Po ekspozycji na antygen subpopulacje aktywowanych limfocytów B przechodzą proces znany jako rekombinacja przełączająca klasę (CSR), aby wytworzyć izotypy przeciwciał o odrębnych funkcjach efektorowych. Protokół opisany w niniejszym raporcie wyjaśnia, w jaki sposób CSR można indukować i analizować in vitro w celu badania funkcji limfocytów B.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Indukcja i ocena rekombinacji przełączającej klasy w oczyszczonych komórkach B myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Odporność humoralna to gałąź układu odpornościowego podtrzymywana przez limfocyty B i pośrednicząca poprzez sekrecję przeciwciał. Po aktywacji limfocytów B locus immunoglobulin przechodzi szereg modyfikacji genetycznych, aby zmienić zdolność wiązania i funkcję efektorową wydzielanych przeciwciał. Proces ten jest podkreślony przez zdarzenie rekombinacji genomicznej znane jako rekombinacja przełączająca klasę (CSR), w której domyślny izotyp przeciwciał IgM zostaje zastąpiony przez jeden z izotypów IgG, IgA lub IgE. Każdy izotyp posiada odmienne funkcje efektorowe, co sprawia, że CSR jest kluczowy dla utrzymania odporności.
Dywersyfikacja locus immunoglobulin jest pośredniczona przez enzym cytidynodeaminazę indukowaną aktywacją (AID). Schematyczny film szczegółowo opisujący ten proces jest dostępny online (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). Aktywność AID oraz szlak CSR są powszechnie badane w celu oceny funkcji limfocytów B i odporności humoralnej u myszy. Protokół przedstawiony w niniejszym raporcie opisuje metodę izolacji limfocytów B ze śledzion u myszy i ich późniejszą stymulację bakteryjnym lipopolisacharydem (LPS) w celu indukowania przełączenia klasy na IgG3 (inne izotypy przeciwciał przedstawiono w Tabeli 1). Dodatkowo, do monitorowania podziałów komórkowych stymulowanych komórek, procesie kluczowym dla przełączania izotypów, wykorzystano fluorescencyjny barwnik do barwienia komórek — karboksyfluoresceiny ester succinimidylowy (CFSE) 1, 2.
Regulacja AID oraz mechanizm, według którego zachodzi CSR, pozostają niejasne, dlatego testy przełączania klas in vitro stanowią wiarygodną metodę badania tych procesów w różnych modelach mysich. Testy te były wcześniej wykorzystywane w kontekście niedoboru genów z użyciem myszy z knockautem 3. Co więcej, przełączaniu B komórek in vitro może poprzedzać transdukcja wirusowa w celu modulacji ekspresji genów poprzez wyciszanie RNA (knockdown) lub ekspresję transgenu 4-6. Dane z tego rodzaju eksperymentów wpłynęły na nasze zrozumienie aktywności AID, rozdzielczości reakcji CSR oraz odporności humoralnej u myszy.
Protokół
Krok I: Izolacja limfocytów B śledziony za pomocą wzbogacania magnetycznego
- Myszy eksperymentalne powinny być w wieku od 8 do 12 tygodni, aby zapewnić pełną dojrzałość układu odpornościowego.
- Uśmierć mysz metodą zwichnięcia karku i zanurz w 70% etanolu. Chirurgicznie usuń śledzionę, wykonując nacięcie skóry i mięśni w lewym podżebrzu brzucha, a następnie podziel ją na trzy duże fragmenty w roztworze soli fosforanowej (PBS). Upewnij się, że wszystkie narzędzia i odczynniki są sterylne.
- Używając gumowego końca tłoka strzykawki o pojemności 1 ml, delikatnie rozgnieć śledzionę przez 70 μm sitko do komórek do PBS. Należy stosować ruchy naciskające, a nie rozcierające, ponieważ rozcieranie może doprowadzić do rozerwania większych komórek (np. komórek proliferujących).
- Odwiruj komórki z siłą nieprzekraczającą 350 g przez 5 minut, a następnie resuspenduj osad w PBS. Policz resuspendowane komórki za pomocą komory countingowej (hemocytometru).
- Przygotować zawiesinę o stężeniu 1x108 komórek/ml w PBS z 5% normalnym surowicą szczura w sterylnej polistyrenowej probówce 5 ml z zakrętką (maksymalna objętość 2 ml na probówkę).
- Dodaj 50 μL koktajlu EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment na każdy mL komórek. Przemieszać mieszaninę za pomocą pipety, zakręcić probówki i umieścić w lodówce na 15 minut.
- Dodaj 100 μL EasySep Biotin Selection Cocktail na każdy ml komórek. Przenieść mieszaninę pipetą, zakręcić probówki i umieścić w lodówce na 15 minut.
- Dodaj 100 μL nanocząsteczek magnetycznych EasySep (należy upewnić się, że nanocząsteczki są dobrze wymieszane, a roztwór jest jednorodny) na każdy ml komórek. Pipetować mieszaninę, zamknąć probówki i umieścić w lodówce na 5 minut.
- Uzupełnić roztwór buforem PBS do objętości 2,5 ml i umieścić w magnesie EasySep na 5 minut. Odwrócić magnes oraz probówkę i szybko przelać zawartość do nowej probówki polistyrenowej. Nie potrząsać probówką, ponieważ komórki wyselekcjonowane negatywnie będą magnetycznie związane ze ściankami naczynia.
- Aby dodatkowo zwiększyć czystość zawiesiny komórkowej, probówkę można ponownie umieścić w magnesie na kolejne 5 minut, a następnie przelać jej zawartość do nowej probówki. Może to doprowadzić do zmniejszenia całkowitej odzyskiwalności komórek.
- Czystość limfocytów B można ocenić za pomocą analizy cytometrycznej markerów powierzchniowych limfocytów B. Po wzbogaceniu konsekwentnie obserwujemy czystość na poziomie >95% komórek B220-dodatnich.
Krok II: Barwienie komórek CFSE
- Resuspender wyizolowane komórki w ogrzanym PBS uzupełnionym o 0,1% albuminy surowicy bydlęcej do stężenia końcowego 1 x 106 komórek na ml.
- Przygotować 5 mM roztwór zapasu CFSE (rozcieńczony w sterylnym dimetylosulfoksydzie) i dodać 2μL na każdy ml komórek w probówce. Końcowe stężenie 10μM jest optymalny do barwienia pierwotnych limfocytów B.
- Inkubować w temperaturze 37°C przez 10 minut w ciemności (uwaga: CFSE jest wrażliwy na światło i w miarę możliwości należy go przechowywać w ciemności).
- Zatrzymaj barwienie, dodając do komórek taką samą objętość surowicy z cielęcej wołowiny i inkubując na lodzie przez 5 minut.
- Przemyj komórki, dopełniając probówki pożywką hodowlaną (patrz krok III w celu uzyskania receptury) i wirując przy 350 g. Należy pamiętać, że w celu zniwelowania lepkości surowicy cielęcej oraz umożliwienia utworzenia osadu komórkowego, należy dodać co najmniej pięciokrotność objętości pożywki w stosunku do objętości zawiesiny.
- Przemyć komórki dwukrotnie w medium hodowlanym. Komórki są teraz gotowe do stymulacji.
Krok III: Stymulacja komórek LPS
- Przygotuj swój in vitro pożywka do hodowli limfocytów B poprzez uzupełnienie RPMI 1640 o 10% płodowej surowicy cielęcej oraz 50 μM β-merkaptoetanol
- Przygotować podłoże do stymulacji, dodając LPS do stężenia końcowego wynoszącego 50μg/mLAliquot (podzielenie na porcje) 125 μL pożywki stymulującej do każdego dołka płaskodنnej 96-dołkowej płytki do hodowli tkanek.
- Przygotuj barwione CFSE limfocyty B w medium hodowlanym bez LPS w stężeniu końcowym 3,2 x 10^6/ml6 komórek/ml. Dodać 125 μL zawiesiny komórkowej do studni zawierających medium stymulujące i wymieszać, delikatnie pipetując.
- Każda studnia zawiera teraz 4 x 105 komórki w końcowym stężeniu LPS wynoszącym 25 μg/mLZapewnia to optymalne poziomy proliferacji komórek i przełączania klas przeciwciał, choć wartości te można modyfikować zgodnie z potrzebami.
- Inkubować komórki w temperaturze 37°C oraz 5% CO22 przez 72 do 96 godzin. Po 48 godzinach pod mikroskopem będą wyraźnie widoczne skupiska dużych proliferujących limfocytów B.
Krok IV: Analiza cytometryczna przepływowa przełączania klas
- W momencie przejścia do analizy przełączania klas, należy wyjąć komórki z warunków hodowli i dwukrotnie przemyć je 1 ml buforu barwiącego (PBS z 2% surowicą cielęcą).
- Aby zapobiec niespecyficznemu barwieniu przeciwciałami komórek, należy odwirować komórki z prędkością 350 g w celu uzyskania osadu, a następnie inkubować je w 100μL buforu barwiącego z dodatkiem 5% normalnego surowicy mysiej i 1μg FcBlock w ilości na 10^6 komórek przez 15 minut na lodzie. Blokowanie komórek powinno być przeprowadzane na lodzie.
- Bez przemywania komórek dodać 1μg na 106 komórki przeciwciałem anty-mouse IgG3 znakowanym fluorescencyjnie i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4°C w celu barwienia komórek.
- Wypłukać komórki dwukrotnie poprzez wirowanie, a następnie resuspendować w 200-300 μL buforu barwiącego. Komórki są teraz gotowe do analizy metodą cytometrii przepływowej.
- CFSE jest optymalnie wzbudzany przy 492 nm (za pomocą lasera argonowego) i emituje światło przy 517 nm. Widmo wzbudzenia i emisji przeciwciała IgG3 jest zależne od zastosowanego koniugatu barwnika fluorescencyjnego.
Reprezentatywne wyniki
Po wzbogaceniu magnetycznym zawiesina komórkowa powinna wyglądać jak homogenna populacja nierozróżnialnych, małych, okrągłych komórek (Rycina 1A). Po 48–72 godzinach stymulacji wyraźnie widoczne będą izolowane skupiska powiększonych komórek proliferujących (Rycina 1B). Duża proporcja komórek nieproliferujących będzie wyglądać na małe i ziarniste, gdyż będą one przechodzić proces apoptozy.
CSR można zazwyczaj wykryć na najwyższym poziomie między 72. a 96. godziną po stymulacji, zanim większość komórek zacznie obumierać 7. Na tym etapie komórki powinny przejść szereg podziałów, przy czym komórki z przełączonym izotypem pojawiają się w późniejszej populacji komórek potomnych. Reprezentatywny wykres cytometrii przepływowej obrazujący rozcieńczenie CFSE oraz ekspresję powierzchniową IgG3 po 96 godzinach stymulacji LPS przedstawiono na rysunku 2.
Tabela 1. Koktajle do przełączania izotypów. Uwaga: Wartości stężeń stymulatorów są jedynie rekomendacjami. Może być konieczne przeprowadzenie miareczkowania.
| Pożądany izotyp | Koktajl stymulujący |
| IgG1 i IgE | LPS (25μg/mL) i IL-4 (10 ng/mL) |
| IgG1 i IgE | Anti-CD40 (10μg/mL) i IL-4 (10 ng/mL) |
| IgG2a | LPS (25μg/mL) i IFN-γ (10 ng/mL) |
| IgG2b i IgG3 | LPS (25μg/mL) |
| IgA | LPS (25μg/mL), TGF-β (2 ng/mL) i IL-5 (1.5 ng/mL) |
Rycina 1. Izolacja i stymulacja LPS komórek B śledziony. (a) Magnetycznie wzbogacone komórki B śledziony przed stymulacją LPS. (b) 48 godzin po stymulacji 25 μg/mL LPS. Proliferujące komórki widoczne są jako skupiska na tle komórek blastycznych i apoptotycznych.
Rysunek 2. Proliferacja i rekombinacja przełączania klas po 96 godzinach. (a) Rozcieńczenie CFSE dla komórek stymulowanych LPS po 96 godzinach hodowli. Każdy oddzielny szczyt reprezentuje rozcieńczenie fluorescencji CFSE odpowiadające pojedynczemu podziałowi komórki. (b) Ekspresja IgG3 wykazująca pojawienie się populacji dodatniej pod kątem IgG3 po kilku rundach podziałów komórkowych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany powyżej protokół stanowi standardowy test do analizy ekspresji i funkcji AID podczas przełączania klas w pierwotnych komórkach B myszy. Protokół ten wykorzystuje bakteryjne LPS do indukcji przełączania z IgM na IgG3, choć można wprowadzić modyfikacje w pożywce stymulującej, aby wywołać przełączanie na inne izotypy (podsumowano w Tabeli 1 8, 9).
Zauważyliśmy, że z nieznanych jeszcze przyczyn surowica cielęca może wpływać na poziom przełączania klas obserwowany in vitro. Aby ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni laboratorium Martina za pomocne dyskusje. Niniejsza publikacja jest finansowana z grantu Kanadyjskiego Instytutu Badań nad Zdrowiem (MOP-89783). A.M. otrzymuje wsparcie w ramach Canada Research Chair Tier II Award.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Fosforanowy bufor solny (PBS) | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| Zestaw do wzbogacania limfocytów B myszy EasySep | Stem Cell Technologies | 19754 | |
| Probówki polistyrenowe | BD Biosciences | 352058 | |
| Albuminy surowicy bydlęcej (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Zestaw do badania proliferacji komórek CellTrace CFSE | Invitrogen | C34554 | |
| Surowica z cieląt | Hyclone | SH30072.03 | |
| Pożywka do hodowli RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 11875 | |
| Lipopolisacharydy z Escherichia coli | Sigma-Aldrich | L6529 | |
| β-merkapto–etanol | GIBCO, by Life Technologies | 21985 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Hyclone | SH30396.03 | |
| Normalna surowica mysia | Jackson ImmunoResearch | 011-000 | |
| Oczyszczone przeciwciała szczurze anty-mysie CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | |
| Przeciwciała szczurze anty-mysie IgG3 | BD Biosciences | 553401 |
Bibliografia
- Hodgkin, P. D., Lee, J. H., Lyons, A. B. B cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number. J Exp Med. 184, 277-281 (1996).
- McCall, M. N., Hodgkin, P. D. Switch recombination and germ-line transcription are division-regulated events in B lymphocytes. Biochim Biophys Acta. 1447, 43-50 (1999).
- Manis, J. P. 53BP1 links DNA damage-response pathways to immunoglobulin heavy chain class-switch recombination. Nat Immunol. 5, 481-487 (2004).
- de Yebenes, V. G. miR-181b negatively regulates activation-induced cytidine deaminase in B cells. J Exp Med. 205, 2199-2206 (2008).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Ramachandran, S. The RNF8/RNF168 ubiquitin ligase cascade facilitates class switch recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 809-8014 (2010).
- Zaheen, A. AID constrains germinal center size by rendering B cells susceptible to apoptosis. Blood. 114, 547-554 (2009).
- Chaudhuri, J., Alt, F. W. Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair. Nat Rev Immunol. 4, 541-552 (2004).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Stimuli that enhance IgA class switching increase histone 3 acetylation at S alpha, but poorly stimulate sequential switching from IgG2b. Eur J Immunol. 37, 240-251 (2007).
- Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. Int Immunol. 19, 545-556 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
