się, zawieszając 6 gramów wolframu w 2 ml chloru metylenu. Następnie pobierz pipetą 100 μl roztworu kul do probówek mikrocentryfugowych w celu uzyskania alikwot 300 mg kulek wolframowych. Przechowuj alikwoty w temperaturze pokojowej. (Uwaga: chlorometan odparowuje bardzo szybko. Alkohol można również użyć, aby zminimalizować parowanie).
2. Po rozpoczęciu od alikwot kulek zawiesić każdą alikwotę (300 mg kulek wolframowych) w 300 μl chlorek metylenu i szybko przykryć, aby zapobiec parowaniu. Ta ilość wystarcza na 3 serie kul.
3. Przygotuj roztwór barwnika, odważając 13,5 mg barwnika lipofilnego DiI i dodając 450 μl chlorek metylenu (końcowe stężenie = 3 mg/)100μl).
4. Ponakładaj kropelki barwnika na kulki. Umieść szkiełko mikroskopowe na kawałku papieru wagowego pokrytego parafiną i pipetuj 100 μl nakładek na szkiełko. Dodaj 100 μl roztworu DiI, dokładnie wymieszaj za pomocą końcówki pipety i wysusz na powietrzu, aż kulki stanie się jasnoszare.
5. Użyj ostrza brzytwy, aby zeskrobać kulki ze szkiełka mikroskopowego i rozdrobić je na drobny proszek. (Uwaga: użyj nowego noża, jeśli stosujesz więcej niż jeden kolor kulek, aby nie dopuścić do zanieczyszczenia barwników).
6. Zbierz kulki na papier wagowy i przesyp je przez lejek do rurki stożkowej o pojemności 15 ml. Dodaj 3 ml wody i sonikuj w łaźni wodnej przez 10–30 minut w temperaturze pokojowej. (Uwaga: rozdrobnienie proszku oraz sonikacja są stosowane w celu minimalizacji powstawania agregatów pokrytych kulek, które mogłyby zakłócić rzadkie znakowanie pojedynczych neuronów.

2. Przygotowanie roztworu poliwinylopirydynu (PVP) i wężyka: Aby poprawić przyleganie kulek do rurki pociskowej (rurki TEZFEL), należy pokryć ją poliwinylopirydynoną (roztwór PVP

1. Przygotuj 10 ml roztworu PVP w wodzie o stężeniu 10 mg PVP/ml.
2. Użyj strzykawki 12 ml z adapterem do rurki (elastyczna rurka o nieco większym średnicy), aby przepuścić roztwór PVP przez rurkę pociskową, a następnie wypuścić go z drugiego końca. W przypadku jednoczesnego przygotowywania kilku porcji, roztwór można ponownie wykorzystać do pokrywania kolejnych odcinków rurki pociskowej. Po użyciu roztwór PVP należy odrzucić.
3. Aby dodać kulki do rurki pociskowej, wymieszaj kulki w wirowarce, aby uzyskać jednorodny roztwór, a następnie użyj strzykawki, aby przeprowadzić roztwór z kulkami przez rurkę, tak aby kulki były równomiernie rozłożone w całej długości rurki. ((Uwaga:) staraj się zminimalizować liczbę pęcherzyków powietrza w rurce).
4. Przeprowadź rurkę przez stację przygotowawczą i pozostaw ją, aby kulki opadły. Użyj strzykawki, aby delikatnie usunąć wodę, pozostawiając jedynie kulki.
5. Obracaj rurkę w stacji przygotowawczej i susz gazem azotowym, aż do momentu, gdy krople wody przestaną być widoczne. Etap ten zajmie około 10–20 minut.
6. Przytnij rurki nożycami do rurek na odcinki długości 13 mm i umieść je w fiolkach scyntylacyjnych zawierających Drierite lub inny rodzaj bezwodnego siarczanu wapnia. Owiń fiolki folią, aby ochronić je przed światłem.

3. Barwienie DiI: Tę technikę znakowania można wykorzystać do barwienia neuronów w tkance mózgowej pochodzącej od różnych gatunków; w tym konkretnym przypadku od myszy (w wieku 3–6 miesięcy) i naczłoniów naczłowiekowatych (w wieku 9–15 lat).

Preferowane jest przygotowanie przekrojów z ustalonego tkanki mózgowej uzyskanej poprzez przetokowe przepłukanie roztworem utrwalającym, ponieważ w tych warunkach oczekuje się najlepszego zachowania struktury tkanki. Jednakże utrwalanie przez przepłukanie nie zawsze jest możliwe (tak jak w przypadku tkanki małpy) i znakowanie DiOLISTIC może być nadal skutecznie stosowane przy zastosowaniu innych metod przygotowania tkanki. Poniżej opisujemy trzy różne procedury przygotowania tkanki:

1. Utrwal mózg przez przetaczanie przez serce → wyjmij mózg → dodatkowe utrwalenie przez 10 min → przekrój na plastry → wybarwienie
2. Wyjmij mózg → przekrój na blok tkankowy → utrwal blok → przepłucz w buforze PBS → przekrój na plastry → wybarwienie
3. Wyjmij mózg → przekrój na plastry → utrwalenie → przemywanie → wybarwienie

W niniejszym badaniu mózgi małp uzyskano od osobników, którym przed pobraniem mózgu przeprowadzono przetłokowe przepłukanie lodowatym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (ACSF), a następnie wycięto blok tkanki (o grubości 4 mm) zawierający jądro ogonate i prążek boczny, który utrwalono przez 60 minut w temperaturze pokojowej. We wszystkich procedurach roztwór utrwalający zawiera 4% paraformaldehydu i 4% sacharozy w buforze PBS (przygotowany tuż przed użyciem lub używany w ciągu 15 dni). Należy podkreślić, że czas utrwalania ma kluczowe znaczenie dla skutecznego barwienia. Przedłużone utrwalanie może wpływać na barwienie, niszcząc integralność błony plazmatycznej i powodując wyciek barwnika poza komórkę (więcej informacji w sekcji wyników).

1. Dla procedury a i b przekroje (200 μm) są cięte z utrwalonego mózgu lub bloku tkankowego, a następnie umieszczane w 24-dołkowej płytce z buforem PBS. Dla procedury c świeże, ostre przekroje mózgowe (200 μm) są cięte wibratomem w zimnym roztworze cięcia zawierającym (w mM): 110 Choline-Cl, 25 NaHCO₃, 1.25 NaH₂PO₄, 2.5 KCl, 0.5 CaCl₂, 7 MgCl₂, 25 glukozę, 11.6 kwasu askorbinowego, 3.1 kwasu pirogronowego (osmolarność = 310 mOsmoli) i natychmiast po cięciu przekroje są umieszczane w 24-dołkowych płytach i utrwalane przez 30 minut roztworem utrwalającym w temperaturze pokojowej.
2. Przemyj przekroje buforem PBS trzykrotnie.
3. Przed strzelaniem do przekrojów usuń bufor PBS z dołków i za pomocą pędzelka umieść przekrój w centrum dołka.
4. Strzelaj pociskami DiI przez filtr o wielkości porów 3,0 μm, używając systemu Helios Gene Gun pod ciśnieniem helu 120–180 psi, trzymając pistolet w odległości 1,5 cm między próbką a końcem lufy.
   (Ważna uwaga: Tą metodą zostaną oznaczone tylko neurony znajdujące się w odległości do 50 mm od powierzchni przekroju, dlatego ważne jest, aby podczas przemywania i montowania zachować tę samą stronę przekroju skierowaną do góry. W ten sposób zapewnisz, że oznaczone neurony będą znajdować się w zakresie ostrości podczas obrazowania mikroskopem konfokalnym).
5. Przemyj przekroje buforem PBS trzykrotnie i przechowuj je w buforze PBS przez kilka godzin, aby umożliwić rozprzestrzenienie się DiI wzdłuż dendrytów.
6. Umieść przekroje na szkiełku mikroskopowym za pomocą ProLong Gold Antifade i przykryj pokrywką o wymiarach 18×18 mm, typ 1. (Uwaga: dla procedury c najlepiej jest montować przekroje w tym samym dniu, ponieważ ich integralność nie jest dobrze zachowywana przez noc).
7. Zabezpiecz preparat przezroczystym lakierem do paznokci po wyschnięciu środka montażowego.
8. Alternatywnie przekroje mogą zostać wybarwione przeciwciałami przed montowaniem, zgodnie z opisem poniżej.
   (Uwaga: szkiełka mogą być używane przez co najmniej 6 miesięcy do roku, jeśli są przechowywane w ciemności w temperaturze 4°C. DiI jest wrażliwy na światło, a długotrwałe narażenie na światło spowoduje wyblaknięcie barwnika).

4. Barwienie przeciwciałami: Barwienie immunohistologiczne należy wykonać po kroku 3.4 i przed montowaniem.

1. Permeabilizacja: Hoduj przekroje w 0.01% 1% Triton X-100 w roztworze PBS przez 15 min w temperaturze pokojowej (300–500 μl na dołek
   UWAGA: Nie należy stosować wyższych stężeń detergentu, ponieważ może to spowodować rozpuszczenie DiI i znaczące osłabienie fluorescencyjnego barwienia. Należy minimalizować czas przebywania w detergentcie, ponieważ długotrwałe inkubacje również osłabiają znakowanie DiI. Jeśli konieczne są długie inkubacje, przekroje należy przechowywać w buforze PBS, a nie w roztworze blokującym.
2. Blokowanie: Iryguj przekroje w roztworze blokującym zawierającym 10% surowicy koziej, 0,01% Triton X-100 w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
3. Pierwotne przeciwciało: Dodaj przeciwciało w pożądanej rozcieńczeniu w roztworze blokującym (np. przeciwciało królicze anty-GFP w rozcieńczeniu 1:1000). Dodaj 300–500 μl na dołek i inkubuj przez 1–2 godz. (Uwaga: jeśli konieczne są inkubacje w ciągu nocy, usuń detergent z roztworu blokującego).
4. Odmień plastry roztworem PBS przez 5–15 minut, trzykrotnie.
5. Drugie przeciwciało: Incynuj z przeciwciałem wtórnym przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przygotuj roztwór przeciwciała wtórnego w odpowiednim rozcieńczeniu w roztworze blokującym (np. przeciwciało skoniugowane z Alexa-Fluor 488 w rozcieńczeniu 1:1000).
6. Oprzemy plastry buforanem fosforanowym (PBS) przez 5–15 minut, 4 razy.
7. Umieść przekroje na szkiełkach mikroskopowych za pomocą odczynnika ProLong Gold Antifade i przykryj szkiełkiem nakrywkowym 18x18 mm typu No.1. Po wyschnięciu odczynnika uszczelnij preparat lakierem do paznokci.

5. Reprezentatywne wyniki:

1. Sprawdzanie poprawności znakowania: Przekrój można wizualizować pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym wyposażonym w lampę rtęciową i czerwony filtr fluorescencyjny, aby potwierdzić skuteczne znakowanie metodą DiOLISTIC. Rycina 1 przedstawia przykładowe obrazy dobrze oznakowanych przekrojów mózgu uzyskanych w małym powiększeniu. Należy zwrócić uwagę na dwa istotne cechy: rzadki wzór znakowania (ryc. 1A) oraz możliwość identyfikacji poszczególnych składników komórkowych (ryc. 1B–C).
2. Rozwiązywanie problemów z znakowaniem DiOLISTIC: Rycina 2 przedstawia przykłady przekrojów, w których znakowanie DiOLISTIC nie powiodło się. Z naszego doświadczenia wynika, że istnieją trzy główne przyczyny niskiej efektywności znakowania:
   • Znakowanie zbyt rzadkie lub zbyt gęste: W jednym przypadku na każdym przekroju znakowana jest bardzo mała liczba komórek, w drugim – zbyt duża, co uniemożliwia izolację i badanie pojedynczych elementów komórkowych. Rozwiązanie: dostosuj stężenie pokrytych kulek w końcowym roztworze używanym do pokrywania rurki pociskowej TEFZEL (sekcja 1.6). Zmniejsz lub zwiększ objętość wody (początkowo 3 ml) użytej do rozpuszczenia kulek, aby skorygować odpowiednio zbyt rzadkie lub zbyt gęste znakowanie. Dodatkowo, niska skuteczność znakowania może wynikać z nieoptymalnego ciśnienia gazu podczas strzelania pokrytymi kulkami do przekrojów. Możliwość tę można wykluczyć, upewniając się, że rurka pociskowa TEFZEL uwolniła większość pokrytych kulek i po strzale staje się przezroczysta. W przeciwnym razie należy zwiększyć ciśnienie gazu podczas strzelania.
   • Złe pociski: podczas przygotowywania pocisków powstają duże skupiska lub agregaty wolframowych kulek pokrytych barwnikiem. Przekroje będą przypominać przykłady pokazane na rycinie 2A–B. Rozwiązanie: przygotuj nowe pociski, zwracając szczególną uwagę na sekcję 1.5 i/lub wydłuż czas sonikacji opisany w sekcji 1.6.
   • Przedłużona fiksacja: tkanka była utrwalana w roztworze paraformaldehydu dłużej niż optymalny czas wymagany do fiksacji (30 minut dla przekrojów 200–300 μm, 1 godzina dla przekrojów 4 mm). To narusza integralność błony komórkowej i prowadzi do otrzymania oznakowanych przekrojów przypominających te pokazane na rycinie 2C–D, w których znakowanie wydaje się rozmyte z powodu rozpraszania barwnika poza komórki. Rozwiązanie: skróć czas fiksacji.
3. Obrazowanie konfokalne: serie obrazów są pozyskiwane za pomocą mikroskopu konfokalnego (Zeiss LSM 510 META) z użyciem obiektywu 20x do obrazowania całej komórki oraz obiektywu 63x z zanurzeniem wodnym do segmentów dendrytów. DiI wzbudzano za pomocą lasera DPS o długości fali 561 nm, a zieloną fluorescencję pochodzącą od przeciwciała wtórnego wzbudzano za pomocą lasera o długości fali 488 nm. Przecinanie optyczne oznakowanego materiału uzyskane dzięki mikroskopii konfokalnej pozwala dodatkowo na izolację pojedynczych oznakowanych komórek w próbce. Rycina 3A przedstawia średnią komórkę olinowaną z jądra prążkowatego mózgu myszy oraz jej złożony wzór rozgałęzienia dendrytów. Obrazy w wysokim powiększeniu dendrytów tych neuronów z gryzonia (ryc. 3B) i naczłowieka (ryc. 3C) pokazują stopień barwienia dendrytów i kolców dendrytycznych uzyskany tą metodą u obu gatunków. Dendryty i ich wypustki (kolce) są dobrze wyraźne, nawet w przypadku długich, cienkich głów kolec, które są bardzo liczne u średnich neuronów olinowanych.
   
   W połączeniu metody DiOLISTIC z immunohistochemią obrazowanie konfokalne jest również pomocne w jednoznacznym zlokalizowaniu barwienia w tej samej płaszczyźnie ostrości i w tej samej komórce. Rycina 4 przedstawia przykład kolokalizacji znakowania DiI i immunohistochemii dla GFP w pojedynczej komórce. Obraz przedstawia jedną serię (0,7 μm przekrój z) uzyskaną z przekroju jądra prążkowatego od transgenicznej myszy ekspresyjnej białka fluorescencyjnego GFP pod kontrolą promotoru receptora dopaminy D1.

Rycina 1. Oznakowanie DiI neuronów w przekrojach mózgu naczłoniów nieludzkich. (A) Obraz w niskim powiększeniu przekroju mózgu barwionego z jądrem ogonatym od małpy cynomolgusa, pokazujący rzadkie oznakowanie neuronów za pomocą DiI. (B–C) Osobne grube komórki odrzutowe można łatwo zidentyfikować za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu szerszyjnego.

Rycina 2. Rozwiązywanie problemów związanych z oznakowaniem DiOLISTIC. (A-B) Obarwione przekroje z prążkowia grzbietowego małpy (A) i myszy (B), pokazujące duże skupiska kulek pokrytych barwnikiem, wskutek czego nie można rozróżnić pojedynczych elementów komórkowych. (C-D) Obrazy ilustrujące wynik zastosowania oznakowania DiOLISTIC do przekrojów, które były przechowywane w roztworze utrwalającym przez dłuższy czas lub w których nie powiodła się konserwacja tkanki u małpy (C) i myszy (D).

Rycina 3. Obraz konfokalny śródmózgowego neuronu o cienkich wyrostkach barwionego DiI. (A), Zestaw obrazów całego komórki umożliwia analizę morfologiczną gałęzi dendrytycznych. (B–C) Odcinki dendrytów neuronów o cienkich wyrostkach z myszy (B) i małpy (C) wykazują wyraźne znakowanie dendrytów i kolców.

Rycina 4. Łączenie znakowania DiOLISTIC z immunohistochemią. (A) oznaczony DiI neuron o średnich kolcach z ciała prążkowanego transgenicznej myszy BAC z ekspresją GFP pod kontrolą promotora receptora dopaminy D1 (B) Immunoobarwienie z użyciem przeciwciała anty-GFP, zgodnie z metodą opisaną przez Lee et al. (2006). To samo pole obrazu co na A. (C) Obraz złożony czerwonego i zielonego fluorescencji identyfikuje neuron znakowany DiI jako neuron pozytywny pod kątem GFP.

Dyskusja

Znakowanie metodą DiOLISTIC jest jedną z najbardziej wszechstronnych technik dostępnych do fluorescencyjnego znakowania komórek, ponieważ można ją zastosować do przekrojów tkanek z różnych gatunków, w szerokim zakresie wieku oraz do tkanek pobranych na świeżo lub od zwierząt perfundowanych utrwalaczem (patrz również Gan et al., 2009). Proces ten jest stosunkowo szybki, gdyż trwa od 1 do 2 dni i może być łączony z innymi, bardziej klasycznymi podejściami do znakowania, takimi jak immunostaining (Lee et al., 2006). Należy zwrócić szczególną uwagę, aby uniknąć nadmiernego utrwalania oraz stosowania wysokich stężeń detergentów w roztworach inkubacyjnych, ponieważ mogą one naruszyć integralność lipofilnej błony i spowodować wyciek barwnika z komórek. Penetrację przeciwciał można ułatwić poprzez zastosowanie niskich stężeń Triton X-100 (Lee et al., 2006), a także digitoniny lub saponiny w roztworze inkubacyjnym (Matsubayashi et al., 2008). Niektóre modyfikacje, które można zastosować w tej technice, obejmują użycie mikrocząsteczek z wieloma barwnikami, jak opisali Gan et al. (2000), lub zmianę czasu i rodzaju ekspozycji na przeciwciała (Neely et al., 2009).

Tradycyjnie DiI był wykorzystywany do śledzenia projekcji neuronalnych w mózgu. Markowanie metodą DiOLISTIC rozszerza jego zastosowanie, opisując metodę przydatną do badania morfologii komórek. Morfologia neuronów budzi duże zainteresowanie ze względu na ogromną różnorodność występującą w mózgu oraz przypuszczenia, że kształt komórek może odzwierciedlać wielofunkcyjność populacji neuronalnych w układzie nerwowym. Przykładem tego jest fakt, że wiele neuronów w układzie nerwowym ssaków wykazuje małe wypustki zwane kolcami dendrytycznymi, które są miejscem synaps glutaminergicznych. W ten sposób gęstość synaps glutaminergicznych w komórce może być skorelowana z gęstością kolców dendrytycznych, którą można zmierzyć za pomocą opisanej tutaj techniki markowania. Ponadto można ilościowo określić i zbadać inne parametry morfologiczne, takie jak całkowita długość dendrytu, wzór rozgałęzień oraz kształt i gęstość kolców dendrytycznych.

Zastosowanie znakowania fluorescencyjnego w badaniu morfologii neuronów ma wiele zalet w porównaniu do bardziej tradycyjnych technik opartych na mikroskopii światła przechodzącego (np. barwienie metodą Golgiego), ponieważ umożliwia ono obrazowanie konfokalne o wyższej rozdzielczości. Inną zaletą wykorzystania DiI jako fluoroforu w eksperymentach mających na celu pomiar gęstości i morfologii kolców dendrytycznych są jego właściwości lipofilne. DiI wbudowuje się w błonę plazmatyczną, zapewniając wyraźny zarys wypustek neuronowych i wypustek dendrytycznych. Biorąc pod uwagę niewielką objętość większości kolców dendrytycznych (mniej niż 1 femtolitr), barwienie błony jest bardziej wydajne i pozwala na lepszą wizualizację małych, cienkich wypustek niż barwienie cytoplazmatyczne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1-1’-dioctadecylo-3,3,3’,3’-tetrametylo-indokarbocyjaninę nadnadchlorek (DiI)	Invitrogen	D-282
Chlorek metylenu	Mallinckrodt Baker Inc.	H485-06
Kuleczki wolframowe	Bio-Rad	165-2269	średnica 1,7 μm
Poliwinilopirolidon	Calbiochem	529504
Przewód Tefzel bullet tubing	Bio-Rad	165-2441
Obcinarka do przewodów	Bio-Rad	165-2422
Helios Gene Gun	Bio-Rad	165-2431
Papier filtracyjny z membraną Isopore	EMD Millipore	TSTP02500	wielkość porów 3,0 μm
ProLong Gold Antifade	Invitrogen	P36930
Paraformaldehyd	Alfa Aesar	30525-89-4	(16% w/v)