Toxoplasma gondii Formowanie ściany cysty w aktywowanych makrofagach pochodzących z szpiku kostnego oraz w warunkach sprzyjających bradyzoitom

Podsumowanie

Toxoplasma gondii przekształca się w formę cysty w odpowiedzi na stres środowiskowy, co można odtworzyć w modelach kultur tkankowych. W niniejszym materiale wideo zaprezentowano techniki badania tworzenia się ściany cysty poprzez aktywację makrofagów pochodzących z szpiku kostnego lub zmianę pH pożywki wzrostowej w komórkach fibroblastów.

Streszczenie

Toxoplasma gondii to obligatoryczny pasożyt wewnątrzkomórkowy, który może infekować każdą komórkę z jądrem zwierząt ciepłokrwistych. Podczas infekcji T. gondii rozprzestrzenia się w formie szybko replikującej, zwanej tachyzoitem. Tachyzoity przekształcają się w wolno rosnącą formę otoczkowaną, zwaną bradyzoitem, w wyniku procesu sygnalizacyjnego, który nie jest jeszcze dobrze opisany. W organizmach zwierząt cysty bradyzoitów znajdują się w ośrodkowym układzie nerwowym oraz w tkance mięśniowej i reprezentują chroniczne stadium infekcji. Przekształcenie w bradyzoity można symulować w hodwli tkankowej poprzez deprywację CO₂, stosowanie pożywek o wysokim pH lub dodanie interferonu gamma (IFNγ). Bradyzoity charakteryzują się obecnością ściany cysty, do której wiąże się lektyna – aglutynina Dolichos biflorus (DBA). Fluorescencyjnie znakowana DBA jest wykorzystywana do wizualizacji ściany cysty u pasożytów hodowanych w fibroblastach napletka ludzkiego (HFFs), które poddano działaniu niskiego stężenia CO₂ oraz pożywki o wysokim pH. Podobnie pasożyty bytujące w makrofagach szpiku kostnego myszy (BMMs) wykazują obecność ściany cysty wykrywalnej za pomocą DBA po aktywacji BMMs za pomocą IFNγ i lipopolisacharydu (LPS). Niniejszy protokół zaprezentuje sposób indukcji przekształcenia T. gondii w bradyzoity z wykorzystaniem pożywki wzrostowej o wysokim pH i niskim poziomie CO₂ oraz aktywacji BMMs. Komórki gospodarza będą hodowane na szkiełkach podstawowych, zainfekowane tachyzoitami, a następnie poddane aktywacji poprzez dodanie IFNγ i LPS (BMMs) lub wystawione na działanie pożywki wzrostowej o wysokim pH (HFFs) przez trzy dni. Po zakończeniu infekcji komórki gospodarza zostaną utrwalone, permeabilizowane i poddane blokowaniu. Ściany cyst zostaną zwizualizowane przy użyciu rhodaminy DBA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Protokół

1. Przygotowanie szkiełek podstawowych pokrytych fibroblastami z ludzkiego napletka (HFF)

1. Umieść sterylną okrągłą szkiełkiem zakrywkowym na dnie dołków 24-dołkowej płytki do hodowli tkanek.
2. Aby zebrać HFF z konfluentnej kolby o powierzchni 150 cm², przepłucz kolbę dwukrotnie 1X PBS i dodaj 2,5 ml 0,025% trypsyny-EDTA. Inkubuj kolbę w temperaturze 37°C przez 5-10 minut.
3. Opukiwanie boku kolby o wnętrze dłoni może ułatwić odklejenie komórek od ścianek kolby. Po uwolnieniu komórek dodaj 150 ml pożywki HFF (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM] z 10% FBS, 2 mM L-glutaminy oraz 1% penicyliny-streptomycyny) i wykorzystaj pożywkę do przepłukania kolby i zebrania komórek.
4. Rozdystrybuj 1 ml zawiesiny komórek do każdego dołka ze szkiełkami zakrywkowymi.
5. Pozostaw komórki do osiągnięcia konfluencji w temperaturze 37°C i 5% CO₂.

2. Przygotowanie pożywki warunkowej (CM) z komórek L929 do rozwoju BMC

1. L929 to aneuploidal linia komórek włókniakomięsaka mysiego, która po długim okresie osiągnięcia konfluencji wydziela czynnik stymulujący kolonie makrofagów. Wydzielanie to sprawia, że CM z komórek L929 może być wykorzystywane do różnicowania komórek szpiku kostnego myszy w makrofagi w hodowli komórkowej¹.
2. Po osiągnięciu konfluencji przez komórki L929, należy inkubować je przez dodatkowe 7-9 dni, aż staną się sferyczne i zaczną odrywać się od ścianek kolby. Należy zebrać nadsącz i odwirować oderwane komórki przy 425 x g przez 10 minut. Otrzymany nadsącz stanowi CM.
3. Jedna kolba o powierzchni 150 cm² z komórkami L929 pozwala uzyskać 30 ml CM, co umożliwia przygotowanie 150 ml pożywki BMC. Pożywka BMC składa się z 10% FBS, 20% CM, 1% penicyliny-streptomycyny oraz 1% L-glutaminy w DMEM.

3. Izolacja szpiku kostnego i hodowla komórkowa BMC

1. Uśmierć jedną mysz C57BL/6 poprzez uduszenie CO₂ i przeprowadź sterylizację powierzchniową 70% etanolem.
2. Odsłoń otrzewną, odsuwając skórę brzucha w okolicy nogi i rozcinając ją nożyczkami. Unikaj przebicia jamy otrzewnej. Rozetnij skórę w dół w kierunku nogi, aby odsłonić kość piszczelową i kość udową. Usuń tkankę mięśniową z kości kończyn za pomocą nożyczek.
3. Aby usunąć kość udową, wykonaj jedno cięcie poniżej kolana i jedno w okolicy biodra. Umieść kości w bakteriologicznej szalce Petri zawierającej zimny 1X PBS. Na tych etapach nie należy używać szalek Petri traktowanych do hodowli tkankowych, ponieważ BMC będą trwale przylegać do powierzchni. Za pomocą skalpela zeskrob nadmiar tkanki mięśniowej. Przetnij kość tuż powyżej kolana, aby odsłonić szpik.
4. Powtórz kroki (b) i (c), aby pobrać szpik kostny z drugiej kości udowej.
5. Użyj strzykawki 10 cc wypełnionej zimnym 1X PBS i igły 25 G, aby wypłukać szpik kostny do probówki stożkowej 50 ml. Po usunięciu szpiku kość powinna być czysto biała.
6. Przepuść mieszaninę PBS/szpik przez igłę 22 G, aby rozbić agregaty szpiku kostnego.
7. Wirowuj mieszaninę przy 425 x g przez 10 minut, a następnie usuń nadsącz.
8. Resuspenduj osad w 8 ml medium do BMC. Do 8 bakteriologicznych szalek Petri dodaj po 1 ml zawiesiny komórkowej i 9 ml medium do BMC.
9. Inkubuj w 37°C, 5% CO₂.
10. W 5. dniu dodaj do każdej płytki 10 ml medium do BMC. Do 7. dnia komórki będą w pełni rozwinięte. BMC można pasażować przez 1-2 tygodnie po dojrzewaniu.
11. Aby rozdzielić BMC, usuń medium i dodaj 5 ml zimnego 1X PBS do każdej szalki Petri. Inkubuj w 4°C przez 30 minut, aż komórki zaczną odklejać się od powierzchni. Zmyj BMC z płytki za pomocą sterylnej pipety transferowej.
12. Zbierz BMC do probówki stożkowej 50 ml i zcentryfuguj przy 425 x g przez 10 minut.
13. Resuspenduj osad w 10 ml medium do BMC i policz komórki za pomocą hemocytometru. Wysiej 2x105 BMC na studzienkę w płytce 24-dołkowej z okrągłymi szkiełkami nakrywkowymi na dnie. Pozostaw BMC do przytwierdzenia na noc przed zakażeniem T. gondii. Nadmiar BMC można ponownie wysiać na szalki Petri do późniejszego użycia.

4. Zakażanie komórek T. gondii

1. Zainfekuj konfluencją fibroblastów HFF w kolbie 25 cm² za pomocą 2x10⁶ T. gondii i hoduj do momentu rozpoczęcia lizy komórek (około 2-3 dni).
2. Użyj skrobaka do komórek, aby usunąć zainfekowaną monowarstwę komórek gospodarza z kolby do hodowli tkanek, a następnie uwolnij pasożyty z komórek gospodarza, przepuszczając oderwaną monowarstwę przez igłę o rozmiarze 27G.
3. Użyj hemocytometru, aby określić liczbę pasożytów w medium.
4. Zainfekuj monowarstwy HFF na szkiełkach nakrywkowych z Protokołu 1 lub komórki BMC z Protokołu 3, używając 10⁵ pasożytów na dołek. Pozostaw pasożyty do inwazji na 3 godziny w temperaturze 37°C, przy 5% CO₂.

5. Indukowanie rozwoju bradyzoitów T. gondii poprzez stresy środowiskowe

1. Rozwój bradyzoitów w komórkach HFF przy zwiększeniu pH medium i deficycie CO₂
   1. Przygotować medium do różnicowania. Medium do różnicowania zawiera RPMI 1640 bez wodorowęglanów, 1% FBS, 1% penicyliny-streptomycyny oraz 42 mM HEPES. Dostosować pH do 8,0 i wysterylizować za pomocą filtra.
   2. Usunąć DMEM z zainfekowanych komórek HFF, wypłukać 1X PBS i dodać 1 ml medium do różnicowania.
   3. Inkubować przez 3 dni w temperaturze 37°C w powietrzu otoczenia.
2. Aktywacja komórek BMC
   1. Przygotować medium do aktywacji komórek BMC. Medium do aktywacji to medium BMC uzupełnione o 100 U/ml IFN-γ oraz 100 ng/ml LPS. Przed użyciem poddać LPS sonikacji w kąpieli wodnej przez 2 minuty w celu rozbicia agregatów.
   2. Usunąć medium BMC z dołków i zastąpić je 1 ml medium do aktywacji.
   3. Inkubować w temperaturze 37°C, 5% CO₂ przez 3 dni.

6. Detekcja immunofluorescencyjna

1. Przepłucz zainfekowane studzienki trzykrotnie roztworem 1X PBS.
2. Utrwal monowarstwę, dodając 200ul 3% formaldehydu, i pozostaw na 20 minut.
3. Usuń utrwalacz i przepłucz studzienki roztworem 1X PBS.
4. Dodaj do studzienek 200μl 0,1 M glicyny i pozostaw na 5 minut.
5. Usuń glicynę i przepłucz studzienki roztworem 1X PBS.
6. Dodaj 250 μl 3% BSA/0,2% TritonX-100 w 1X PBS, aby przeprowadzić permeabilizację i blokowanie monowarstwy przez 30 minut.
7. Usuń roztwór blokujący i przepłucz studzienki roztworem 1X PBS.
8. Dodaj 50 μl roztworu aglutyniny Dolichos biflorus znakowanej rodamyną w rozcieńczeniu 1:250 w 3% BSA/0,2% Triton X-100 w 1X PBS.
9. Przykryj płytkę i inkubuj na wytrząsarce platformowej w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
10. Przemyj szkiełka podstawowe 3 razy roztworem 0,2% Triton X-100 w 1X PBS przez 5 minut każde, używając wytrząsarki platformowej.
11. Zamontuj szkiełka podstawowe, używając medium montażowego VectaShield zawierającego 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
12. Zabarwione T. gondii można wizualizować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z filtrem odpowiednim dla rodamyny przy powiększeniu 100x.

7. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1 przedstawia reprezentatywne barwienie DBA T. gondii w aktywowanych BMM i HFF pod wpływem stresu pH. W obu przypadkach widoczne jest barwienie DBA wokół wakuol zawierających pasożyty, co wskazuje na obecność składników ściany cysty. Obraz aktywowanych BMM wykazuje barwienie DBA zgodne z powierzchnią wakuoli. Przekrój poprzeczny T. gondii w HFF poddanych stresowi pH ukazuje ścianę cysty bez zabarwienia struktur wewnętrznych.

Rycina 1. Barwienie DBA zestresowanych T. gondii. Pasożyty wewnątrzkomórkowe w warunkach stresu, w aktywowanych BMM lub w HFF poddanych stresowi pH, zabarwiono DBA sprzężonym z rodamyną (czerwony). Kontrast różnicowy (DIC) pokazuje obrys cysty, a czarny pasek skali odpowiada 2 μM.

Eksperymenty na zwierzętach

Doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami ustanowionymi przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Wisconsin.

Dyskusja

Choć mechanizm rozwoju bradyzoitów nie jest w pełni poznany, analizy genetyki molekularnej konwersji stadiów T. gondii w hodowlach tkankowych doprowadziły do odkrycia genów zaangażowanych w tworzenie cyst bradyzoitowych^2,3,4. Analizy te pozwoliły również zauważyć, że niektóre markery bradyzoitów ulegają ekspresji w innych warunkach przedłużonego stresu, w tym podczas wzrostu w aktywowanych makrofagach^5,6. Powyższe metody opisują sposób hodowli T. gondii oraz indukowania rozwoju str...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Serykowa albumina bydlęca	Sigma-Aldrich	A7906
Dulbecco’pożywka DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	GIBCO, by Life Technologies	11960-051
Płastry płodowa cielęca (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150	inaktywować termicznie
Rodamina Dolichos biflorus aglutynina	Vector Laboratories	RL-1032
Formaldehyd (16%)	Polysciences, Inc.	18814
Glicyna	Fisher Scientific	BP381-5
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1
IFNγ	PeproTech Inc	315-05	Przechowywać w alikwotach do jednorazowego użycia
L-glutamina (200 mM)	GIBCO, by Life Technologies	25030
Lipopolisacharyd (LPS)	Sigma-Aldrich	L4391-1MG	Przechowywać w alikwotach do jednorazowego użycia
Szkiełko nakrywowe do mikroskopu	Fisher Scientific	12-545-80 12CIR-1
Penicylina-streptomycyna	GIBCO, by Life Technologies	15140
pożywka RPMI 1640 w proszku (z L-glutaminą, bez wodorowęglanu)	GIBCO, by Life Technologies	31800-022
Triton-X-100	Fisher Scientific	BP151-500
Trypsyna-EDTA (0,25%)	GIBCO, by Life Technologies	25200
medium montażowe VectaShield z DAPI	Vector Laboratories	H-1200