Bakteryjny transport efektorów RNAi: transkrólestwowe RNAi

Podsumowanie

W celu opracowania terapii opartych na interferencji RNA (RNAi) opracowano nową strategię – transkrólestwową interferencję RNA (tkRNAi). Technologia ta wykorzystuje niepatogenne bakterie do produkcji i dostarczania terapeutycznego krótkiego zapinkowego RNA (shRNA) do komórek docelowych. W niniejszej pracy tkRNAi została z powodzeniem zastosowana do odwrócenia klasycznej wielolekowej oporności (MDR) komórek nowotworowych pośredniczonej przez ABCB1.

Streszczenie

Interferencja RNA (RNAi) stanowi wysoce skutecznym mechanizmem specyficznego hamowania ekspresji mRNA. Poza potencjałem jako potężne narzędzie laboratoryjne, szlak RNAi wydaje się obiecujący w zastosowaniach terapeutycznych. W opracowywaniu terapii opartych na interferencji RNA (RNAi) dostarczanie czynników pośredniczących w RNAi do komórek docelowych jest jedną z głównych przeszkód. Nową strategią pokonania tej bariery jest transkrólestwowa RNAi (tkRNAi). Technologia ta wykorzystuje niepatogenne bakterie, np. Escherichia coli, do produkcji i dostarczania terapeutycznego krótkiego zapętlonego RNA (shRNA) do komórek docelowych w celu wywołania RNAi. Wektor pierwszej generacji pośredniczący w tkRNAi, TRIP, zawiera promotor bakteriofaga T7 służący do regulacji ekspresji interesującego terapeutycznego shRNA. Ponadto TRIP posiada locus Inv z Yersinia pseudotuberculosis, który koduje inwazynę umożliwiającą naturalnym bakteriom nieinwazyjnym wniknięcie do komórek ssaków wykazujących obecność β1-integryny, oraz gen HlyA z Listeria monocytogenes, który produkuje listeriolizynę O. Enzym ten pozwala terapeutycznemu shRNA na ucieczkę z pęcherzyków wejściowych w cytoplazmie komórki docelowej. Konstrukcje TRIP wprowadza się do kompetentnego niepatogennego szczepu Escherichia coli, który koduje polimerazę RNA T7 niezbędną do syntezy shRNA sterowanej przez promotor T7. Dobrze scharakteryzowaną cząsteczką docelową związaną z nowotworami dla różnych strategii RNAi jest ABCB1 (MDR1/P-glikoproteina, MDR1/P-gp). Ten transporter ABC działa jako pompa usuwająca leki i pośredniczy w „klasycznym” fenotypie wielolekowości (MDR) komórek nowotworowych człowieka zależnej od ABCB1, który charakteryzuje się specyficznym wzorcem oporności krzyżowej. Różne komórki nowotworowe MDR wykazujące ekspresję ABCB1 leczono wektorem ekspresyjnym anty-shRNA ABCB1 przenoszonym przez E. coli. Procedura ta doprowadziła do aktywacji szlaków RNAi w komórkach nowotworowych oraz do znacznego obniżenia poziomu mRNA kodującego ABCB1, a także odpowiadającej mu pompy usuwającej leki. W konsekwencji zwiększyła się akumulacja leku w pierwotnie opornych na leki komórkach nowotworowych, a fenotyp MDR został odwrócony. Za pomocą tego modelu dane dostarczyły dowodu koncepcji (proof-of-concept), że tkRNAi nadaje się do modulacji czynników związanych z nowotworami, np. ABCB1, w ludzkich komórkach nowotworowych.

Protokół

1) Bakteryjna dostawa shRNA

1. Przed rozpoczęciem hodowli bakteryjnej należy przygotować podłoże LB oraz agar LB.
2. W celu przygotowania podłoża LB odważyć ekstrakt drożdżowy (0,5% w/v), trypton bakteryjny (1,0% w/v) oraz NaCl (0,6% w/v), a następnie rozpuścić te składniki w wodzie bidestylowanej. Przygotowane roztwory należy wysterylizować w autoklawie, po czym będą one gotowe do użycia.
3. W przypadku płytek z agarem LB, przed sterylizacją do podłoża LB należy dodać agar bakteryjny (1,5% w/v).
4. Podgrzewać agar LB w kuchence mikrofalowej do całkowitego rozpuszczenia. Pozostawić roztwór do ostygnięcia, aż butelka będzie można go bezpiecznie dotknąć bez ryzyka oparzenia. Dodać kanamycynę (100 mg/ml) w celu selekcji klonów pozytywnych w kolejnych etapach.
5. Przygotować płytki z agarem LB w komorze z laminarnym przepływem powietrza (warunki sterylne), pipetując 20 ml roztworu agaru LB do 10-cm szalek Petriego. Pozostawić płytki do ostygnięcia, aż ciecz zastygnie. Płytki są teraz gotowe do użycia i mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C.
6. Wektory ekspresyjne kodujące shRNA transformuje się do kompetentnych szczepów E. coli ceq221 metodą szoku termicznego z wykorzystaniem procedury z CaCl₂.
7. Przenosi się transformowane bakterie na płytki z agarem LB zawierającym 100 μg/ml kanamycyny, zamyka pokrywki, uszczelnia płytki parafilmem i inkubuje w pozycji odwróconej w temperaturze 37 °C przez noc.
8. Inokuluje się minikultury bakteryjne klonami pozytywnymi, pobierając urośnięte kolonie za pomocą wykałaczki. Wykałaczkę przenosi się do 7,0 ml świeżego podłoża LB zawierającego 100 mg/ml kanamycyny i inkubuje w temperaturze 37 °C przez noc na wytrząsarce przy 200 rpm.
9. Inokuluje się 100 ml świeżego podłoża LB zawierającego 100 mg/ml kanamycyny w stosunku 1:100 za pomocą nocnej minikultury w kolbie Erlenmeyera o pojemności 1 l, a następnie inkubuje w temperaturze 37 °C przez noc na wytrząsarce przy 200 rpm.
10. Wysiewa się 25 x 10⁴ (liczba wysiewanych komórek zależy od szybkości wzrostu danej linii komórkowej; konfluencja powinna wynosić ~ 70-80% 24 godziny po wysiewie) ludzkich komórek raka żołądka (EPG85-257RDB) na dołek w naczyniach 6-dołkowych i inkubuje je w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5% CO₂ nasyconej parą wodną przez noc.
11. Przed infekcją komórek nowotworowych, nocne kultury E. coli zawierające wektor tkRNAi mierzy się fotometrem w celu określenia OD₆₀₀. Roztwór bakteryjny rozcieńcza się do momentu osiągnięcia gęstości optycznej 0,5 (OD₆₀₀ = 0,5 odpowiada 1,6 x 10⁸ komórek bakteryjnych/ml).
12. Na 30 min przed koinkubacją z bakteriami wymienia się pożywkę hodowlaną komórek raka zawierającą FCS na pożywkę bez FCS.
13. Bakterie przemywa się dwukrotnie 1x PBS i rozcieńcza w bezserowym podłożu Leibovitza L-15.
14. Dodaje się rozcieńczone bakterie do komórek nowotworowych zgodnie z pożądanym MOI (multiplikacja infekcji = liczba komórek bakteryjnych na jedną komórkę nowotworową) i koinkubuje bakterie z komórkami nowotworowymi przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
15. Po 2 godzinach koinkubacji komórki nowotworowe przemywa się dwukrotnie 1x PBS oraz raz podłożem Leibovitza L-15 z dodatkiem serum, uzupełnionym o 100 u/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 2,5 μg/ml amfoterycyny, 150 μg/ml gentamycyny oraz 100 μg/ml kanamycyny.
16. Kontynuuje się hodowlę komórek nowotworowych w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5% CO₂ nasyconej parą wodną.
17. Efekty traktowania bakteryjnego można wizualizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, mierzyć ilościowo za pomocą RT-PCR w czasie rzeczywistym na poziomie mRNA oraz za pomocą analizy western blot na poziomie białek, a także wykazać w testach funkcjonalnych, takich jak analiza FACS i testy proliferacji komórek (na życzenie procedury te mogą zostać opisane szczegółowo).

2) Reprezentatywne wyniki

Jeśli protokół zostanie wykonany prawidłowo, wyniki powinny być porównywalne do tych przedstawionych poniżej.

Mikroskopia fluorescencyjna

Rycina 1 przedstawia ludzką komórkę raka żołądka trzy godziny po traktowaniu bakteriami (a) w porównaniu z komórką nietraktowaną (b). W okolicach jądra komórkowego komórki traktowanej można wykryć bakterie.

Rycina 1: Mikroskopia fluorescencyjna komórki raka żołądka człowieka po traktowaniu bakteriami (1:500) oraz nietraktowanej komórki raka żołądka człowieka jako kontroli, barwienie DAPI, filtr pasmowo-przepustowy DAPI (Λem = 640 nm), obiektyw 40x.

Ilościowa real-time RT-PCR

Na rysunku 2 widoczna jest obniżona regulacja mRNA MDR1 o około 70% (czarny słupek) po zastosowaniu bakterii terapeutycznych. Komórki macierzyste służą jako kontrola pozytywna ze względu na brak nadekspresji MDR1. Linia komórkowa 257RDB p170 zawierająca plazmid wyrażający shRNA przeciwko MDR1 została przyjęta jako bezpośrednie porównanie technologii RNAi transkrólestwowej z innymi strategiami wyciszania RNAi. Jako kontrole pozytywne przyjęto: nieleczoną oporną linię komórkową EPG85-257RDB z nadekspresją MDR1, tę samą linię komórkową leczoną bakteriami pozbawionymi plazmidu wyrażającego shRNA oraz tę linię komórkową leczoną bakteriami terapeutycznymi niosącymi plazmid wyrażający shRNA przeciwko MRP2.

Rycina 2: Ilościowa real-time RT PCR ekspresji mRNA MDR1 po leczeniu terapeutycznym E. coli ceq221 wykazującym ekspresję anty-MDR1 shRNA (MOI 1 : 500). Normalizację przeprowadzono z wykorzystaniem genu pomocniczego aldolazy. Stosunek MDR1/aldolaza dla nieleczonych komórek linii EPG85-257RDB przyjęto jako 100 %. Wartości p obliczono za pomocą testu t Studenta (* = p<0,05, ** = p<0,005, *** = p<0,001).

Analiza Western blot

Rysunek 3 pokazuje, że obniżenie poziomu MDR1 nastąpiło również na poziomie białka po zastosowaniu leczenia bakteryjnego. Przedstawiono brak ekspresji MDR1 w wrażliwej na lek linii komórkowej rodzicielskiej (EPG85-257P), ekspresję MDR1 w nieleczonej opornej na leki linii komórkowej (EPG85-257RDB) oraz ekspresję MDR1 w próbce poddanej leczeniu. Można zaobserwować wyraźne obniżenie poziomu MDR1 w komórkach traktowanych bakteriami.

Rysunek 3: Analiza Western blot. Poziomy ekspresji MDR1 w nieleczonych komórkach wrażliwych na leki EPG85-257P, nieleczonych komórkach opornych na leki EPG-257RDB oraz w komórkach EPG85-257RDB po wspólnej inkubacji z E. coli ceq221 + p43 MDR1. Przeciwciała pierwszorzędowe C219 1:100 i anty-aktyna 1:5 000, przeciwciało drugorzędowe anty-mysie 1:10 000.

Test cytotoksyczności

Analizy funkcjonalne, takie jak test cytotoksyczności przedstawiony na rysunku 4, stanowią również wskaźniki działania transkrólestwowego RNAi. Linia komórkowa macierzysta oraz linia komórkowa zawierająca plazmidt wyrażający shRNA anty-MDR1 nie wykazują żadnej oporności na daunorubicynę. Oporna linia komórkowa EPG85-257RDB oraz dwie kolejne kontrole nie wykazują istotnych zmian w oporności w porównaniu z próbką traktowaną bakteriami wyrażającymi shRNA anty-MDR1, w której oporność na daunorubicynę została zniesiona o około 90 %.

Rycina 4: Test cytotoksyczności. Wartości IC50 specyficzne dla leku określone za pomocą testu cytotoksyczności w celu oceny przeżywalności komórek. Wartości p obliczono przy użyciu testu t Studenta (* = p<0.05, ** = p<0.005, *** = p<0.001).

Analiza akumulacji antracyklin

Zgodnie z obniżoną opornością próbek poddanych działaniu bakterii (rycina 4), akumulacja antracyklin w komórkach traktowanych shRNA przeciwko MDR1 wzrosła o około 90%, co przedstawiono na rycini 5. Linia komórkowa macierzysta oraz linia komórkowa 257RDB p170 wykazują silną akumulację daunorubicyny, sięgającą 100%. W wariancie opornym akumulacja występuje rzadko. Komórki traktowane bakteriami wykazującymi ekspresję shRNA przeciwko MDR1 wykazują wzrost akumulacji antracyklin o 90%.

Rycina 5: Analiza akumulacji antracyklin. Akumulacja antracyklin w komórkach raka mierzona metodą cytometrii przepływowej 6 dni po traktowaniu bakteriami. Wartości p obliczono za pomocą testu t-Studenta (* = p<0,05, ** = p<0,005, *** = p<0,001).

Dyskusja

Liczba wysiewanych komórek do infekcji oraz odpowiadająca im wartość MOI zależą w znacznym stopniu od obserwowanych linii komórkowych oraz tempa ich wzrostu. Aby ustalić optymalną liczbę komórek do wysiewu, zdecydowanie zaleca się przeprowadzenie eksperymentów wstępnych w celu określenia tempa wzrostu. Ponadto należy przetestować różne wartości MOI ze względu na ograniczoną zdolność komórek do zniesienia inwazji bakteryjnej bez obumarcia z powodu stresu. Optymalny moment czasowy, w którym następuje downregulacja badanego...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agar	Biochrom AG	214050
Amfoterycyna B	Biochrom AG	A2612
Dulbecco buforowany roztwór soli fosforanowej-PBS (10 x)	Invitrogen GmbH	14080048
E. coli ceq221	Cequent Pharmaceuticals Inc.		Brak dostępnego numeru katalogowego, zamówienie bezpośrednie
Gentamycyna	Biochrom AG	A2710
Penicylina/Streptomycyna	Invitrogen GmbH		Zawiera 5,000 jednostek penicyliny (zasada) i 5,000 μg streptomycyny (zasada)/ml z wykorzystaniem penicyliny G (sól sodowa) i siarczanu streptomycyny w 0.85% roztworze soli fizjologicznej.
Chlorek sodu	Merck KgaA	1064060500
Trypton	Difco Laboratories	211705
Ekstrakt drożdżowy	Difco Laboratories	212750