Opracowaliśmy czułą technikę znakowania nowo syntetyzowanego mitochondrialnego DNA (mtDNA) w pojedynczych komórkach w celu zbadania biogenezy mtDNA. Technika ta łączy wbudowywanie EdU z protokołem tyramidowej amplifikacji sygnału (TSA), aby zwizualizować replikację mtDNA w obrębie przedziałów subkomórkowych neuronów.
Artykuł metodologiczny
Wizualizacja replikacji mitochondrialnego DNA w pojedynczych komórkach poprzez amplifikację sygnału EdU
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mitochondria są kluczowymi regulatorami energii komórkowej, a biogeneza mitochondriów stanowi niezbędny element regulacji ich liczby w zdrowych komórkach1-3. Jednym z podejść do monitorowania biogenezy mitochondriów jest pomiar szybkości replikacji mitochondrialnego DNA (mtDNA)4. Opracowaliśmy czułą technikę znakowania nowo syntetyzowanego mtDNA w poszczególnych komórkach w celu badania biogenezy mtDNA. Technika ta łączy wbudowywanie 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU)5-7 z protokołem wzmocnienia sygnału tyramidą (TSA)8, aby zwizualizować replikację mtDNA w przedziałach subkomórkowych neuronów. EdU jest lepsza od innych analogów tymidyny, takich jak 5-bromo-2-deoksyurydyna (BrdU), ponieważ wstępna reakcja typu click służąca do znakowania EdU5-7 nie wymaga drastycznych zabiegów kwasowych ani trawienia enzymatycznego, które są niezbędne do odsłonięcia epitopu BrdU. Łagodniejsze znakowanie EdU umożliwia bezpośrednie porównanie jej wbudowywania z innymi markerami komórkowymi9-10. Możliwość wizualizacji i kwantyfikacji biogenezy mtDNA dostarcza niezbędnego narzędzia do badania mechanizmów regulujących biogenezę mitochondriów i pozwala na uzyskanie wglądu w patogenezę związaną z toksycznością leków, starzeniem się, nowotworami oraz chorobami neurodegeneracyjnymi. Nasza technika ma zastosowanie w neuronach sensorycznych, jak i w innych typach komórek. Wykorzystanie tej metody do pomiaru biogenezy mtDNA ma istotne znaczenie dla pogłębienia zrozumienia zarówno prawidłowej fizjologii komórkowej, jak i zaburzeń w stanach chorobowych.
Protokół
1. Przygotowanie neuronów
- Neurony zwojów korzeni grzbietowych (DRG) hoduje się na sterylnych (autoklawowanych) szklanych szkiełkach nakrywkowych o średnicy 12 mm w 24-dołkowej płytce hodowlanej.
- Zatężony roztwór EdU 10 mM (w DMSO, zestaw Click-iT EdU Microplate Assay Kit) rozcieńcza się zazwyczaj 1:10 w medium hodowlanym, aby przygotować 10-kroć (10X) roztworu EdU (10 μM), a następnie rozcieńcza się go 1:10 w dołkach hodowlanych (np. 30 μL roztworu 10X EdU do łącznie 30 μL medium hodowlanego). Neurony DRG inkubuje się z końcowym stężeniem 10 μM EdU w temperaturze 37°C i przy 5% CO2 przez okres od 2 do 24 godzin. Czas inkubacji zależy od tego, jak traktowanie wpływa na tempo syntezy mtDNA.
- W dygestorium neurony DRG utrwala się w 2% paraformaldehydzie przez 10-15 min w temperaturze pokojowej, płucze dwukrotnie w 1X PBS (każde płukanie trwa 2-5 minut) i przechowuje w świeżym 1X PBS przez maksymalnie 1 miesiąc w temperaturze 4°C.
- Szkiełka nakrywkowe przenosi się pęsetą z cienkimi końcówkami do przygotowanej komory wilgotnej (szalka Corning BioAssay z czarnym papierem na dnie dla zwiększenia kontrastu, owinięta folią aluminiową w celu ochrony komponentów światłoczułych i nawilżona wodą za pomocą chusteczek Kimwipes) i kładzie na arkuszu Parafilm M, który zapewnia hydrofobową powierzchnię ograniczającą roztwory do obszaru szkiełka. Poniższy protokół jest opracowany dla 28 szkiełek nakrywkowych, a roztwory przygotowuje się dla 32 szkiełek (około 14% nadmiaru objętości). W przypadku roztworów zawierających drogie lub ograniczone komponenty, na każde szkiełko nanosi się 75-80 μL. W pozostałych przypadkach do roztworów płuczących i blokujących stosuje się 20-30 μL, aby dokładnie wypłukać poprzednie odczynniki.
- Ponownie nanosi się 1X PBS, aby pokryć powierzchnię każdego szkiełka nakrywkowego (200-30 μL). Należy przygotować zestaw do testu Click-iT oraz zestawy do tyramidowej amplifikacji sygnału zgodnie z poniższym opisem oraz instrukcjami producenta.
Przygotowanie zestawu do analizy mikropłytkowej Click-iT EdU
Większość komponentów zestawu Click-iT EdU Microplate Assay Kit jest przygotowana i przechowywana w temperaturze 4°C [2x Click-iT Reaction Buffer (10x Component E), CuSO4 (10 mM, Component F), Click-iT EdU fixative (Component D) oraz Blocking Buffer (2x Component H)]. Click-iT EdU Buffer Additive (10x Component G) przechowuje się w temperaturze -20°C, aby zapobiec jego żółto-brązowemu przebarwieniu z upływem czasu. Komponent ten jest odporny na wielokrotne cykle zamrażania i rozmrażania.
Oregon Green 48 azide (Component B) należy podzielić na małe alikwoty (10-20 μL), aby zminimalizować liczbę cykli zamrażania i rozmrażania, i przechowywać w temperaturze -20°C.
Aby przygotować roztwór zapasowy koniugatu anti-Oregon Green HRP (Komponent I), należy dodać 75 μL wody Milli Q dH2O do fiolki. Wymieszać delikatnie za pomocą pipety lub poprzez odwracanie fiolki, aby uniknąć spienienia, a następnie przechowywać w temperaturze 4°C. Nie mieszać w wirówce typu vortex.
Przygotowanie zestawu TSA nr 12 z HRP Goat Anti-Rabbit IgG oraz zestawem Alexa Fluor 48 Tyramide
Aby przygotować roztwór zapasowy tyramidu, rozpuścić materiał w postaci stałej (Alexa Fluor 48 tyramide, Component A) w 150 μL DMSO (Component B). Kilkukrotnie odwrócić fiolkę, aby rozpuścić tyramid osadzony na jej ściankach. Roztwór zapasowy przechowywać w małych alikwotach (10-20 μL) w temperaturze ≤-20°C, w warunkach suchych i chroniąc przed światłem.
2. Oznakowanie Click-iT 5-etynylo-2-deoksyurydyną (EdU)
UWAGA: Wszystkie roztwory są usuwane za pomocą pipety transferowej z gruszką z dołączonym końcówką 200 μL, aby delikatnie usuwać ciecze bez utraty komórek. Należy unikać używania linii próżniowej, która zazwyczaj usuwa roztwory zbyt gwałtownie. Pipeta z gruszką służy do delikatnego zalewania szkiełek nakrywkowych 20-30 μL roztworów płuczących w celu dokładnego wypłukania poprzedniego roztworu.
- Komórki poddaje się permeabilizacji przy użyciu 0,1% roztworu Triton-X-10 w 1X PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej w przykrytej komorze wilgotnościowej. Należy zastosować roztwór stokowy 1% Triton-X-10.
- Wykonaj 3000 μL 0,1% Triton-X-10 poprzez dodanie 300 μL stężenie robocze 1% Triton-X-10 2700μL 1X PBS.
- Użyj 75-80 μL na jedną szkiełko nakrywkę.
- Usunąć roztwór Triton X-10 i przemyć dwukrotnie 1X PBS.
- Aktywność endogennej peroksydazy jest hamowana przez 1% H2O22O2 w 1X roztworze PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć 30% H2O2 roztwór z 1X PBS. Roztwór ten należy przygotować bezpośrednio przed użyciem, można to jednak zrobić podczas powyższego 10-minutowego etapu permeabilizacji (krok 3.1).
- Przygotuj 3000 μL z 1% H2O2 poprzez dodanie 100 μL 30% H2O22O2 do 2900 μL 1X PBS.
- Użyj 75-80 μL na szkiełko nakrywkę.
- Usunąć roztwór peroksydazy i przepłukać dwukrotnie 1X PBS.
- Reakcja Click-iT EdU
- Dla 32 szkiełek nakrywkowych (32 x 80 μL = 2560 μL) łącznie 2560 μL jest wymagany. Reakcję 2x przygotowuje się w 1280 μL, co stanowi połowę całkowitej objętości reakcji.
- Przygotuj świeży koktajl reakcyjny Click-iT przed rozpoczęciem 5-minutowej utrwalania po fiksacji (krok 3.5 poniżej).
- Wymieszaj koktajl, pipetując go w górę i w dół. Podczas przygotowywania tej reakcji nie używaj wstrząsarki vortex.
2 x koktajl reakcyjny
Komponenty pochodzą z zestawu Click-iT EdU Microplate Assay KitPołowa objętości: 1280 μL woda Milli-Q dH2O 1132.8 μL 2x Bufor reakcyjny Click-iT (10x Komponent E) 100.3 μL Dodatek do buforu Click-iT EdU (komponent G 10x) 25.6 μL CuSO₄4 (10 mM, Składnik F) 25.6 μL Azyd Oregon Green (Komponent A) 6.4 μL Suma 1290.7 μL
UWAGA: Objętości użyte powyżej są proporcjonalne do objętości wymienionych w instrukcji zestawu Click-iT EdU Microplate Assay. Końcowa objętość koktajlu reakcyjnego jest nieco większa niż 1280 μL. - Przed użyciem roztwór 2X Click-iT rozcieńcza się równą objętością utrwalacza Click-iT EdU (Komponent D). Po wymieszaniu otrzymuje się jednorodny roztwór reakcyjny dla wszystkich szkiełek podstawowych.
- Dodaj 1290.7 μL utrwalacz Click-iT EdU (Komponent D) do 1290.7 μL mieszanina reakcyjna. Użyć 75-80 μL na lamellkę.
- Utrwal neurony poeksperymentalnie za pomocą utrwalacza Click-iT EdU (komponent D) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Usunąć utrwalacz i dodać koktajl reakcyjny przygotowany powyżej (krok 3.4). Przykryć w celu ochrony przed światłem i inkubować przez 25 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie usunąć koktajl reakcyjny. Przemyć dwukrotnie rozcieńczonym 1X buforem blokującym (2X Component H).
- Wykonaj 5200 μL buforu blokującego 1X poprzez rozcieńczenie 2600 μL Bufor blokujący (2x Komponent H) z równą objętością wody Milli-Q d H2O (2600 μL). Użyj 75-80 μL na szkiełko nakrywkę.
- Pod mikroskopem epi-fluorescencyjnym należy sprawdzić obecność barwienia Oregon Green w jądrach komórek kontrolnych aktywnych mitotycznie.
3. Wzmocnienie sygnału tyramidowego (TSA) dla sygnału EdU
- Do każdego szkiełka nakraplającego dodać 1% roztwór blokujący TSA i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Przygotować 600 μL 1% roztworu blokującego TSA, odważając 0,06 g odczynnika blokującego TSA (TSA kit #12, Component D) i dodając go do 60 μL 1X PBS. Wymieszać za pomocą wortexa. Dodatek 5% surowicy koziej do 1% roztworu blokującego TSA często pomaga zmniejszyć nieswoiste wiązanie.
- Krótko odwirować stock przeciwciała sprzężonego z peroksydazą chrzanową przeciwko Oregon Green (Component I z zestawu Click-iT EdU Microplate Assay), przygotowany od 2 do 24 godzin przed reakcją TSA. Przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczyć 1:30 w 1% roztworze blokującym TSA i wymieszać, delikatnie odwracając probówkę lub pipetując w górę i w dół. Nie używać wortexa, aby nie uszkodzić przeciwciała sprzężonego z HRP. Usunąć 1% roztwór blokujący TSA, dodać 75 μL roztworu przeciwciał do każdego szkiełka nakraplającego i inkubować przez noc w temperaturze 4°C.
- Przeciwciało można stosować w większym stężeniu, np. 1:150, ale jest ono dostarczane w ograniczonej ilości, dlatego należy go używać oszczędnie. Ponownie: dodatek 5% surowicy koziej do 1% roztworu blokującego TSA często pomaga zmniejszyć nieswoiste wiązanie przeciwciała sprzężonego z peroksydazą chrzanową przeciwko Oregon Green.
- Przygotować 2560 μL roztworu przeciwciał w rozcieńczeniu 1:300, dodając 8,53 μL stocku Rabbit anti-Oregon Green-HRP (Click-iT EdU Microplate Assay) do 2560 μL 1% roztworu blokującego TSA. Wymieszać poprzez delikatne pipetowanie lub odwracanie probówki.
- Następnego dnia usunąć roztwór przeciwciał i trzykrotnie wypłukać 1X PBS. Inkubować szkiełka nakraplające w ostatnim płukaniu przez dodatkowe 30-60 minut w temperaturze pokojowej, aby zapewnić usunięcie niezwiązanego przeciwciała pierwszorzędowego.
- Przygotować mieszaninę do reakcji tyramidowej dla objętości 2560 μL (32 szkiełka nakraplające x 80 μL).
- Przygotować 400 μL 0,15% roztworu H2O2 (100X), dodając 2 μL 30% H2O2 (TSA kit #12, Component F) do 398 μL buforu do amplifikacji (TSA kit #12, Component E). Należy to przygotować bezpośrednio przed użyciem.
- Aby uzyskać objętość końcową 2560 μL, połączyć:
- 25,6 μL Tyramide-48 (TSA kit Component A)
- 2508,8 μL buforu do amplifikacji (TSA kit Component E)
- 25,6 μL 0,15% H2O2 (z powyższego roztworu, aby uzyskać końcowe stężenie 0,015% H2O2)
- Usunąć 1X PBS i inkubować z mieszaniną do reakcji tyramidowej przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
- Usunąć mieszaninę do reakcji tyramidowej i trzykrotnie wypłukać 1X PBS, inkubując w ostatnim płukaniu przez 30-60 minut w temperaturze pokojowej, jak wcześniej.
- Sprawdzić znakowanie mtDNA pod mikroskopem epifluorescencyjnym.
- Zamontować szkiełka nakraplające na szklanych preparatach mikroskopowych przy użyciu medium montującego przeciwko zanikaniu fluorescencji, np. ProLong Gold z DAPI. Alternatywnie, po znakowaniu EdU i amplifikacji można przeprowadzić standardową immunocytochemię fluorescencyjną w celu znakowania innych markerów komórkowych.
4. Reprezentatywne wyniki: Wizualizacja replikacji mitochondrialnego DNA jako markeru biogenezy mitochondriów
Interesuje nas, w jaki sposób neurony sensoryczne (Rysunek 1) regulują liczbę mitochondriów. Niniejszy protokół opisuje znakowanie nowo syntetyzowanego mtDNA markerem fluorescencyjnym jako metodę pomiaru nowych mitochondriów. Inkorporacja syntetycznego nukleotydu EdU, a następnie zastosowanie chemii klikowej z użyciem Oregon Green-azide oraz późniejsza amplifikacja tyramidą Alexa-Fluor 48 prowadzi do oznakowania mtDNA zielonym sygnałem fluorescencyjnym (Rysunek 2). Przy prawidłowym wykonaniu amplifikowany sygnał zielony jest wystarczająco silniejszy od fluorescencji tła (takiej jak autofluorescencja komórkowa lub efekt uboczny reakcji HRP-TSA).
Niniejsza technika została opracowana w celu znakowania nowo zreplikowanego mtDNA, aby umożliwić wizualizację i kwantyfikację biogenezy mtDNA w przedziałach subkomórkowych neuronów (Rysunek 3). Znakowanie EdU pozwala na przeprowadzenie następującej fluorescencyjnej immunocytochemii w celu znakowania innych markerów komórkowych, takich jak neurofilament (Rysunek 3D).
Reakcję TSA można przeprowadzić również z użyciem innych fluorescencyjnych tyramidów Alexa Fluor, takich jak Alexa Fluor 594-tyramide. Skutkuje to uzyskaniem zielonego fluorescencyjnego sygnału jądrowego w wyniku reakcji click z Oregon Green-azide w jądrze komórkowym, przy jednoczesnym braku sygnału zielonego w mtDNA, które jest niewykrywalne przed zastosowaniem TSA. Amplifikacja z użyciem Alexa Fluor 594-tyramide intensyfikuje znakowanie jądrowe i ujawnia wbudowany EdU w mtDNA za pomocą czerwonego sygnału fluorescencyjnego (Rycina 4). Podobna procedura amplifikacji jest stosowana do wizualizacji wbudowywania BrdU w nowo syntetyzowane mtDNA (Rycina 5), jednak metoda ta wymaga dodatkowego etapu odzyskiwania epitopu BrdU poprzez działanie silnego kwasu (HCl) lub trawienie enzymatyczne, co nie jest konieczne w przypadku znakowania EdU.
Rycina 1. Reprezentatywne obrazy z mikroskopii kontrastowej interferencyjnej różnicowej (DIC) neuronów z zwojów korzeni grzbietowych (DRG) embrionalnych (po lewej) i dorosłych (po prawej), zazwyczaj wykorzystywane do analizy. Słupki = 10 μm.
Rycina 2. Schemat przedstawiający procedurę znakowania EdU w mtDNA sygnałem zielonej fluorescencji. Schemat przedstawia trzyetapowy protokół znakowania EdU w mtDNA sygnałem zielonej fluorescencji. Mitotycznie aktywne komórki neuroblastoma F1 służą jako kontrola pozytywna i ilustrują wzór znakowania EdU włączonego do DNA jądrowego i mitochondrialnego. Pierwszym krokiem (P1) jest włączenie analogu tymidyny do nowo syntetyzowanego mtDNA poprzez inkubację komórek w obecności EdU. Drugi krok (P2) opiera się na chemii klik i polega na znakowaniu włączonego EdU za pomocą azydku Oregon Green. Zielony sygnał jest widoczny w jądrach komórek, które zreplikowały swoje DNA jądrowe. Ostatnim krokiem (P3) jest wzmocnienie sygnału azydku Oregon Green poprzez inkubację z koniugowaną z HRP przeciwciałem króliczym przeciwko Oregon Green, a następnie inkubację z tyramidą znakowaną Alexa Fluor 48 w obecności nadtlenku wodoru (H2O2).2O2) w celu wizualizacji sygnału zielonego w mtDNA.
Rycina 3. Oznakowanie EdU mtDNA w neuronach zwojów korzeni grzbietowych (DRG). Neurony inkubuje się z EdU, a następnie sygnał jest wzmacniany w celu uwidocznienia mtDNA, które włączyło EdU. Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne nałożone na obraz w świetle przechodzącym, przedstawiające zielone punktowe sygnały wzmocnionego EdU (EdU-OG-TSA, kolor zielony) włączonego do nowo syntetyzowanego mtDNA zarówno w embrionalnych (A), jak i dorosłych (B-D) neuronach zwojów korzeni grzbietowych (DRG). Procedura znakowania EdU umożliwia późniejsze barwienie immunofluorescencyjne markerów neuronalnych, takich jak neurofilament (D, αNF, kolor czerwony). Paski skali = 10 μm.
Rysunek 4. Schemat przedstawiający procedurę znakowania EdU w mtDNA sygnałem czerwonej fluorescencji. Schemat przedstawia trzystopniowy protokół znakowania EdU w mtDNA sygnałem czerwonej fluorescencji. Mitotycznie aktywne komórki neuroblastoma F1 służą jako kontrola pozytywna i obrazują wzór znakowania EdU wbudowanego w DNA jądrowe i mitochondrialne. Pierwszym krokiem (P1) jest wbudowanie analogu tymidyny w nowo syntetyzowane mtDNA poprzez inkubację komórek w obecności EdU. Drugi krok (P2) opiera się na chemii klik, aby oznakować wbudowane EdU za pomocą Oregon Green-azydy. Zielony sygnał jest widoczny w jądrach komórek, które zreplikowały swoje DNA jądrowe. Ostatnim krokiem (P3) jest wzmocnienie sygnału Oregon Green-azydy poprzez inkubację z przeciwciałem króliczym przeciwko Oregon Green sprzężonym z HRP, a następnie inkubację z tyramidą znakowaną Alexa Fluor 594 w obecności nadtlenku wodoru (H2O2).2O2) w celu wizualizacji czerwonego sygnału w mtDNA.
Rysunek 5. Markowanie BrdU i amplifikacja sygnału tyramidowego z zielonym lub czerwonym sygnałem fluorescencyjnym w mtDNA. Schemat przedstawia procedurę znakowania BrdU w nowo syntetyzowanym mtDNA za pomocą zielonego lub czerwonego sygnału fluorescencyjnego. Wymagany jest etap wstępny w celu odsłonięcia epitopu BrdU poprzez trawienie kwasem (HCl) lub enzymatyczne, co nie jest konieczne w przypadku znakowania EdU. Kolejnym krokiem jest inkubacja z mysim przeciwciałem pierwszorzędowym anty-BrdU. Następnie przeprowadza się inkubację z kozim przeciwciałem anty-mysim sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP). Na koniec sygnał jest wzmacniany za pomocą tyramidu znakowanego zieloną lub czerwoną fluorescencją w obecności nadtlenku wodoru (H2O2) w celu wizualizacji sygnału w mtDNA.
Dyskusja
Opracowaliśmy czuły test do znakowania nowo syntetyzowanego mtDNA w pojedynczych komórkach, wykorzystując wzmocnienie sygnału tyramidą dla EdU. Jednym z największych problemów podczas optymalizacji tego protokołu były niespójne wyniki pomiędzy poszczególnymi szkiełkami cover-slip. Wprowadzono zmiany w protokołach zestawu Invitrogen, aby uniknąć mieszania małych objętości bezpośrednio na szkiełkach i zamiast tego przygotowywać roztwory główne do zastosowania dla wszystkich próbek. Objętość 75-80 μL użyta dla każdego okrągłego szklanego cover-slip o średnicy 12 mm jest objętością idealną, aby całkowicie pokryć powierzchnię, zapewniając jednocześnie wystarczającą ilość roztworu dla uzyskania spójnych wyników między próbkami. Czas inkubacji oraz stężenia odczynników zostały zoptymalizowane, jednak możliwe są dalsze ulepszenia poprzez ich dodatnią korektę.
Protokół został opracowany tak, aby każdy proces przeprowadzić jednorazowo. Niemniej jednak niektóre kroki powtórzono z użyciem nowych roztworów w celu odzyskania próbek, które nie powiodły się przy pierwszej próbie. W szczególności kroki reakcji klikowej EdU (3.4-3.6) powtórzono bez znaczącego wzrostu fluorescencji tła. Kroki inkubacji przeciwciała anty-Oregon Green-HRP (4.1-4.3) oraz amplifikacji tyramidowej (4.4-4.5) również zostały powtórzone, jednak częściej skutkowało to słabym stosunkiem sygnału do szumu z powodu zwiększonej fluorescencji tła.
Najbardziej wrażliwymi odczynnikami są dodatek do buforu Click-iT EdU (Komponent G) oraz przeciwciało królicze anty-Oregon Green-HRP (Komponent I) z zestawu Click-iT EdU Microplate Assay. Dodatek do buforu Click-iT EdU z czasem stopniowo żółknie podczas przechowywania w temperaturze 4°C, a w okresie od 6 do 12 miesięcy znacznie ciemnieje. Przechowywanie dodatku do buforu Click-iT EdU w temperaturze -20°C pozwoli rozwiązać ten problem. Etapy znakowania i amplifikacji tyramidowej przebiegają najskuteczniej, gdy przeciwciało królicze anty-Oregon Green-HRP zostanie wykorzystane w ciągu 4-6 miesięcy od jego reconstitution w MilliQ dH2O.
Łagodne znakowanie EdU w mtDNA umożliwia bezpośrednie porównania z dodatkowymi markerami komórkowymi9-11 i zwiększa użyteczność tej techniki w stosunku do innych analogów tymidyny, takich jak 5-bromo-2-deoksyurydyna (BrdU), która wymaga drastycznej obróbki w celu odsłonięcia epitopu w obrębie DNA. Nasze laboratorium11-12 oraz inne ośrodki13-15 z sukcesem wykorzystywały BrdU do znakowania mtDNA. Technika znakowania BrdU jest podobna do tej stosowanej dla EdU, lecz wykazuje pewne istotne różnice (Rycina 5). Po etapie permeabilizacji opisanym powyżej (3.1-3.2), epitop BrdU jest odzyskiwany poprzez etap denaturacji (2 N HCl przez 30 min w 37°C, a następnie trzy przemycia w 1X PBS). Następnie BrdU jest znakowane przeciwciałem pierwszorzędowym przeciwko BrdU (Vector Laboratories, rozcieńczonym 1:50 w 1% roztworze blokującym z zestawu TSA i inkubowanym przez noc w 4°C). Przed etapami TSA (powyższe 4.3-4.5) konieczny jest etap z przeciwciałem wtórnym w celu wzmocnienia sygnału BrdU (kozia anty-mysia IgG sprzężona z HRP z zestawów TSA nr 2 i nr 5, rozcieńczona 1:100 w 1% roztworze blokującym i inkubowana przez 45 min w temperaturze pokojowej). Posiadanie dwóch analogów tymidyny, EdU i BrdU, do znakowania mtDNA jest korzystne przy przeprowadzaniu eksperymentów z podwójnym znakowaniem, w których mtDNA może być znakowane sekwencyjnie w paradygmatach znakowania pulsacyjnego11.
Nasze laboratorium wykorzystuje znakowanie mtDNA za pomocą EdU i BrdU do badania regulacji biogenezy mitochondriów w kontekście neuropatii cukrzycowej, częstego powikłania cukrzycy. Z sukcesem zastosowaliśmy wzmocnienie sygnału do pomiaru zmian w biogenezie mtDNA w pojedynczych neuronach11-12. Technika ta będzie użyteczna w innych eksperymentach mających na celu zbadanie mechanizmów replikacji i wymiany mtDNA lub w identyfikacji leków hamujących syntezę mtDNA. Ponadto podstawowe zasady wzmacniania sygnałów EdU i BrdU można zastosować w innych badaniach mierzących replikację lub naprawę DNA.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez granty National Institutes of Health NS-38849 i DK-076160, Juvenile Diabetes Research Foundation Center for the Study of Complications in Diabetes, Program for Neurology Research and Discovery oraz The A. Alfred Taubman Medical Research Institute na University of Michigan. W pracy wykorzystano Morphology and Image Analysis Core w Michigan Diabetes Research and Training Center, finansowane z grantu National Institutes of Health 5P60 DK-20572 przyznanego przez National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases. Autorzy dziękują Scottowi T. Clarke'owi z Molecular Probes/Invitrogen za cenne rady dotyczące różnych zestawów do znakowania Click-iT EdU oraz za hojną darowiznę odczynników, które wsparły wstępny rozwój techniki amplifikacji EdU.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| laseczki 12 mm | Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| szalka BioAssay 245 mm x 245 mm | Corning | 431111 | |
| Parafilm M | Fisher Scientific | PM-996 | |
| paraformaldehyd | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-8532 | |
| roztwór fosforanowo-buforowana soli PBS 10X | Fisher Scientific | BP399 | |
| pipeta transferowa | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| nadtlenek wodoru, 30% w wodzie | Fisher Scientific | BP2633 | |
| zestaw Click-iT EdU Microplate Assay Kit | Invitrogen | C10214 | |
| zestaw TSA Kit #12, z HRP—kozim przeciwciałem anty-króliczym IgG i tyramidą Alexa Fluor 488 | Invitrogen | T20922 | |
| zestaw TSA Kit #15, z HRP–kozim przeciwciałem anty-króliczym IgG i tyramidą Alexa Fluor 594 | Invitrogen | T20925 | |
| odczynnik antywyblakający ProLong Gold z DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| poliklonalne królicze przeciwciało przeciwko neurofilamentom | Chemicon International | AB1981 | |
| mysie monoklonalne przeciwciało anty-BrdU | Vector Laboratories | VP-B209 | |
| zestaw TSA Kit #2, z HRP—kozim przeciwciałem anty-mysim IgG i tyramidą Alexa Fluor 488 | Invitrogen | T20912 | |
| zestaw TSA Kit #5, z HRP—kozim przeciwciałem anty-mysim IgG i tyramidą Alexa Fluor 594 | Invitrogen | T20915 |
Bibliografia
- Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 79-99 (2006).
- Dimmer, K. S., Scorrano, L. (De)constructing mitochondria: what for. Physiology (Bethesda). 21, 233-241 (2006).
- Suen, D. F., Norris, K. L., Youle, R. J. Mitochondrial dynamics and apoptosis. Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).
- Clay Montier, L. L., Deng, J. J., Bai, Y. Number matters: control of mammalian mitochondrial DNA copy number. J. Genet. Genomics. 36 (3), 125-131 (2009).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
- Buck, S. B., Bradford, J., Gee, K. R., Agnew, B. J., Clarke, S. T., Salic, A. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44, 927-929 (2008).
- Yu, Y., Arora, A., Min, W., Roifman, C. M., Grunebaum, E. EdU incorporation is an alternative non-radioactive assay to [(3)H]thymidine uptake for in vitro measurement of mice T-cell proliferations. J Immunol Methods. 350 (1-2), 29-35 (2009).
- Heusden, J. V. an, Jong, P. de, Ramaekers, F., Bruwiere, H., Borgers, M., Smets, G. Fluorescein-labeled tyramide strongly enhances the detection of low bromodeoxyuridine incorporation levels. J. Histochem. Cytochem. 45 (2), 315-319 (1997).
- Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining. Cytometry A. 73, 626-636 (2008).
- Kaiser, C. L., Kamien, A. J., Shah, P. A., Chapman, B. J., Cotanche, D. A. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine labeling detects proliferating cells in the regenerating avian cochlea. Laryngoscope. 119, 1770-1775 (2009).
- Lentz, S. I., Edwards, J. L., Backus, C., McLean, L. L., Haines, K. M., Feldman, E. L. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In. Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
- Edwards, J. L., Quattrini, A., Lentz, S. I., Figueroa-Romero, C., Cerri, F., Backus, C., Hong, Y., Feldman, E. L. Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons. Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).
- Davis, A. F., Clayton, D. A. In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells. J. Cell Biol. 135, 883-893 (1996).
- Magnusson, J., Orth, M., Lestienne, P., Taanman, J. W. Replication of mitochondrial DNA occurs throughout the mitochondria of cultured human cells. Exp. Cell. Res. 289, 133-142 (2003).
- Amiri, M., Hollenbeck, P. J. Mitochondrial biogenesis in the axons of vertebrate peripheral neurons. Dev. Neurobiol. 68, 1348-1361 (2008).
Przedruki i uprawnienia
