Niniejszy protokół opisuje izolację i dysocjację tkanki medulloblastoma myszy oraz późniejsze alloprzeszczepienie komórek nowotworowych do myszy biorców z niedoborem odporności w celu zainicjowania wtórnego medulloblastoma.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wewnątrzczaszkowe ortotopowe przeszczepianie allogeniczne komórek medulloblastoma u myszy z niedoborem odporności
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Medulloblastoma to najczęstszy nowotwór ośrodkowego układu nerwowego u dzieci. Liczne badania na zwierzętach koncentrowały się na prekursorach neuronów ziarnistych móżdżku (CGNPs) jako komórkach macierzystych medulloblastomy1-4. Jednak zróżnicowanie obrazu klinicznego podtypów medulloblastomy u pacjentów (guzowaty, desmoplastyczny, klasyczny i wielkokomórkowy/anaplastyczny) oraz fakt, że medulloblastoma występuje u części pacjentów bez ektopowej ekspresji markerów CGNP5, sugerują, że komórkowe i molekularne pochodzenie tego nowotworu jest bardziej złożone i wciąż nie zostało w pełni wyjaśnione. Dlatego kluczowe jest ustalenie, czy istnieje alternatywna komórka macierzysta medulloblastomy, na podstawie której można opracować specyficzne dla danego typu komórek metody terapeutyczne. W tym celu wewnątrzczaszkowe ortotopowe alloprzeszczepy genetycznie oznakowanych typów komórek nowotworowych, a następnie analiza rozwoju wtórnego guza u biorców, pozwolą na określenie pochodzenia komórkowego komórek inicjujących nowotwór. W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół eksperymentalny wewnątrzczaszkowego ortotopowego alloprzeszczepiania komórek medulloblastomy pochodzących z tkanki guza pierwotnego; procedura ta może być również stosowana do transplantacji komórek z ustalonych linii komórkowych.
Protokół
1. Mikrodyssekcja móżdżku z nowotworem i dysocjacja tkanki nowotworowej
- Pobieranie tkanki nowotworowej
- Myszy chore na medulloblastoma często są zahamowane w rozwoju i wykazują wodogłowie oraz typowe objawy neurologiczne, w tym niedowład tylnych kończyn i brak zdolności do odzyskania pozycji wyprostowanej po odwróceniu. W celu pobrania tkanki nowotworowej należy poddać myszy eutanazji poprzez inhalację dwutlenku węgla. Ważne jest, aby nie przeprowadzać zwichnięcia stawu atlanto-potylicznego, ponieważ procedura ta generuje nacisk na tylną część czaszki i może naruszyć integralność tkanki nowotworowej.
- Dekapitację wykonuje się bezpośrednio po śmierci za pomocą nożyczek, usuwając w miarę możliwości sierść i tkankę mięśniową, aby zapewnić dobrą widoczność czaszki. Powierzchnię czaszki należy oczyścić chusteczką Kimwipe nasączoną 95% etanolem.
- Za pomocą precyzyjnych nożyczek należy wyciąć otwór wzdłuż linii środkowej czaszki, a następnie usunąć tkankę kostną czaszki za pomocą precyzyjnej pęsety, aż do odsłonięcia całego mózgu, w tym móżdżku z nowotworem.
- Podczas gdy móżdżki zdrowych osobników dorosłych wykazują wyraźnie zarysowane półkule i robaka, móżdżki myszy z nowotworem są często powiększone, bezkształtne, o gładkiej powierzchni i z wyraźnie widocznymi naczyniami krwionośnymi. Stosując techniki sterylne, należy pobrać nowotwór móżdżku pęsetą i umieścić go w schłodzonym do temperatury lodowej roztworze fosforanowym (PBS) bez Mg2+ i Ca2+.
Uwaga: wszystkie instrumenty są dezynfekowane w 95% etanolu i sterylizowane w autoklawie parowym przed użyciem.
- Dysocjacja tkanki nowotworowej
- Przenieść tkankę nowotworową z PBS do 50% Accutase (rozcieńczonego w PBS) w objętości około 4-krotnie większej niż objętość tkanki. Rozdrobić tkankę drobnymi nożyczkami przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie inkubować w 37°C przez 4 minuty. Po tym czasie poddać tkankę wielokrotnemu pipetowaniu za pomocą Pipetmana 1-mL przez kolejne 3 minuty. Metoda ta powinna pozwolić na uzyskanie mieszaniny pojedynczych komórek i małych agregatów komórkowych.
- Rozcieńczyć zawiesinę komórkową 3-krotnie za pomocą PBS i wirować przez 5 minut przy 1000xg w celu osadzenia komórek. (Powyższe procedury opisano w publikacji „Isolation, enrichment and maintenance of medulloblastoma stem cells”, JoVE w druku)
Osad komórkowy zawiesić w świeżo przygotowanym medium do hodowli neuralnych komórek macierzystych, składającym się z medium Neurobasal z glutaminą, penicyliną-streptomycyną, N2, B27, ludzkim EGF (25 ng/mL) i podstawowym FGF (25 ng/mL). Obliczyć gęstość komórek w roztworze i wykonać odpowiednie dalsze rozcieńczenia dodatkowym medium do neuralnych komórek macierzystych w taki sposób, aby do sterylnej strzykawki o pojemności 10μL z ukośnym czubkiem można było nabić 4 μL roztworu zawierającego odpowiednią liczbę zdysocjowanych komórek nowotworowych, np. 5x105. Dokładna liczba komórek do inokulacji powinna zostać ustalona przez badacza zgodnie z konkretnymi wymaganiami eksperymentalnymi. Roztwór komórek przechowywać na lodzie w mini probówce do mikrocentryfugi o pojemności 200μL (probówce PCR).
2. Procedury znieczulania myszy biorców
Do przeprowadzenia procedury chirurgicznej wymagany jest zdezynfekowany obszar przeznaczony do operacji na gryzoniach przez cały czas trwania zabiegu. Idealnie jest przygotować długi blat z oddzielnymi, ale przylegającymi do siebie strefami: do przygotowania zwierzęcia, polem operacyjnym oraz strefą rekonwalescencji zwierzęcia. Do operacji wymagane są rękawice chirurgiczne, a nie rękawice do badań. Technikę aseptyczną utrzymuje się poprzez trzymanie dłoni w rękawiczkach powyżej pasa i używanie ich wyłącznie do manipulowania sterylnymi przedmiotami z suchej, sterylnej powierzchni.
- Do znieczulenia stosuje się mieszaninę ketaminy (100 mg ketamine na 1 kg masy ciała myszy) i ksylazyny (10 mg xylazine na 1 kg masy ciała myszy). Środki znieczulające podaje się domięśniowo.
- Pełny efekt działania środków znieczulających występuje zazwyczaj po 3-5 minutach. Stopień znieczulenia myszy należy ocenić poprzez ucisk palca u nogi lub ogona. Na oczy myszy należy nanieść niewielką ilość maści oftalmicznej. Całkowicie znieczuloną mysz przenosi się na obszar operacyjny, stale monitorując, czy oddycha ona prawidłowo.
3. Wszczepianie komórek nowotworowych do czaszki
- Za pomocą maszynki do strzyżenia usuń sierść z grzbietowej tylnej części głowy myszy, aby odsłonić tylną część czaszki nad śródmózgowiem i móżdżkiem.
- Za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką nanieś roztwór Betadyny na odsłoniętą skórę głowy, a następnie przetrzyj ją gazikiem nasączonym alkoholem. Powtórz te dwa etapy sterylizacji dwukrotnie.
- Za pomocą wysterylizowanego skalpela wykonaj nacięcie o długości ćwierci cala w tylnej części skóry głowy. Używając sterylnego wiertła stomatologicznego, wywierć otwór trepanacyjny o średnicy 0,5 mm w odległości 2 mm na prawo i 2 mm za punktem lambda.
- Umieść mysz w aparacie stereotaktycznym, zahaczając siekacze o uchwyt ramy. Ostrożnie opuść i wprowadź do otworu trepanacyjnego strzykawkę o pojemności 10 μL ze ściętą końcówką, załadowaną 4 μL zawiesiny komórek nowotworowych. Gdy ścięta końcówka igły strzykawki znajdzie się poniżej powierzchni czaszki, opuść ją o kolejne 3 mm, a następnie podnieś o 0,5 mm. Powoli wstrzyknij pożądaną ilość komórek nowotworowych do móżdżku biorcy, stosując stałą siłę w ciągu 30 sekund. Po zakończeniu iniekcji pozostaw igłę w miejscu na dodatkowe dwie minuty. Następnie wyjmij igłę i strzykawkę. Zamknij ranę za pomocą klipsa chirurgicznego.
- Po operacji pozostaw mysz na podgrzewaczu, aby pomóc w utrzymaniu temperatury ciała.
Należy stale obserwować mobilność i wzorce oddechowe. Gdy mysz wybudzi się z narkozy, umieść ją z powrotem w sterylnej klatce. Codziennie monitoruj spożycie pokarmu i wody, zachowanie, pielęgnację oraz ewentualne zaczerwienienie oczu. Sprawdzaj, czy w miejscu nacięcia nie pojawiły się oznaki infekcji. Usuń klipsy chirurgiczne w 7. dniu po operacji.
Utrzymuj myszy przez średnio 2-6 miesięcy i uśmierć osobniki wykazujące typowe objawy medulloblastomy w celu przeprowadzenia dalszych badań.
4. Reprezentatywne wyniki
Wtórne medulloblastomy rozwijające się u myszy biorców wykazywały duże podobieństwo do guzów pierwotnych. Móżdżki z guzami wtórnymi były często powiększone i amorficzne, z widocznymi ektopowymi naczyniami krwionośnymi w badaniu preparatów całych organów. Analizy immunohistochemiczne tkanki guza wtórnego wykazały, że komórki nowotworowe charakteryzują się wysoką proliferacją oraz silną ekspresją SmoM2-YFP i markerów prekursorów neuronów ziarnistych móżdżku, takich jak Math1 i Pax6. Po dysocjacji i hodowli zgodnie z opisanymi metodami („Isolation, enrichment and maintenance of medulloblastoma stem cells”, JoVE w prasie), komórki wtórnego guza medulloblastomy mogą być szybko namnażane, wykazują ekspresję wielu markerów komórek macierzystych, są klonogenne i mogą ponownie inicjować tworzenie guzów po przeszczepieniu kolejnym biorcom z niedoborem odporności.
Rycina 1. Typowe widoki preparatu całego oraz przekroje tkanki wtórnego medulloblastoma
Typowy przykład tkanki wtórnego medulloblastoma rozwiniętego 26 dni po wstrzyknięciu 5x105 pierwotnych komórek nowotworowych. Barwienie hematoksyliną ujawnia typową morfologię komórkową medulloblastoma, w tym wysoki stosunek jądra do cytoplazmy oraz polimorfizm jądrowy. Komórki wtórnego guza wykazują wysoką proliferację, na co wskazuje ekspresja Ki67, a także silnie eksprimują błonowe SmoM2-YFP.
Rycina 2. Wtórne komórki medulloblastoma mogą być hodowane i namnażane in vitro
Stosując protokół opisany dla pierwotnych komórek medulloblastoma myszy („Isolation, enrichment and maintenance of medulloblastoma stem cells”, JoVE w prasie), wtórne komórki medulloblastoma mogą być hodowane i namnażane przez wiele pasaży. Zdjęcie przedstawia tę samą reprezentatywną kolonię nowotworową hodowaną w 4. i 14. dniu. Hodowane komórki nowotworowe są bipolarne, wydłużone, z niewielką ilością cytoplazmy i często promieniują z gęstego rdzenia agregatu komórkowego. Nie wykazują one hamowania wzrostu przez kontakt. Małe, okrągłe komórki to erytrocyty.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Kluczowe czynniki zapewniające pomyślny allograft komórek medulloblastoma, prowadzący do powstania wtórnego guza, są następujące: po pierwsze, do dysocjacji tkanki należy używać wyłącznie 50% Accutase i nie dopuszczać do nadmiernego trawienia tkanki, ponieważ przedłużona inkubacja z enzymem prowadzi do znacznego spadku żywotności komórek. Należy również używać wyłącznie Pipetmana o objętości 1 mL, gdyż mniejsze końcówki mogą powodować uszkodzenia mechaniczne zdysocjowanych komórek. Dla potrzeb allograftu dopuszczalna jes...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Badanie to było wspierane przez granty z Vanderbilt-Ingram Cancer Center Support Grant (P30 CA068485), Childhood Brain Tumor Foundation oraz National Institutes of Health (NS042205).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pożywka Neurobasal | Invitrogen | 21103049 | |
| hEGF | Invitrogen | PHG0311 | 25ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0023 | 25ng/ml |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | 1X |
| B27(-RA) | Invitrogen | 12587010 | 1X |
| Accutase | Invitrogen | A1110501 | 50% |
| Glutamina | Invitrogen | 25030081 | 2mM |
| Aparat stereotaktyczny | Stoelting Co. | 51730 | |
| Wiertarka z elastycznym wałem Foredom, model podwieszany | Stoelting Co. | 58650 | |
| Duży uchwyt sondy | Stoelting Co. | 51633 | |
| Strzykawka 10 μL, 26 ga., z ukośnym końcem | Stoelting Co. | 51105 | |
| Wiertło 0,75mm | Stoelting Co. | 51455-3 |
Bibliografia
- Schuller, U. Acquisition of granule neuron precursor identity is a critical determinant of progenitor cell competence to form Shh-induced medulloblastoma. Cancer Cell. 14, 123-134 (2008).
- Yang, Z. J. Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells. Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).
- Kessler, J. D. N-myc alters the fate of preneoplastic cells in a mouse model of medulloblastoma. Genes Dev. 23, 157-170 (2009).
- Flora, A., Klisch, T. J., Schuster, G., Zoghbi, H. Y., Y, H. Deletion of Atoh1 disrupts Sonic Hedgehog signaling in the developing cerebellum and prevents medulloblastoma. Science. 326, 1424-1427 (2009).
- Salsano, E. Expression of the neurogenic basic helix-loop-helix transcription factor NEUROG1 identifies a subgroup of medulloblastomas not expressing ATOH1. Neuro Oncol. 9, 298-307 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
