In vivo wizualizacja pęcherzyków synaptycznych w aksonach segmentowych larw Drosophila

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje sekcję larw Drosophila in vivo w celu obrazowania ruchu pęcherzyków aksonalnych znakowanych białkiem GFP wzdłuż szyn mikrotubularnych.

Streszczenie

Wyjaśnienie mechanizmów transportu aksonalnego okazało się niezwykle istotne w określaniu, w jaki sposób defekty w transporcie na duże odległości wpływają na różne choroby neurologiczne. Zaburzenia w tym kluczowym procesie mogą mieć szkodliwy wpływ na funkcjonowanie i rozwój neuronów. Opracowaliśmy protokół sekcji, który został zaprojektowany w celu odsłonięciaDrosophilanerwy segmentowe larw, aby obserwować transport aksonalny w czasie rzeczywistym. Protokół ten, służący do obrazowania na żywo, zaadaptowaliśmy na podstawie metody opublikowanej przez Hurda i Saxtona (1996), stosowanej do immunolokalizacji w nerwach segmentowych larw. Staranna dyssekcja oraz odpowiednie warunki buforu są kluczowe dla maksymalizacji czasu przeżycia wypreparowanych larw. Przy prawidłowym wykonaniu, w dyssekowanych larwach obserwowano intensywny transport pęcherzyków przez 2-3 godziny w warunkach fizjologicznych. Stosujemy metodę UAS-GAL4¹do ekspresji APP znakowanego GFP lub pęcherzyków synaptotagminy w obrębie pojedynczego aksonu lub wielu aksonów w nerwach segmentowych larw, wykorzystując różne neuronalne linie GAL4. Przed obserwacją larw można zastosować również inne markery znakowane fluorescencyjnie, na przykład do mitochondriów (MitoTracker) lub lizosomów (LysoTracker). Ruch pęcherzyków GFP oraz ruch cząsteczek można obserwować jednocześnie, korzystając z oddzielnych długości fal.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników

1. Przygotować bufor do sekcji, dodając następujące związki: 128 mM NaCl, 1mM EGTA, 4 mM MgCl₂, 2mM KCl, 5mM HEPES oraz 36 mM sacharozy do 1000 mL, dostosować pH do 7,2 i wysterylizować przez filtrację.

2. Przygotowanie do sekcji

1. Kostka z Siligardu: Żel wycina się do rozmiaru około 1 cala szerokości, 1 cala długości i około 1 cm wysokości. Kostkę żelu umieszcza się na szkiełku przedmiotowym podczas dysekcji. Kostki mogą być używane wielokrotnie.
2. Szpilki: Szpilki używane do dysekcji muszą być wyjątkowo krótkie. W dysekcji najlepiej sprawdzają się ostre końce szpilek typu minutien.
3. Wymagane są jedne ostre sprężynowe nożyczki do mikrodysekcji.
4. Wymagane są dwie pęsety z cienkimi końcówkami.

3. Zbiór larw

1. Wędrujące larwy trzeciego stadium (^3.), wykazujące ekspresję białka pęcherzykowego z tagiem GFP, zbiera się na szalkę Petriego.
2. Larwy płucze się w wodzie dejonizowanej, aby usunąć resztki pokarmu.

4. Żywa sekcja larw

1. Larvę przenosi się do kostki żelu do sekcji na szkiełku przedmiotowym. Larvę zanurza się w buforze do sekcji.
2. Larvę przytwierdza się szpilkami w części przedniej i tylnej, używając dwóch cienkich szpilek, stroną grzbietową do góry.
3. Za pomocą nożyczek do mikrosekcji wykonuje się małe nacięcie w linii środkowej w pobliżu końca tylnego. Od tego nacięcia prowadzi się cięcie w kierunku przednim. Za pomocą dwóch szpilek przytwierdza się rozciętą kutykulę na krawędziach bocznych.
4. Dodaje się kroplę buforu do sekcji. Ostrożnie usuwa się pęcherzyk jelitowy, jelita i ciała tłuszczowe za pomocą pincety. Większość tych tkanek zazwyczaj wypływa podczas cięcia grzbietowego.
5. Bufor zastępuje się świeżym buforem do sekcji. Larwa nigdy nie powinna wyschnąć i musi stale znajdować się w buforze do sekcji.
6. W tym momencie przeprowadza się inkubacje z użyciem markerów in vivo MitoTracker lub LysoTracker, rozcieńczając marker in vivo w buforze do sekcji. Po inkubacji z markerem in vivo preparat sekcyjny larwy płucze się kilkukrotnie (5 szybkich płukań) świeżym buforem do sekcji.
7. Po ostatnim płukaniu szpilki wsuwa się w syligard i natychmiast nakłada szkiełko nakrywkowe. Larva jest teraz gotowa do obserwacji.

5. Obrazowanie na żywo wypreparowanych larw

1. Umieść szkiełko nakrywkowe i żel na stoliku mikroskopu i wykonaj obrazowanie przy użyciu mikroskopu odwróconego.
2. Do obrazowania znakowanych pęcherzyków w nerwach segmentowych larw stosujemy obiektyw 100x. W pierwszej kolejności ocenia się ekspresję GFP w ciałach komórkowych zwoju brzusznego, a następnie obrazuje nerwy segmentowe. Jeśli w ciałach komórkowych zwoju brzusznego zaobserwowano silne barwienie GFP, przystępuje się do obrazowania i oceny nerwów.
3. Dzięki zastosowaniu systemu podwójnego widoku z filtrami dla CFP/YFP lub RFP/YFP oraz oprogramowania do podziału obrazu, możemy jednocześnie obrazować dwa znakowane białka in vivo.

6. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1: Reprezentatywne zdjęcie ukazujące liczne pęcherzyki aksonalne na wielu torach aksonalnych w nerwie segmentowym larwy. Zwróć uwagę na skupiska GFP, reprezentujące akumulacje aksonalne.

Rycina 2: Reprezentatywny obraz przedstawiający pojedynczy tor aksonalny z wieloma pęcherzykami aksonalnymi w obrębie larwalnego nerwu segmentowego.

Dyskusja

In vivo obrazowanie transportu pęcherzyków synaptycznych w nerwach segmentowych larw Drosophila jest potężnym narzędziem do badania mechanizmów transportu aksonalnego. Wcześniej wykorzystaliśmy ten protokół do oceny dynamiki transportu w nerwach larwalnych wykazujących ekspresję rozszerzonych powtórzeń polyQ, aby wyjaśnić, w jaki sposób rozszerzenie powtórzeń wpływa na dynamikę transportu pęcherzyków ³. Stosując ten protokół, prędkość ruchu pęcherzyków można określić poprzez przekształcenie s...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 para nożyczek do mikrodisekcji	Fine Science Tools		Nożyczki sprężynowe – ostrze 6mm, średnica końcówki 0.125 mm
2 pary pęset	Fisher Scientific		Pęsety mikro-Adsona do dyssekcji Fisherbrand z ząbkowaną końcówką
Pudełko szpilek do dyssekcji	Fine Science Tools		Szpilki Minutien o średnicy 0.1mm