Indukcja i ocena rekombinacji przełączającej klasy w oczyszczonych komórkach B myszy

Podsumowanie

Po ekspozycji na antygen subpopulacje aktywowanych limfocytów B przechodzą proces znany jako rekombinacja przełączająca klasę (CSR), aby wytworzyć izotypy przeciwciał o odrębnych funkcjach efektorowych. Protokół opisany w niniejszym raporcie wyjaśnia, w jaki sposób CSR można indukować i analizować in vitro w celu badania funkcji limfocytów B.

Streszczenie

Odporność humoralna to gałąź układu odpornościowego podtrzymywana przez limfocyty B i pośrednicząca poprzez sekrecję przeciwciał. Po aktywacji limfocytów B locus immunoglobulin przechodzi szereg modyfikacji genetycznych, aby zmienić zdolność wiązania i funkcję efektorową wydzielanych przeciwciał. Proces ten jest podkreślony przez zdarzenie rekombinacji genomicznej znane jako rekombinacja przełączająca klasę (CSR), w której domyślny izotyp przeciwciał IgM zostaje zastąpiony przez jeden z izotypów IgG, IgA lub IgE. Każdy izotyp posiada odmienne funkcje efektorowe, co sprawia, że CSR jest kluczowy dla utrzymania odporności.

Dywersyfikacja locus immunoglobulin jest pośredniczona przez enzym cytidynodeaminazę indukowaną aktywacją (AID). Schematyczny film szczegółowo opisujący ten proces jest dostępny online (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). Aktywność AID oraz szlak CSR są powszechnie badane w celu oceny funkcji limfocytów B i odporności humoralnej u myszy. Protokół przedstawiony w niniejszym raporcie opisuje metodę izolacji limfocytów B ze śledzion u myszy i ich późniejszą stymulację bakteryjnym lipopolisacharydem (LPS) w celu indukowania przełączenia klasy na IgG3 (inne izotypy przeciwciał przedstawiono w Tabeli 1). Dodatkowo, do monitorowania podziałów komórkowych stymulowanych komórek, procesie kluczowym dla przełączania izotypów, wykorzystano fluorescencyjny barwnik do barwienia komórek — karboksyfluoresceiny ester succinimidylowy (CFSE) ^{1, 2}.

Regulacja AID oraz mechanizm, według którego zachodzi CSR, pozostają niejasne, dlatego testy przełączania klas in vitro stanowią wiarygodną metodę badania tych procesów w różnych modelach mysich. Testy te były wcześniej wykorzystywane w kontekście niedoboru genów z użyciem myszy z knockautem ³. Co więcej, przełączaniu B komórek in vitro może poprzedzać transdukcja wirusowa w celu modulacji ekspresji genów poprzez wyciszanie RNA (knockdown) lub ekspresję transgenu ^4-6. Dane z tego rodzaju eksperymentów wpłynęły na nasze zrozumienie aktywności AID, rozdzielczości reakcji CSR oraz odporności humoralnej u myszy.

Protokół

Krok I: Izolacja limfocytów B ze śledziony poprzez wzbogacanie magnetyczne

1. Myszy eksperymentalne powinny być w wieku 8-12 tygodni, aby zapewnić pełny rozwój układu odpornościowego.
2. Myszy uśmiercić poprzez zwichnięcie karku i zanurzyć w 70% etanolu. Śledzionę usunąć chirurgicznie, wykonując nacięcie skóry i mięśni w lewym podżebrzu brzucha, a następnie pociąć ją na trzy duże części w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Należy upewnić się, że wszystkie narzędzia i odczynniki są sterylne.
3. Używając gumowego końca tłoka strzykawki 1 mL, delikatnie rozetrzeć śledzionę przez sito komórkowe 70 μm do PBS. Należy stosować ruchy pchające, a nie rozcierające, ponieważ rozcieranie może doprowadzić do rozerwania większych (tj. proliferujących) komórek.
4. Wirować komórki przy przeciążeniu nieprzekraczającym 350 g przez 5 minut, a następnie resuspendować osad w PBS. Liczbę resuspendowanych komórek oznaczyć za pomocą hemocytometru.
5. Przygotować zawiesinę o stężeniu 1x10⁸ komórek/mL w PBS z 5% normalnym surowicą szczurzą w sterylnej polistyrenowej probówce 5 mL z nakrętką (maksymalna objętość 2 mL na probówkę).
6. Dodać 50 μL koktajlu EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment na każdy 1 mL komórek. Wymieszać zawiesinę pipetą, zakręcić probówki i pozostawić w lodówce na 15 minut.
7. Dodać 100 μL koktajlu EasySep Biotin Selection na każdy 1 mL komórek. Wymieszać zawiesinę pipetą, zakręcić probówki i pozostawić w lodówce na 15 minut.
8. Dodać 100 μL nanocząsteczek magnetycznych EasySep (należy upewnić się, że nanocząsteczki są dobrze wymieszane, a roztwór jest jednorodny) na każdy 1 mL komórek. Wymieszać zawiesinę pipetą, zakręcić probówki i pozostawić w lodówce na 5 minut.
9. Dopełnić objętość roztworu do 2,5 mL za pomocą PBS i umieścić w magnesie EasySep na 5 minut. Odwrócić magnes oraz probówkę i szybko przelać zawiesinę do nowej probówki polistyrenowej. Nie wstrząsać probówką, ponieważ negatywnie wyselekcjonowane komórki będą magnetycznie związane ze ściankami probówki.
10. Aby dodatkowo zwiększyć czystość zawiesiny komórkowej, probówkę można ponownie umieścić w magnesie na dodatkowe 5 minut i przelać do nowej probówki. Może to jednak zmniejszyć całkowitą odzyskalność komórek.
11. Czystość limfocytów B można ocenić za pomocą analizy cytometrycznej markerów powierzchniowych limfocytów B. Po wzbogaceniu stale obserwujemy czystość na poziomie >95% komórek B220 dodatnich.

Krok II: Barwienie komórek CFSE

1. Resuspenduj wyizolowane komórki w ciepłym PBS uzupełnionym o 0,1% albuminy surowicy bydlęcej do końcowej koncentracji 1 x 10⁶ komórek na mL.
2. Przygotuj 5mM roztwór stokowy CFSE (rozcieńczony w sterylnym dimetylosulfoksydzie) i dodaj 2μL na każdy mL komórek w probówce. Końcowa koncentracja 10μM jest optymalna do barwienia pierwotnych limfocytów B.
3. Inkubuj w 37°C przez 10 minut w ciemności (uwaga: CFSE jest światłoczułe i w miarę możliwości należy go przechowywać w ciemności).
4. Zatrzymaj barwienie, dodając do komórek taką samą objętość surowicy cielęcej bydlęcej i inkubując na lodzie przez 5 minut.
5. Przemyj komórki, dopełniając probówki pożywką hodowlaną (patrz krok III w celu uzyskania receptury) i wirując przy 350 g. Należy pamiętać, że aby zniwelować lepkość surowicy cielęcej bydlęcej i umożliwić utworzenie osadu komórkowego, należy dodać co najmniej 5-krotną objętość pożywki.
6. Przemyj komórki dwukrotnie w pożywce hodowlanej. Komórki są teraz gotowe do stymulacji.

Krok III: Stymulacja komórek LPS

1. Przygotuj pożywkę do hodowli limfocytów B in vitro, uzupełniając RPMI 1640 o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 50 μM β-merkaptoetanolu.
2. Przygotuj pożywkę stymulującą, dodając LPS do końcowego stężenia 50 μg/mL. Odmierz 125 μL pożywki stymulującej do każdej studni płaskodنnej płytki 96-dołkowej do hodowli tkanek.
3. Przygotuj limfocyty B barwione CFSE w pożywce hodowlanej bez LPS do końcowego stężenia 3,2 x 10⁶ komórek/mL. Dodaj 125 μL zawiesiny komórkowej do studni zawierających pożywkę stymulującą i wymieszaj, delikatnie pipetując.
4. Każda studnia zawiera obecnie 4 x 10⁵ komórek przy końcowym stężeniu LPS wynoszącym 25 μg/mL. Zapewnia to optymalny poziom proliferacji komórek i przełączania klas, choć wartości te można modyfikować według uznania.
5. Inkubuj komórki w temperaturze 37°C i przy 5% CO₂ przez 72 do 96 godzin. Po 48 godzinach pod mikroskopem będą wyraźnie widoczne skupiska dużych, proliferujących limfocytów B.

Krok IV: Analiza cytometryczna przepływowa przełączania klas

1. Gdy będą Państwo gotowi do analizy przełączania klas przeciwciał, należy wyjąć komórki z warunków hodowli i przemyć je dwukrotnie 1 ml buforu do barwienia (PBS z 2% serum cielęcym).
2. Aby zapobiec niespecyficznemu barwieniu komórek przeciwciałami, należytwirować komórki przy 350 g, a następnie inkubować je przez 15 minut w lodzie w 100 μL buforu do barwienia z dodatkiem 5% normalnego surowicy mysiej oraz 1 μg FcBlock na 10⁶ komórek. Blokowanie komórek powinno być przeprowadzane w lodzie.
3. Bez przemywania komórek dodać 1 μg na 10⁶ komórki przeciwciałem anty-mysie IgG3 znakowanym fluorescencyjnie i pozostawić komórki do barwienia na 30 minut w temperaturze 4°C.
4. Komórki należy przemyć dwukrotnie poprzez wirowanie, a następnie ponownie zawiesić w 200–300 μL buforu do barwienia. Komórki są teraz gotowe do analizy metodą cytometrii przepływowej.
5. CFSE jest optymalnie wzbudzany przy 492 nm (za pomocą lasera argonowo-jonowego) i emituje światło przy 517 nm. Widmo wzbudzenia i emisji przeciwciała IgG3 zależy od sprzężonego z nim barwnika fluorescencyjnego.

Reprezentatywne wyniki

Po wzbogaceniu magnetycznym zawiesina komórkowa powinna wyglądać jak homogenna populacja nieodróżnialnych, małych, okrągłych komórek (Rycina 1A). Po 48–72 godzinach stymulacji wyraźnie widoczne będą izolowane skupiska powiększonych komórek proliferujących (Rycina 1B). Duża część komórek nieproliferujących będzie wyglądać na małe i ziarniste w miarę przechodzenia procesu apoptozy.

CSR jest zazwyczaj wykrywalny na najwyższym poziomie od 72 do 96 godzin po stymulacji, zanim większość komórek zacznie obumierać ⁷. Na tym etapie komórki powinny przejść szereg podziałów, przy czym komórki z przełączonym izotypem pojawiają się w późniejszej populacji komórek potomnych. Reprezentatywny wykres cytometryczny rozcieńczenia CFSE i ekspresji powierzchniowej IgG3 po 96 godzinach stymulacji LPS przedstawiono na Rysunku 2.

Tabela 1. Koktajle do przełączania izotypów. Uwaga: Wartości stężeń stymulantów są jedynie rekomendacjami. Konieczne może być przeprowadzenie miareczkowania.

Pożądany izotyp	Koktajl stymulujący
IgG1 i IgE	LPS (25μg/mL) i IL-4 (10 ng/mL)
IgG1 i IgE	Anti-CD40 (10μg/mL) i IL-4 (10 ng/mL)
IgG2a	LPS (25μg/mL) i IFN-γ (10 ng/mL)
IgG2b i IgG3	LPS (25μg/mL)
IgA	LPS (25μg/mL), TGF-β (2 ng/mL) i IL-5 (1.5 ng/mL)

Rycina 1. Izolacja i stymulacja LPS limfocytów B śledziony. (a) Magnetycznie wzbogacone limfocyty B śledziony przed stymulacją LPS. (b) 48 godzin po stymulacji 25 μg/mL LPS. Proliferujące komórki widoczne są jako skupiska na tle blastów i komórek apoptotycznych.

Rycina 2. Proliferacja i rekombinacja przełączająca klasę po 96 godzinach. (a) Rozcieńczenie CFSE dla komórek stymulowanych LPS po 96 godzinach hodowli. Każdy niezależny szczyt reprezentuje rozcieńczenie fluorescencji CFSE odpowiadające pojedynczemu podziałowi komórki. (b) Ekspresja IgG3 wykazująca pojawienie się populacji pozytywnej pod kątem IgG3 po kilku rundach podziałów komórkowych.

Dyskusja

Opisany powyżej protokół stanowi standardowy test do analizy ekspresji i funkcji AID podczas przełączania klas w pierwotnych komórkach B myszy. Protokół ten wykorzystuje bakteryjne LPS do indukcji przełączania z IgM na IgG3, choć można wprowadzić modyfikacje w pożywce stymulującej, aby wywołać przełączanie na inne izotypy (podsumowano w Tabeli 1 ^{8, 9}).

Zauważyliśmy, że z nieznanych jeszcze przyczyn surowica cielęca może wpływać na poziom przełączania klas obserwowany in vitro. Aby ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fosforanowy bufor solny (PBS)	GIBCO, by Life Technologies	14190
Zestaw do wzbogacania limfocytów B myszy EasySep	Stem Cell Technologies	19754
Probówki polistyrenowe	BD Biosciences	352058
Albuminy surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030
Zestaw do badania proliferacji komórek CellTrace CFSE	Invitrogen	C34554
Surowica z cieląt	Hyclone	SH30072.03
Pożywka do hodowli RPMI 1640	GIBCO, by Life Technologies	11875
Lipopolisacharydy z Escherichia coli	Sigma-Aldrich	L6529
β-merkapto–etanol	GIBCO, by Life Technologies	21985
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Hyclone	SH30396.03
Normalna surowica mysia	Jackson ImmunoResearch	011-000
Oczyszczone przeciwciała szczurze anty-mysie CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Biosciences	553141
Przeciwciała szczurze anty-mysie IgG3	BD Biosciences	553401