Wizualizacja embrionalnego układu nerwowego w całych zarodkach Drosophila

Podsumowanie

Opisujemy procedurę przygotowania zarodków Drosophila na różnych etapach rozwoju w celu wizualizacji embrionalnego układu nerwowego podczas embriogenezy.

Streszczenie

Zarodek Drosophila stanowi atrakcyjny model badawczy do analizy komórkowych i molekularnych podstaw rozwoju neuronalnego. W niniejszej pracy opisujemy procedurę wizualizacji embrionalnego układu nerwowego Drosophila z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko białkom neuronalnym. Ponieważ cały obwodowy i ośrodkowy układ nerwowy zarodka są dobrze scharakteryzowane na poziomie pojedynczych komórek (Dambly-Chaudière et al., 1986; Bodmer et al., 1987; Bodmer et al., 1989), wszelkie aberracje w tych układach mogą być łatwo zidentyfikowane przy użyciu przeciwciał przeciwko różnym białkom neuronalnym. Rozwijające się zarodki są zbierane w określonych odstępach czasu, aby zapewnić, że znajdują się one we właściwych stadiach rozwoju do wizualizacji. Po zebraniu, przed utrwaleniem, usuwane są zewnętrzne warstwy zarodka: błona chorionowa oraz otoczka witelinowa otaczająca zarodek. Następnie zarodki są inkubowane z przeciwciałami neuronalnymi i wizualizowane przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał wtórnych. W celu uzyskania dostępu do embrionalnego układu nerwowego wizualizowane są zarodki w stadiach 12-17. W stadium 12 pas zarodkowy OUN zaczyna się skracać, a do stadium 15 zostaje osiągnięty ostateczny wzorzec komisury. W stadium 17 OUN ulega skurczeniu, a OUN jest w pełni rozwinięty (Campos-Ortega et al. 1985). Dzięki temu zmiany w strukturze OUN i OUN mogą być łatwo obserwowane podczas tych stadiów rozwoju.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników

1. Przygotować bufor PEMFA, używając 100mM Pipes, 2mM EGTA oraz 1 mM MgSO₄. Dostosować pH buforu do wartości 7,0. Bufor PEMFA należy wysterylizować przez filtr i przechowywać w temperaturze 4°C.
2. Przygotować PBT, dodając 1ml Triton X-100 do 100ml 1x PBS (buforu fosforanowego) (pH 7,0). Przechowywać w temperaturze 4°C.
3. Przygotować 5% BSA (albuminy surowicy bydlęcej) z 0,01% NaAcide w 1x PBS (pH 7,0).
4. Przygotować roztwór soli fizjologicznej, używając 0,7% NaCl i 0,03% Triton X-100 w wodzie dejonizowanej.
5. Przygotować utrwalacz, łącząc 4 części buforu PEMFA z 1 częścią 37% formaldehydu.

2. Pobieranie zarodków

1. Przygotuj klatkę dla wybranego szczepu Drosophila, umieszczając >100 much w plastikowej butelce z adapterem i płytką z pożywką agarową.
2. Przechowuj klatkę z muchami w ciemności w temperaturze pokojowej przez 72 godziny, wymieniając płytki co 8-12 godzin, aby muchy zaaklimatyzowały się w klatce i nie zatrzymywały jaj.
3. Na potrzeby eksperymentu zbieraj embriony przez 12 godzin. Wyjmij szalkę Petriego z pojemnika i zastąp ją nową. Z wyjętej szalki Petriego zmyj embriony, używając roztworu soli fizjologicznej i czystego pędzla.
4. Zbierz embriony na gęstym sicie. Przepłucz je roztworem soli fizjologicznej, aby usunąć nadmiar drożdży.
5. Używając szpatułki, delikatnie zbierz embriony i umieść je w małej szklanej fiolce z zakrętką. Dodaj około 1ml roztworu soli fizjologicznej.

3. Usuwanie chorionu i błon żółtkowych oraz utrwalanie

1. Po zebraniu embrionów przygotować roztwór Heptane-Fix, łącząc 50% heptanu i 50% utrwalacza. Roztwór będzie składał się z dwóch warstw: heptanu na górze i utrwalacza na dole.
2. W szklanej fiolce przemyć embriony, inkubując je w roztworze soli fizjologicznej przez 5 minut. Nadmiar soli fizjologicznej usunąć za pomocą pipety Pasteura.
3. Opłukać embriony wodą dejonizowaną.
4. Usunąć chorion z embrionów poprzez inkubację w 50% roztworze wybielacza przez 3 minuty.
5. Dokładnie opłukać embriony wodą dejonizowaną.
6. Utrwalić embriony, inkubując je przez 30 minut w roztworze Heptane-Fix przy łagodnym wstrząsaniu.
7. Za pomocą pipety Pasteura zastąpić utrwalacz (warstwa dolna) metanolem, pozostawiając heptan w probówce. Wstrząsać energicznie, aby usunąć błonę witelińską. Odtłuszczone embriony opadną na dno probówki.
8. Przenieść embriony do nowej szklanej fiolki za pomocą pipety Pasteura. Przemyć embriony pięciokrotnie metanolem, inkubując je za każdym razem przez 5 minut.

4. Barwienie przeciwciałami, montowanie i wizualizacja

1. Rehydratyzuj zarodki w mieszaninie 50% roztworu PBT i 50% metanolu przez 5 minut. Następnie rehydratyzuj w 100% roztworze PBT przez 5 minut.
2. Zablokuj miejsca nieswoistego wiązania w zarodkach, inkubując je w 5% BSA z 0,01% roztworem NaAcide przez 1 godzinę w temperaturze 4°C.
3. Zarodki są teraz gotowe do barwienia przeciwciałami. Przygotuj przeciwciało pierwotne, rozcieńczając je do odpowiedniego stężenia w 5% BSA z 0,01% roztworem NaAcide. Stosujemy przeciwciało przeciwko białku cysteinowemu (CSP), białku synaptycznemu pęcherzykowemu, oraz przeciwciało anty-HRP (peroksydaza chrzanowa), które rozpoznaje specyficzną dla neuronów część węglowodanową obecną w glikoproteinach powierzchniowych i znakuje wszystkie neurony.
4. Inkubuj zarodki przez noc w temperaturze 4°C w roztworze przeciwciała pierwotnego.
5. Następnego dnia przemyj zarodki 10 razy roztworem PBT w ciągu jednej godziny.
6. Przygotuj roztwór przeciwciała wtórnego, rozcieńczając je do odpowiedniego stężenia. Stosujemy wtórne przeciwciała Alexa w stężeniu 1:200.
7. Inkubuj zarodki przez dwie godziny w temperaturze 4°C w roztworze przeciwciała wtórnego.
8. Przemyj zarodki 10 razy roztworem PBT w ciągu jednej godziny.
9. Inkubuj zarodki przez noc w medium montażowym Vectashield.
10. Zamocuj zarodki na szkiełku przedmiotowym i zabezpiecz szkiełko nakrywką za pomocą lakieru do paznokci. Wizualizuj zarodki przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego.

5. Reprezentatywne wyniki

CSP

HRP-FITC

Nałożone
Rycina 1: Reprezentatywne obrazy pokazujące embrionalny OUN w stadium 16-17, z użyciem przeciwciał przeciwko CSP (czerwony) i HRP (zielony). Zwróć uwagę na wyraźne barwienie Komisury.

CSP

HRP-FITC

Nałożone (Merged)
Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy przedstawiające embrionalny PNS w stadium 16-17 z użyciem przeciwciał przeciwko CSP (czerwony) i HRP (zielony). Zwróć uwagę na powtarzalne wzorce neuronów obwodowych.

Dyskusja

Zarodek Drosophila stanowi potężny układ do badania zmian komórkowych i molekularnych podczas rozwoju neuronów. W niniejszym protokole zaprezentowaliśmy sposób przygotowania całych zarodków do immunohistochemii. Protokół ten został opracowany na podstawie metody opisanej przez Carrolla i Scotta w 1985 roku. Można go również dostosować do testowania innych przeciwciał przeciwko białkom neuronalnym, jednak wymagana jest optymalizacja tych przeciwciał. Ponadto defekty rozwojowe embrionalnego PNS i CNS można łatwo z...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
37% formaldehyd	Fisher Scientific	BP531-25
CSP	Developmental Studies Hybridoma Bank
HRP-FITC	Jackson ImmunoResearch	323-095-021
Alexa Fluor 568 przeciwciała kozie anty-mysie IgG	Invitrogen	A-11004
Medium montażowe Vectashield	Vector Laboratories	H-1000