Wizualizacja replikacji mitochondrialnego DNA w poszczególnych komórkach poprzez amplifikację sygnału EdU

Summary

Opracowaliśmy czułą technikę oznaczania nowo zsyntetyzowanego mitochondrialnego DNA (mtDNA) w pojedynczych komórkach w celu zbadania biogenezy mtDNA. Technika ta łączy włączenie EdU wraz z protokołem wzmocnienia sygnału tyramidowego (TSA) w celu wizualizacji replikacji mtDNA w subkomórkowych przedziałach neuronów.

Abstract

Mitochondria są kluczowymi regulatorami energii komórkowej, a biogeneza mitochondriów jest niezbędnym elementem regulacji liczby mitochondriów w zdrowych komórkach^1-3. Jednym z podejść do monitorowania biogenezy mitochondriów jest pomiar szybkości replikacji mitochondrialnego DNA (mtDNA)⁴. Opracowaliśmy czułą technikę znakowania nowo zsyntetyzowanego mtDNA w poszczególnych komórkach w celu zbadania biogenezy mtDNA. Technika ta łączy inkorporację 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU)^5-7 z protokołem wzmocnienia sygnału tyramidowego (TSA)⁸ w celu wizualizacji replikacji mtDNA w subkomórkowych przedziałach neuronów. EdU jest lepszy od innych analogów tymidyny, takich jak 5-bromo-2-deoksyurydyna (BrdU), ponieważ początkowa reakcja kliknięcia w celu oznaczenia EdU^5-7 nie wymaga ostrych zabiegów kwasowych ani trawienia enzymów, które są wymagane do odsłonięcia epitopu BrdU. Łagodniejsze znakowanie EdU pozwala na bezpośrednie porównanie jego włączenia z innymi markerami komórkowymi^9-10. Możliwość wizualizacji i ilościowego określenia biogenezy mtDNA stanowi niezbędne narzędzie do badania mechanizmów wykorzystywanych do regulacji biogenezy mitochondriów i dostarczyłaby wglądu w patogenezę związaną z toksycznością leków, starzeniem się, rakiem i chorobami neurodegeneracyjnymi. Nasza technika ma zastosowanie do neuronów czuciowych, a także innych typów komórek. Zastosowanie tej techniki do pomiaru biogenezy mtDNA ma znaczące implikacje w pogłębianiu zrozumienia zarówno normalnej fizjologii komórkowej, jak i upośledzonych stanów chorobowych.

Protocol

1. Przygotowanie neuronów

1. Neurony zwoju korzenia grzbietowego (DRG) są hodowane na sterylnych (autoklawowanych) szklanych szkiełkach nakrywkowych o średnicy 12 mm na 24-dołkowej płytce hodowlanej.
2. Zapas 10 mM EdU (w DMSO, zestaw do oznaczania mikropłytek Click-iT EdU) jest zwykle rozcieńczany w stosunku 1:100 w pożywce hodowlanej w celu uzyskania 10-krotnego roztworu EdU (100 μM), a następnie rozcieńczany w stosunku 1:10 do dołków hodowlanych (np. 30 μl roztworu 10X EdU do łącznej objętości 300 μl pożywki hodowlanej). Neurony DRG inkubuje się z końcowym stężeniem 10 μM EdU w temperaturze 37°C i 5% CO₂ w ciągu 2-24 godzin. Czas ten zależy od tego, jak leczenie wpływa na szybkość syntezy mtDNA.
3. W dygestorium neurony DRG są utrwalane w 2% paraformaldehydzie przez 10-15 minut w temperaturze pokojowej, myte dwukrotnie w 1X PBS 2-5 minut każde pranie i przechowywane w świeżym 1X PBS przez okres do 1 miesiąca w temperaturze 4°C.
4. Szkiełka nakrywkowe przenosi się za pomocą kleszczyków z cienką końcówką do przygotowanej wilgotnej komory (naczynie Corning BioAssay z czarnym papierowym dnem dla kontrastu, owijane folią aluminiową w celu ochrony wrażliwych na światło elementów i nawilżane chusteczkami nasączonymi wodą) i umieszczane na arkuszu Parafilmu M, który zapewnia hydrofobową powierzchnię w celu ograniczenia roztworów do szkiełka nakrywkowego. Poniższy protokół jest przeznaczony dla 28 szkiełek nakrywkowych, a roztwory są przygotowane dla 32 szkiełek nakrywkowych (około 14% dodatkowej objętości). Roztwory z drogimi lub ograniczonymi składnikami są wytwarzane tak, że na każde szkiełko nakrywkowe stosuje się 75-80 μl. W przeciwnym razie 200-300 μl stosuje się do roztworów myjących i blokowych, aby dokładnie wypłukać poprzednie roztwory.
5. Ponownie nałóż 1X PBS, aby pokryć powierzchnię każdego szkiełka nakrywkowego (200-300 μL). Przygotuj test Click-iT i zestawy do amplifikacji sygnału tyramidu zgodnie z opisem poniżej oraz w instrukcjach producenta.

Przygotowanie zestawu do oznaczania mikropłytek Click-iT EdU

Większość komponentów z zestawu do testowania mikropłytek Click-iT EdU jest gotowa i przechowywana w temperaturze 4°C [2x Bufor reakcyjny Click-iT (10x Składnik E), CuSO4 (100 mM, Składnik F), utrwalacz Click-iT EdU (Składnik D) i Bufor blokujący (2x Składnik H)]. Dodatek buforowy Click-iT EdU (10x Składnik G) jest przechowywany w temperaturze -20°C, aby zapobiec jego żółtobrązowieniu z upływem czasu. Ten składnik toleruje powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania.

Azydek Oregon Green 488 (Składnik B) powinien być podzielony na małe porcje (10-20 μL), aby zminimalizować cykle zamrażania i rozmrażania i przechowywać w temperaturze -20°C.

Aby przygotować podstawowy roztwór koniugatu anty-Oregon Green HRP (Składnik I), dodaj 75 μL Milli Q dH₂O do fiolki. Wymieszać przez delikatne pipetowanie lub odwrócenie, aby uniknąć pienienia się i przechowywać w temperaturze 4°C. Nie wirować.

Przygotowanie Zestawu TSA #12, z HRP Goat Anti-Rabbit IgG i Alexa Fluor 488 Tiremid Kit

Aby przygotować podstawowy roztwór tyramide, rozpuść materiał stały (tyramid Alexa Fluor 488, składnik A) w 150 μl DMSO (składnik B). Odwrócić fiolkę kilka razy, aby rozpuścić tyramid pokrywający boki fiolki. Przechowywać roztwór podstawowy w małych porcjach (10-20 μl) w temperaturze ≤-20°C, wysuszony i chroniony przed światłem.

2. Etykietowanie Click-iT 5-etynylo-2-deoksyurydyny (EdU)

UWAGA: Wszystkie roztwory są usuwane za pomocą pipety do przenoszenia z bańką z końcówką o pojemności 200 μL przymocowaną na końcu, aby delikatnie usunąć płyny bez utraty komórek. Unikaj używania linii próżniowej, która zwykle zbyt energicznie usuwa roztwory. Pipeta z bańką służy do delikatnego zalewania szkiełek nakrywkowych 200-300 μl roztworów myjących, aby dokładnie wypłukać poprzedni roztwór.

1. Komórki są przesiąknięte 0,1% Triton-X-100 w roztworze 1X PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej w zakrytej wilgotnej komorze. Stosować 1% roztwory podstawowe Triton-X-100.
   • Zrób 3000 μl 0,1% Triton-X-100, dodając 300 μl 1% Triton-X-100 do 2700 μL 1X PBS.
   • Użyj 75-80 μl na szkiełko nakrywkowe.
2. Usuń roztwór Triton X-100 i spłucz dwukrotnie 1X PBS.
3. Aktywność endogennej peroksydazy jest gaszona przez 1% H₂O₂ w 1X PBS roztworze przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć 30% roztwór H₂O₂ z 1X PBS. Ten roztwór powinien być świeży, ale można go przygotować podczas 10-minutowego kroku przepuszczalności powyżej (krok 3.1).
   • Zrobić 3000 μL 1% H₂O₂ dodając 100 μL 30% H₂O₂ do 2900 μL 1X PBS.
   • Użyj 75-80 μl na szkiełko nakrywkowe.
   • Usuń roztwór peroksydazy i spłucz dwukrotnie 1X PBS.
4. Reakcja Click-iT EdU
   • Na 32 szkiełka nakrywkowe (32 x 80 μl = 2560 μl) potrzeba łącznie 2560 μl. 2x reakcja odbywa się w 1280 μL, co stanowi połowę całkowitej objętości reakcji.
   • Świeżo przygotuj koktajl reakcyjny Click-iT przed rozpoczęciem 5-minutowej naprawy (krok 3.5 poniżej).
   • Wymieszaj koktajl, pipetując w górę iw dół. Nie wiruj podczas tej reakcji.
     

     2 x koktajl reakcyjny Komponenty pochodzą z zestawu do oznaczania mikropłytek Click-iT EdU	Połowa objętości: 1280 μL
     Milli Q dH2O	1132,8 μL
     2x Bufor reakcyjny Click-iT (10x Składnik E)	100,3 μL
     Dodatek buforowy Click-iT EdU (10x składnik G)	25,6 μL
     CuSO4 (100 mM, składnik F)	25,6 μL
     Oregon Green Azide (składnik A)	6,4 μl
     łączny	1290,7 μL

     
     UWAGA: Objętości użyte powyżej są proporcjonalne do objętości wymienionych we wskazówkach dotyczących zestawu do oznaczania mikropłytek Click-iT EdU. Końcowa objętość Reaction Cocktail to nieco ponad 1280 μL.
   • Reakcja 2X Click-iT jest rozcieńczana równą objętością utrwalacza Click-iT EdU (Składnik D) tuż przed użyciem. Zmieszanie ich ze sobą tworzy jednolity roztwór reakcyjny dla wszystkich szkiełek nakrywkowych.
   • Dodać 1290,7 μl utrwalacza Click-iT EdU (składnik D) do koktajlu reakcyjnego 1290,7 μl. Użyj 75-80 μl na szkiełko nakrywkowe.
5. Po utrwaleniu neuronów za pomocą utrwalacza Click-iT EdU (składnik D) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
6. Usuń poprawkę i dodaj koktajl reakcyjny z góry (krok 3.4). Przykryć w celu ochrony przed światłem i inkubować przez 25 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie wyjmij koktajl reakcyjny. Przemyć dwukrotnie rozcieńczonym 1X Blokującym Bufor (2X Składnik H).
   • Zrobić 5200 μL 1X buforu blokującego, rozcieńczając 2600 μl buforu blokującego (2x składnik H) równą objętością MilliQ d H₂O (2600 μL). Użyj 75-80 μl na szkiełko nakrywkowe.
7. Pod mikroskopem epi-fluorescencyjnym sprawdź, czy w jądrach mitotycznie aktywnych komórek kontrolnych nie ma zabarwienia Oregon Green.

3. Wzmocnienie sygnału tyramidowego (TSA) sygnału EdU

1. Dodaj 1% roztwór blokowy TSA do każdego szkiełka nakrywkowego i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
   • Przygotuj 6000 μl 1% roztworu blokowego TSA, ważąc 0,06 g odczynnika blokującego TSA (zestaw TSA #12, składnik D) i dodając go do 6000 μL 1X PBS. Wirować do mieszania. Dodanie 5% surowicy koziej do 1% roztworu blokowego TSA często pomaga zmniejszyć niespecyficzne wiązanie.
2. Krótko odkręć zapas przeciwciał sprzężonych z peroksydazą chrzanową anty-Oregon Green (składnik I testu mikropłytek Click-iT EdU), przygotowany 2-24 godziny przed TSA. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w stosunku 1:300 w 1% roztworze blokującym TSA i delikatnie odwrócić lub pipetować w górę iw dół, aby wymieszać. Nie należy wirować, aby uniknąć zakłócenia przeciwciała sprzężonego z HRP. Usunąć 1% roztwór blokowy TSA, dodać 75 μl do każdego szkiełka nakrywkowego i inkubować przez noc w temperaturze 4°C.
   • Przeciwciało może być stosowane w postaci bardziej skoncentrowanej, na przykład 1:150, ale jest dostarczane w ograniczonych ilościach, dlatego należy je stosować oszczędnie. Ponownie, dodanie 5% surowicy koziej do 1% roztworu blokowego TSA często pomaga zmniejszyć niespecyficzne wiązanie przeciwciała sprzężonego z peroksydazą zielonego chrzanu Oregon
   .
   • Przygotuj 2560 μl roztworu przeciwciała w stosunku 1:300, dodając 8,53 μl podstawowego testu mikropłytkowego Rabbit anti-Oregon Green-HRP (Click-iT EdU Microplate Assay) do 2560 μl 1% TSA Blocking. Wymieszać przez delikatne pipetowanie lub odwrócenie.
3. Następnego dnia usuń roztwór przeciwciał i spłucz trzy razy 1X PBS. Inkubować szkiełka nakrywkowe w końcowym płukaniu przez dodatkowe 30-60 minut w temperaturze pokojowej, aby upewnić się, że niezwiązane przeciwciało pierwszorzędowe zostało usunięte.
4. Przygotować odczyn tyramidowy na 2560 μl (32 szkiełka nakrywkowe x 80 μl).
   • Przygotować 400 μl 0,15% roztworu H₂O_{2 (}100X) dodając 2 μl 30 % H₂O₂ (zestaw TSA #12, składnik F) do 398 μl buforu do amplifikacji (zestaw TSA #12, składnik E). Należy to zrobić tuż przed potrzebą.
   • Aby uzyskać końcową objętość 2560 μl, połączyć:
     • 25,6 μL Tyramid-488 (zestaw TSA, składnik A)
     • 2508.8 μL Bufor wzmacniający (zestaw TSA, składnik E)
     • 25,6 μL 0,15% H₂O₂ (od góry dla końcowego 0,0015% H₂O₂)
     • Usunąć 1X PBS i inkubować z reakcją tyramidową przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
5. Usunąć reakcję tyramidu i spłukać trzykrotnie 1X PBS, inkubując w końcowym praniu przez 30-60 minut w temperaturze pokojowej jak poprzednio.
6. Sprawdź znakowanie mtDNA pod mikroskopem epifluorescencyjnym.
   • Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szklanych szkiełkach mikroskopowych za pomocą środka mocującego zapobiegającego blaknięciu, takiego jak ProLong Gold z DAPI. Alternatywnie, po znakowaniu i amplifikacji EdU można przeprowadzić standardową immunocytochemię fluorescencyjną w celu znakowania innych markerów komórkowych.

4. Reprezentatywne wyniki: Wizualizacja replikacji mitochondrialnego DNA jako markera biogenezy mitochondriów

Interesuje nas, jak neurony czuciowe (Rysunek 1) regulują liczbę mitochondriów. Protokół ten oznaczy nowo zsyntetyzowane mtDNA markerem fluorescencyjnym jako sposób pomiaru nowych mitochondriów. Włączenie syntetycznego nukleotydu EdU, a następnie chemia kliknięcia zielonego azydku Oregonu, a następnie amplifikacja tyramidem Alexa-Fluor 488 powoduje znakowanie mtDNA zielonym sygnałem fluorescencyjnym (ryc. 2). Jeśli zostanie to zrobione poprawnie, wzmocniony zielony sygnał jest wystarczająco wyższy niż fluorescencja tła (taka jak autofluorescencja komórkowa lub efekt uboczny reakcji HRP-TSA).

Ta technika jest przeznaczona do oznaczania nowo zreplikowanych mtDNA w celu wizualizacji i ilościowego określenia biogenezy mtDNA w subkomórkowych przedziałach neuronów (Rysunek 3). Znakowanie EdU pozwala na późniejszą immunocytochemię fluorescencyjną w celu znakowania innych markerów komórkowych, takich jak neurofilament (ryc. 3D).

Reakcję TSA można również przeprowadzić z innymi fluorescencyjnymi tyramidami Alexa Fluor, takimi jak Alexa Fluor 594-tyramide. Powoduje to zielony fluorescencyjny sygnał jądrowy z reakcji zielonego azydku Oregonu w jądrze, ale brak zielonego sygnału w mtDNA, który jest niewykrywalny przed TSA. Amplifikacja za pomocą tyramidu Alexa Fluor 594 intensyfikuje znacznik jądrowy i ujawnia wbudowany EdU w mtDNA z czerwonym sygnałem fluorescencyjnym (ryc. 4). Podobną procedurę amplifikacji stosuje się do wizualizacji włączenia BrdU do nowo zsyntetyzowanego mtDNA (ryc. 5), jednak metoda ta wymaga dodatkowego kroku w celu odzyskania epitopu BrdU przez ostry kwas (HCl) lub trawienie enzymatyczne, co nie jest konieczne do znakowania EdU.

Rysunek 1. Reprezentatywne obrazy różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) neuronów embrionalnych (po lewej) i dorosłych (po prawej) neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG), które są zwykle używane do analizy. Pręty = 10 μm.

Rysunek 2. Schemat ideowy przedstawiający procedurę znakowania EdU w mtDNA sygnałem zielonej fluorescencji. Schemat przedstawia trzyetapowy protokół znakowania EdU w mtDNA zielonym sygnałem fluorescencyjnym. Mitotycznie aktywne komórki nerwiaka zarodkowego F11 służą jako kontrola pozytywna i ilustrują wzorzec znakowania EdU, który został włączony do jądrowego i mitochondrialnego DNA. Pierwszym krokiem (P1) jest włączenie analogu tymidyny do nowo zsyntetyzowanego mtDNA poprzez inkubację komórek w obecności EdU. Drugi krok (P2) opiera się na chemii kliknięć w celu oznaczenia włączonego EdU za pomocą Oregon Green-azide. Zielony sygnał jest widoczny w jądrach komórek, które replikowały swoje jądrowe DNA. Ostatnim krokiem (P3) jest wzmocnienie sygnału Oregon Green-azide poprzez inkubację z przeciwciałem królika sprzężonym z HRP przeciwko Oregon Green, a następnie inkubację z tyramidem znakowanym Alexa Fluor 488 w obecności nadtlenku wodoru (_H2O2) w celu wizualizacji zielonego sygnału w mtDNA.

Rysunek 3. Znakowanie EdU mtDNA w neuronach zwoju korzenia grzbietowego (DRG). Neurony są inkubowane z EdU, a sygnał jest następnie wzmacniany, aby ujawnić mtDNA, które zawierało EdU. Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne nałożone na światło przechodzące, pokazujące zielone sygnały punktowe amplifikowanego EdU (EdU-OG-TSA, zielony) włączonego do nowo zsyntetyzowanego mtDNA zarówno embrionalnych (A), jak i dorosłych (BD) neuronów DRG. Procedura znakowania EdU pozwala na późniejsze barwienie immunofluorescencyjne markerów neuronalnych, takich jak neurofilament (D, αNF, w kolorze czerwonym). Podziałka = 10 μm.

Rysunek 4. Schemat ideowy przedstawiający procedurę znakowania EdU w mtDNA sygnałem czerwonej fluorescencji. Schemat przedstawia trzyetapowy protokół znakowania EdU w mtDNA za pomocą czerwonego sygnału fluorescencyjnego. Mitotycznie aktywne komórki nerwiaka zarodkowego F11 służą jako kontrola pozytywna i ilustrują wzorzec znakowania EdU, który został włączony do jądrowego i mitochondrialnego DNA. Pierwszym krokiem (P1) jest włączenie analogu tymidyny do nowo zsyntetyzowanego mtDNA poprzez inkubację komórek w obecności EdU. Drugi krok (P2) opiera się na chemii kliknięć w celu oznaczenia włączonego EdU za pomocą Oregon Green-azide. Zielony sygnał jest widoczny w jądrach komórek, które replikowały swoje jądrowe DNA. Ostatnim krokiem (P3) jest wzmocnienie sygnału azydku Oregon Green-azide poprzez inkubację z przeciwciałem królika sprzężonym z HRP przeciwko Oregon Green, a następnie inkubację z tyramidem znakowanym Alexa Fluor 594 w obecności nadtlenku wodoru (_H2O2) w celu wizualizacji czerwonego sygnału w mtDNA.

Rysunek 5. Znakowanie BrdU i wzmocnienie sygnału tyramidu zielonym lub czerwonym sygnałem fluorescencyjnym w mtDNA. Schemat ideowy przedstawia procedurę znakowania BrdU w nowo zsyntetyzowanym mtDNA za pomocą zielonego lub czerwonego sygnału fluorescencyjnego. Wymagany jest początkowy etap odzyskania epitopu BrdU poprzez trawienie kwasem (HCl) lub enzymem, co nie jest konieczne do znakowania EdU. Następnym krokiem jest inkubacja z mysim pierwszorzędowym przeciwciałem anty-BrdU. Następnie następuje inkubacja z kozim przeciwciałem anty-mysim sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP). Na koniec sygnał jest wzmacniany zielonym lub czerwonym fluorescencyjnie znakowanym tyramidem w obecności nadtlenku wodoru (_H2O2) w celu wizualizacji sygnału w mtDNA.

Discussion

Opracowaliśmy czuły test do znakowania nowo zsyntetyzowanego mtDNA w poszczególnych komórkach za pomocą tyramidowej amplifikacji sygnału EdU. Jednym z największych problemów podczas optymalizacji tego protokołu były niespójne wyniki między szkiełkami nakrywkowymi. Wprowadzono zmiany w protokołach zestawu Invitrogen, aby uniknąć mieszania małych objętości na poszczególnych szkiełkach nakrywkowych i stworzyć roztwory wzorcowe do stosowania dla wszystkich szkiełek nakrywkowych. 75-80 μl używane na każde okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm to idealna objętość, aby całkowicie pokryć powierzchnię, zapewniając jednocześnie wystarczającą ilość roztworu, aby uzyskać spójne wyniki między próbkami. Czas inkubacji i stężenia odczynników zostały zoptymalizowane, ale po ich dostosowaniu można zauważyć poprawę.

Protokół jest przeznaczony do jednokrotnego uruchomienia każdego procesu. Jednak niektóre kroki zostały powtórzone z nowymi rozwiązaniami w celu odzyskania próbek, które nie powiodły się po pierwszej próbie. W szczególności etapy reakcji kliknięcia EdU (3.4-3.6) zostały powtórzone bez znaczącego wzrostu fluorescencji tła. Etapy inkubacji przeciwciała anty-Oregon Green-HRP (4,1-4,3) i amplifikacji tyramidu (4,4-4,5) również zostały powtórzone, ale częściej skutkują słabym stosunkiem sygnału do szumu z powodu zwiększonej fluorescencji tła.

Najbardziej czułymi odczynnikami są dodatek buforowy Click-iT EdU (składnik G) oraz królicze przeciwciało anty-Oregon Green-HRP (składnik I) z zestawu do oznaczania mikropłytek Click-iT EdU. Dodatek buforowy Click-iT EdU stopniowo żółknie z czasem, gdy jest przechowywany w temperaturze 4°C i od 6 do 12 miesięcy, znacznie ciemnieje. Przechowywanie dodatku buforowego Click-iT EdU w temperaturze -20°C złagodzi ten problem. Etapy znakowania i amplifikacji tyramidu działają najlepiej, gdy królicze przeciwciało anty-Oregon Green-HRP zostanie użyte w ciągu 4-6 miesięcy od odtworzenia go w MilliQ dH₂O.

Łagodne znakowanie EdU w mtDNA pozwala na bezpośrednie porównania z dodatkowymi markerami komórkowymi^9-11 i zwiększa użyteczność tej techniki w porównaniu z innymi analogami tymidyny, takimi jak 5-bromo-2-deoksyurydyna (BrdU), która wymaga surowego leczenia w celu odzyskania epitopu w DNA. Nasze laboratorium^11-12 i inne^13-15 z powodzeniem wykorzystały BrdU do znakowania mtDNA. Technika znakowania BrdU jest podobna do tej stosowanej w przypadku EdU, ale ma kilka istotnych różnic (ryc. 5). Po wyżej wymienionym etapie przepuszczalności (3.1-3.2), epitop BrdU jest odzyskiwany za pomocą etapu denaturacji (2 N HCl przez 30 min w temperaturze 37 °C, a następnie trzy płukania w 1X PBS). BrdU jest następnie znakowany pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko BrdU (Vector Laboratories rozcieńczone w stosunku 1:50 w 1% roztworze blokującym z zestawu TSA i inkubowane przez noc w temperaturze 4°C). Drugi etap przeciwciała jest potrzebny do wzmocnienia sygnału BrdU (kozia anty-mysia IgG sprzężona z HRP z zestawów TSA #2 i #5, rozcieńczona w stosunku 1:100 w 1% roztworze blokującym i inkubowana przez 45 minut w temperaturze pokojowej) przed etapami TSA (4,3-4,5 powyżej). Posiadanie dwóch analogów tymidyny, EdU i BrdU, do znakowania mtDNA jest korzystne do przeprowadzania eksperymentów z podwójną etykietą, w których mtDNA może być sekwencyjnie znakowane w paradygmatach znakowania impulsowego¹¹.

Nasze laboratorium wykorzystuje znakowanie mtDNA EdU i BrdU do badania regulacji biogenezy mitochondriów w kontekście neuropatii cukrzycowej, częstego powikłania cukrzycy. Z powodzeniem wykorzystaliśmy wzmocnienie sygnału do pomiaru zmian w biogenezie mtDNA w poszczególnych neuronach^11-12. Technika ta będzie przydatna w innych eksperymentach mających na celu zbadanie mechanizmów replikacji i obrotu mtDNA lub identyfikację leków hamujących syntezę mtDNA. Ponadto podstawowe zasady wzmacniania sygnałów EdU i BrdU mogą być stosowane w innych badaniach, które mierzą replikację lub naprawę DNA.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Szkiełka nakrywkowe 12 mm	Fisher Scientific	12-545-82
245 mm x 245 mm Naczynie do testów biologicznych	Corning	431111
Parafilm M	Fisher Scientific	PM-996
paraformaldehye	Sigma-Aldrich	P6148
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T-8532
Roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami 10X	Fisher Scientific	BP399
Pipet transferowy	Fisher Scientific	13-711-7M
Nadtlenek wodoru, 30% w wodzie	Fisher Scientific	BP2633
Zestaw do oznaczania mikropłytek Click-iT EdU Zestaw do oznaczania mikropłytek	Invitrogen	C10214
TSA #12, z HRP— kozia anty-królicza IgG i tyramid Alexa Fluor 488	Invitrogen	T20922
TSA Kit #15, z HRP– kozia anty-królicza IgG i tyramid Alexa Fluor 594	Invitrogen	T20925
ProLong Gold odczynnik zapobiegający blaknięciu z DAPI	Invitrogen	P-36931
Poliklonalne przeciwciało neurofilamentowe królika	Chemicon International	AB1981
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-BrdU	Vector Laboratories	VP-B209
Zestaw TSA #2, z HRP— kozia anty-mysia IgG i Alexa Fluor 488 tyramide	Invitrogen	T20912
TSA Kit #5, z HRP— koza anty-mysie IgG i Alexa Fluor 594 tyramid	Invitrogen	T20915