In vivo wizualizacja pęcherzyków synaptycznych w aksonach segmentowych larw Drosophila

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje sekcję larw Drosophila in vivo w celu obrazowania ruchu pęcherzyków aksonalnych znakowanych białkiem GFP wzdłuż szyn mikrotubularnych.

Streszczenie

Wyjaśnienie mechanizmów transportu aksonalnego okazało się niezwykle istotne w określaniu, w jaki sposób defekty w transporcie na duże odległości wpływają na różne choroby neurologiczne. Zaburzenia w tym kluczowym procesie mogą mieć szkodliwy wpływ na funkcjonowanie i rozwój neuronów. Opracowaliśmy protokół sekcji, który został zaprojektowany w celu odsłonięciaDrosophilanerwy segmentowe larw, aby obserwować transport aksonalny w czasie rzeczywistym. Protokół ten, służący do obrazowania na żywo, zaadaptowaliśmy na podstawie metody opublikowanej przez Hurda i Saxtona (1996), stosowanej do immunolokalizacji w nerwach segmentowych larw. Staranna dyssekcja oraz odpowiednie warunki buforu są kluczowe dla maksymalizacji czasu przeżycia wypreparowanych larw. Przy prawidłowym wykonaniu, w dyssekowanych larwach obserwowano intensywny transport pęcherzyków przez 2-3 godziny w warunkach fizjologicznych. Stosujemy metodę UAS-GAL4¹do ekspresji APP znakowanego GFP lub pęcherzyków synaptotagminy w obrębie pojedynczego aksonu lub wielu aksonów w nerwach segmentowych larw, wykorzystując różne neuronalne linie GAL4. Przed obserwacją larw można zastosować również inne markery znakowane fluorescencyjnie, na przykład do mitochondriów (MitoTracker) lub lizosomów (LysoTracker). Ruch pęcherzyków GFP oraz ruch cząsteczek można obserwować jednocześnie, korzystając z oddzielnych długości fal.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników

1. Przygotować bufor do sekcji, dodając następujące składniki: 128 mM NaCl, 1mM EGTA, 4 mM MgCl₂, 2mM KCl, 5mM HEPES oraz 36 mM sacharozy do 1000 mL; dostosować pH do 7,2 i poddać sterylizacji przez filtrowanie.

2. Przygotowanie do sekcji

1. Sześcian Siligard: Żel wycina się do rozmiarów około 1 cala szerokości, 1 cala długości i około 1 cm wysokości. Sześcian żelu umieszcza się na szkiełku przedmiotowym podczas sekcji. Sześciany można wykorzystać wielokrotnie.
2. Szpilki: Szpilki używane do sekcji muszą być wyjątkowo krótkie. Do sekcji najlepiej nadaje się ostra dolna część szpilek minutien.
3. Wymagane są jedne ostre nożyczki sprężynowe do mikrodysekcji.
4. Wymagane są dwie pincety z cienkimi końcówkami.

3. Zbieranie larw

1. Błądzenie 3^rd larwy w stadium poczwarki wykazujące ekspresję białka pęcherzykowego znakowanego GFP są zbierane na szalkę Petriego.
2. Larwy przemywa się wodą dejonizowaną, aby usunąć pozostałości pokarmu.

4. Żywa dyssekcja larw

1. Larwę przenosi się do kostki żelu do sekcji na szkiełku przedmiotowym. Larwę zanurza się w buforze do sekcji.
2. Larwę przypina się w części przedniej i tylnej za pomocą dwóch cienkich szpilek, stroną grzbietową do góry.
3. Za pomocą nożyczek do mikrosekcji wykonuje się niewielkie nacięcie w linii środkowej w pobliżu końca tylnego. Od tego nacięcia prowadzi się cięcie w kierunku przednim. Za pomocą dwóch szpilek przypina się rozciętą kutykulę na krawędziach bocznych.
4. Dodaje się kroplę buforu do sekcji. Za pomocą pęsety ostrożnie usuwa się przewód pokarmowy, jelita i ciała tłuszczowe. Większość tych tkanek zazwyczaj wypływa podczas cięcia grzbietowego.
5. Bufor wymienia się na świeży bufor do sekcji. Larwa nigdy nie powinna wyschnąć i musi stale znajdować się w buforze do sekcji.
6. W tym momencie przeprowadza się inkubacje z użyciem markerów in vivo MitoTracker lub LysoTracker, rozcieńczając marker in vivo w buforze do sekcji. Po inkubacji z markerem in vivo zdyssekowaną larwę płucze się kilkukrotnie (5 szybkich płukań) świeżym buforem do sekcji.
7. Po ostatnim płukaniu szpilki wciska się w syligard i natychmiast nakłada szkiełko nakrywką. Larwa jest teraz gotowa do obserwacji.

5. Obrazowanie na żywo wypreparowanych larw

1. Umieść szkiełko nakrywkowe i żel na stoliku mikroskopu i wykonaj obrazowanie za pomocą mikroskopu odwróconego.
2. Do obrazowania znakowanych pęcherzyków w nerwach segmentowych larw stosujemy obiektyw 100x. W pierwszej kolejności ocenia się ekspresję GFP w ciałach komórek zwoju brzusznego, a następnie przystępuje się do obrazowania nerwów segmentowych. Jeśli w ciałach komórek w zwoju brzusznym zaobserwowano silne barwienie GFP, nerwy są obrazowane i wykorzystywane do oceny.
3. Dzięki zastosowaniu systemu podwójnego obrazowania z filtrami dla CFP/YFP lub RFP/YFP oraz oprogramowania do podziału obrazu możemy jednocześnie obrazować dwa znakowane białka in vivo.

6. Reprezentatywne wyniki

Rycina 1: Reprezentatywny obraz przedstawiający liczne pęcherzyki aksonalne na wielu torach aksonalnych w obrębie segmentowego nerwu larwy. Zwróć uwagę na skupiska GFP, reprezentujące akumulacje aksonalne.

Rycina 2: Reprezentatywny obraz przedstawiający pojedynczy tor aksonalny z licznymi pęcherzykami aksonalnymi w obrębie segmentowego nerwu larwalnego.

Dyskusja

In vivo obrazowanie transportu pęcherzyków synaptycznych w nerwach segmentowych larw Drosophila jest potężnym narzędziem do badania mechanizmów transportu aksonalnego. Wcześniej wykorzystaliśmy ten protokół do oceny dynamiki transportu w nerwach larwalnych wykazujących ekspresję rozszerzonych powtórzeń polyQ, aby wyjaśnić, w jaki sposób rozszerzenie powtórzeń wpływa na dynamikę transportu pęcherzyków ³. Stosując ten protokół, prędkość ruchu pęcherzyków można określić poprzez przekształcenie s...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 para nożyczek do mikrodisekcji	Fine Science Tools		Nożyczki sprężynowe – ostrze 6mm, średnica końcówki 0.125 mm
2 pary pęset	Fisher Scientific		Pęsety mikro-Adsona do dyssekcji Fisherbrand z ząbkowaną końcówką
Pudełko szpilek do dyssekcji	Fine Science Tools		Szpilki Minutien o średnicy 0.1mm