Błękitna natywna elektroforeza w żelach poliakrylamidowych (BN-PAGE) do analizy kompleksów wielobiałkowych z lizatów komórkowych

Podsumowanie

W niniejszym filmie opisujemy charakterystykę kompleksów wielobiałkowych (MPCs) za pomocą nieodbarwiającej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE). W pierwszym wymiarze dializowane lizaty komórkowe są rozdzielane metodą BN-PAGE w celu identyfikacji poszczególnych MPCs. W drugim wymiarze, SDS-PAGE, wybrane MPCs są dalej rozdzielane w celu analizy ich składników za pomocą immunoblottingu.

Streszczenie

Kompleksy wielobiałkowe (MPCs) odgrywają kluczową rolę w sygnalizacji komórkowej, ponieważ większość białek występuje w funkcjonalnych lub regulacyjnych kompleksach z innymi białkami (Sali, Glaeser et al. 2003). Zatem badanie sieci oddziaływań białko-białko wymaga szczegółowej charakterystyki MPCs w celu uzyskania zintegrowanego zrozumienia funkcji i regulacji białek. Do identyfikacji i analizy MPCs muszą zostać rozdzielone w warunkach natywnych. W tym filmie opisujemy analizę MPCs za pomocą nieodbarwiającej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (BN-PAGE). BN-PAGE jest techniką, która pozwala na rozdzielanie MPCs w konformacji natywnej z wyższą rozdzielczością niż oferuje filtracja żelowa lub ultrawirowanie w gradiencie gęstości sacharozy, i jest zatem użyteczna do określania wielkości, składu i względnej zawartości MPCs (Schägger and von Jagow 1991); (Schägger, Cramer et al. 1994). Metodą tą białka są rozdzielane w matrycy poliakrylamidowej zgodnie z ich rozmiarem hydrodynamicznym i kształtem. Tutaj demonstrujemy analizę MPCs w całkowitych lizatach komórkowych, wskazując, że dializa lizatu jest kluczowym krokiem umożliwiającym zastosowanie BN-PAGE do tych próbek biologicznych. Stosując kombinację BN-PAGE w pierwszym wymiarze i SDS-PAGE w drugim wymiarze, pokazujemy, że MPCs rozdzielone za pomocą BN-PAGE mogą być dalej dzielone na poszczególne składniki za pomocą SDS-PAGE. Wizualizacja komponentów MPCs po rozdzieleniu w żelu jest wykonywana za pomocą standardowego immunoblottingu. Jako przykład analizy MPCs metodą BN-PAGE wybraliśmy dobrze scharakteryzowane eukariotyczne proteasomy 19S, 20S i 26S.

Protokół

**Niniejszy protokół wideo opiera się na powiązanej publikacji ¹: Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for the Identification and Analysis of Multiprotein Complexes. Mahima Swamy, Gabrielle M. Siegers, Susana Minguet, Bernd Wollscheid, and Wolfgang W. A. Schamel. Science's STKE 2006 (345): pl2, July 25, 2006, [DOI: 10.1126/stke.3892006pl4]. Kliknij tutaj, aby zapoznać się z tą publikacją.

1. Przygotowanie dializowanego lizatu komórkowego

1. Zebrać 10x10⁶ komórek i sfragmentować poprzez wirowanie przy 350g przez 5 min w 4°C.
2. Przemyć osad komórkowy trzy razy 1 mL lodowatego PBS (przepis 1), wirować zgodnie z krokiem 1.1.
3. Resuspender osad w 250 μL lodowatego buforu BN-Lysis Buffer (przepis 2) i inkubować na lodzie przez 15 min.
4. Wirować przy 13 000g przez 15 min w 4°C, aby usunąć materiał nierozpuszczalny.
5. Wytopić otwór w zakrętce probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL, używając rozgrzanego szerokiego końca pipety Pasteura, a następnie umieścić probówkę na lodzie, aby schłodziła się do 4°C.
6. Przenieść nadsącz z kroku 1.4 do schłodzonej probówki z otworem w zakrętce.
7. Za pomocą pęsety nałożyć membranę dializacyjną (próg odcięcia masy cząsteczkowej 10 kD) na wierzch otwartej probówki, zamknąć zakrętkę i odciąć nadmiar membrany dializacyjnej wystający na zewnątrz.
8. Ostrożnie uszczelnić boki zakrętki Parafilmem.
9. Odwrócić probówki i wirować je do góry dnem z najniższą możliwą prędkością w probówkach stożkowych 50 mL w wirówce do hodowli komórkowych przez 10 sec w 4°C. Wyjąć odwróconą probówkę z wirówki za pomocą pęsety, aby uniknąć jej obrócenia do pozycji pionowej.
10. Przygotować zlewkę 100-mL z zimnym buforem BN-Dialysis Buffer (przepis 3) i mieszadło magnetyczne. Użyć co najmniej 10 mL buforu BN-Dialysis Buffer na każde 100-μL próbki.
11. Przymocować probówkę taśmą do góry dnem wewnątrz zlewki i usunąć pęcherzyki powietrza z otworu pod zakrętką za pomocą zgiętej pipety Pasteura.
12. Postawić zlewkę na mieszadle magnetycznym, włączyć mieszadło i pozostawić na 6 godzin lub przez noc w chłodni. Okazyjnie sprawdzać, czy mieszanie nie powoduje powstawania pęcherzyków powietrza przy membranie dializacyjnej.
13. Zebrać zdializowany lizat komórkowy do nowej schłodzonej probówki do mikrocentryfugi.

2. Odlewanie żeli BN

1. Odlewanie żelu gradientowego przeprowadza się w temperaturze pokojowej przy użyciu mieszalnika gradientowego. Należy nosić rękawiczki, ponieważ poliakrylamid jest silnie neurotoksyczny. Należy unikać kontaktu z SDS.
2. Mieszalnik gradientowy należy ustawić na mieszadle magnetycznym i podłączyć do elastycznego przewodu. Należy zamknąć kanał za pomocą zaworu i zacisnąć przewód zaciskiem. Do cylindra „high” połączonego z przewodem należy wprowadzić mieszadło magnetyczne w 15%.
3. Elastyczny przewód należy przeprowadzić przez pompę perystaltyczną, a do jego końca przymocować igłę strzykawki. Następnie igłę należy umieścić pomiędzy dwiema szklanymi płytkami aparatury do żelowania.
4. Należy przygotować roztwory żelu rozdzielającego 4% (receptura 5) i 15% (receptura 6), dodając APS oraz TEMED bezpośrednio przed użyciem. Suma objętości powinna być równa objętości żelu rozdzielającego.
5. Roztwory żelowe należy wlać do odpowiednich cylindrów mieszalnika gradientowego (4% do cylindra „low”, a 15% do cylindra „high”).
6. Należy otworzyć zawór i wypchnąć pęcherzyk powietrza z kanału łączącego dwa zbiorniki z żelem, naciskając kciukiem na lewy cylinder.
7. Należy włączyć mieszadło magnetyczne, zdjąć zacisk i uruchomić pompę perystaltyczną z przepływem 5 ml na minutę. Należy pozwolić, aby żel powoli spływał pomiędzy szklane płytki. Należy upewnić się, że igła zawsze znajduje się powyżej poziomu cieczy.
8. Po wprowadzeniu całej cieczy do aparatury do żelowania, należy ją delikatnie przykryć izopropanolem. Żel należy polimeryzować przez co najmniej 30 min w temperaturze pokojowej.
9. Aparaturę do odlewania należy niezwłocznie oczyścić dH₂O (nie używać detergentów).
10. Należy usunąć izopropanol, przemyć dH₂O, a następnie osuszyć dH₂O papierem Whatman.
11. Należy przygotować 3,2% żel koncentrujący (receptura 7), dodając APS oraz TEMED bezpośrednio przed użyciem.
12. Żel koncentrujący należy wlać na wierzch żelu rozdzielającego i wprowadzić grzebień pomiędzy szklane płytki, unikając powstania pęcherzyków powietrza. Po spolimeryzowaniu żelu koncentrującego należy schłodzić żel do 4°C.
13. Bezpośrednio przed nakładaniem próbek należy powoli wyciągnąć grzebień, prowadząc go pod kątem do płaszczyzny żelu. Pozwala to na szybkie dostanie się powietrza do kieszeni, co poprawia jakość dołków.

3. Rozdział dializowanego lizatu komórkowego metodą BN-PAGE

1. Nanieś od 1 do 40 μL dializowanego lizatu oraz od 10 do 20 μL Marker Mix (przepis 10) do suchych studniek w temperaturze 4°C. Przykryj próbki w każdej studni zimnym Cathode Buffer (przepis 8).
2. Wypełnij komorę wewnętrzną zimnym Cathode Buffer, a komorę zewnętrzną/dolną zimnym Anode Buffer (przepis 9).
3. Przyłóż napięcie 100 V w przypadku minigelu lub 150V w przypadku dużego żelu, aż próbki wejdą w żel rozdzielający. Prowadź elektroforezę w temperaturze 4°C.
4. Zwiększ napięcie do 180 V (minigel) lub 400 V (duży żel) i prowadź proces, dopóki front barwnika nie dotrze do końca żelu. Czas przebiegu wynosi od 3 do 4 godzin dla minigelu oraz od 18 do 24 godzin dla dużego żelu.

4. Dwuwymiarowa elektroforeza SDS-PAGE

1. Przygotować standardowy żel SDS o stężeniu 10% (przepisy 12-15) z jedną szeroką studzienką dla pierwszego wymiaru BN-PAGE, jedną zwykłą studzienką dla markera masy cząsteczkowej oraz jedną zwykłą studzienką dla alykwooty dializowanego lizatu zmieszanego z buforem do próbek SDS (przepis 11) i gotowanego przez 5 min w 95°C. Użyć dystansów, których grubość została zwiększona o dwie warstwy taśmy klejącej, aby ułatwić nakładanie wycinka żelu BN-PAGE na żel SDS.
2. Wyjąć żel BN-PAGE wraz z płytkami z urządzenia do elektroforezy i ostrożnie podważyć jedną z płytek.
3. Usunąć żel koncentrujący i wyciąć ścieżkę żelu BN-PAGE zawierającą białka będące przedmiotem analizy.
4. Umieścić wycinek żelu BN-PAGE w 2x buforze do próbek SDS i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej.
5. Krótko (nie dłużej niż 20 s) zagotować wycinek żelu BN-PAGE w kuchence mikrofalowej.
6. Inkubować wycinek żelu BN-PAGE w gorącym buforze do próbek SDS przez kolejne 15 min w temperaturze pokojowej.
7. Umieścić wycinek żelu BN-PAGE w szerokiej studzience nad żelem koncentrującym żelu SDS-PAGE, unikając pęcherzyków powietrza, a następnie przykryć wycinek buforem do próbek SDS. Nałożyć marker oraz kontrolę z lizatu.
8. Przeprowadzić elektroforezę zgodnie ze standardowymi protokołami.

5. Detekcja podjednostek MPC za pomocą immunoblotingu

1. Do transferu przygotować sześć papierów Whatmana oraz membranę PVDF dopasowaną do rozmiaru żelu SDS.
2. Membranę PVDF inkubować w 100% metanolu przez 30 s, a papiery Whatmana namoczyć w buforze do transferu (przepis 16).
3. Umieścić trzy papiery Whatmana, membranę PVDF, żel SDS (po usunięciu żelu koncentrującego) oraz ponownie trzy papiery Whatmana w strukturze przypominającej kanapkę w komorze do transferu półsuchego.
4. Przyłożyć napięcie 20 V przez 25 min.
5. Wykryć białka zgodnie ze standardowymi protokołami immunoblottingu.

6. Reprezentatywne wyniki

Przedstawiamy analizę eukariotycznych proteasomów 19S, 20S i 26S jako przykład charakteryzacji MPC za pomocą 2D BN/SDS-PAGE (Rycina 1A). Komórki HEK293 poddano lizie w buforze zawierającym 0,1% Triton X-100 jako detergent w celu rozbicia błon i solubilizacji kompleksów białek błonowych. Lizaty te poddano dializie przeciwko buforowi do dializy BN w celu usunięcia soli i małych metabolitów. Następnie MPC rozdzielono za pomocą gradientowego 4-15% BN-PAGE, a w drugim wymiarze SDS-PAGE. Białka wywizualizowano za pomocą immunoblottingu z użyciem przeciwciał przeciwko podjednostkom β2 i Mcp21 proteasomu 20S.

Rycina 1. Dwuwymiarowe podejście BN-PAGE/SDS-PAGE z wykorzystaniem lizatów komórkowych. (A) Schemat blokowy dwuwymiarowego podejścia BN-PAGE/SDS-PAGE z lizatów komórkowych. (B) Schemat zasadniczy 2D BN-PAGE/SDS-PAGE. Białka oraz MPC są rozdzielane w warunkach natywnych metodą BN-PAGE w pierwszym wymiarze. W drugim wymiarze białka i/lub MPC są denaturowane przez SDS w pasku żelu po rozdziałe metodą BN-PAGE, a następnie poddawane SDS-PAGE. Białka monomerowe będą migrować wzdłuż hiperbolicznej przekątnej ze względu na zastosowanie żelu gradientowego w pierwszym wymiarze i żelu liniowego w drugim wymiarze. Składniki jednego konkretnego MPC będą znajdować się poniżej przekątnej, wzdłuż linii pionowej.

Wykazano, że dzięki połączeniu BN-PAGE w pierwszym wymiarze i SDS-PAGE w drugim wymiarze, białka monomeryczne migrują wzdłuż hiperbolicznej przekątnej ze względu na zastosowanie żelu gradientowego w pierwszym wymiarze i żelu liniowego w drugim wymiarze ((Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004); Rysunek 1B). Składniki MPC znajdują się poniżej tej przekątnej. Białka będące podjednostkami tego samego MPC można odnaleźć w jednej linii pionowej w drugim wymiarze, natomiast kilka plamek tego samego białka w linii poziomej wskazuje na obecność białka w kilku różnych MPC. Rysunek 2 pokazuje, że w naszym eksperymencie immunoblotting przeciwko β2 i Mcp21 ujawnił obecność specyficznych kompleksów białkowych zawierających te podjednostki proteasomu. Oba białka były wykrywalne jako pojedyncze plamki ułożone w linii poziomej, co wskazuje, że β2 i Mcp21 są składnikami kilku różnych MPC. Na podstawie ich wielkości i składu MPC te można było jednoznacznie zidentyfikować jako proteasom 26S (20S plus czapeczka 19S), proteasom 20S wraz z podjednostką regulacyjną PA28 oraz same proteasomy 20S. Podsumowując, wyniki te demonstrują, że endogenne MPC można zidentyfikować i scharakteryzować za pomocą podejścia dwuwymiarowego BN-PAGE/SDS-PAGE z wykorzystaniem lizatu komórkowego. Metoda ta jest przydatna do określania wielkości, składu i względnej liczności MPC.

Rysunek 2. Wykrywanie różnych form proteasomu eukariotycznego za pomocą immunoblotingu po dwuwymiarowej elektroforezie BN-PAGE/SDS-PAGE. W celu identyfikacji i analizy proteasomów eukariotycznych, komórki HEK293 poddano lizie z użyciem 0,1% Triton X-100. Lizaty komórkowe poddano dializie, a następnie elektroforezie BN-PAGE (4-15%) w celu rozdzielenia kompleksów MPC. Następnie przeprowadzono drugi wymiar elektroforezy SDS-PAGE (10%) w celu rozdziału poszczególnych subkomponentów ze względu na ich wielkość. Immunoblotting przeprowadzono z użyciem specyficznych przeciwciał rozpoznających podjednostkę Mcp21 i β2 kompleksu rdzeniowego 20S oraz podjednostkę regulacyjną PA28.

I. Tabela specyficznych odczynników (porządek alfabetyczny):

Odczynnik	Firma	Uwagi
kwas 6-aminoheksanowy (kwas ε-aminokapronowy)	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	Ten związek chemiczny jest substancją drażniącą i należy z nim pracować w rękawiczkach.
roztwór akryloamidu i bis-akryloamidu (40%), Mix 32:1	Applichem, Darmstadt, Germany	Ten roztwór jest neurotoksyczny i należy z nim pracować w rękawiczkach.
Bis-tris	Roth, Karlsruhe, Germany
Brij 96	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany
Coomassie blue G250	Serva, Heidelberg, Germany	Nie należy zastępować go innymi rodzajami barwników Coomassie, takimi jak Coomassie blue R250 lub koloidalne barwniki Coomassie.
Digitonina	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	Digitonina jest toksyczna. Podczas pracy z buforami lub próbkami zawierającymi ten detergent należy nosić rękawiczki.
Dodecylmaltozyd	Applichem, Darmstadt, Germany
Triton X-100	Roth, Karlsruhe, Germany	Triton X-100 jest toksyczny. Podczas pracy z buforami lub próbkami zawierającymi ten detergent należy nosić rękawiczki.

II. Tabela specyficznych materiałów i sprzętu:

Sprzęt	Firma
Membrany dializacyjne (próg odcięcia masy cząsteczkowej 10 do 50 kD)	Roth, Karlsruhe, Germany
System do elektroforezy żelowej	Na przykład z Bio-Rad, Munich, Germany
Mieszalnik gradientowy	Własnej konstrukcji lub dostępny komercyjnie z Bio-Rad, Munich, Germany
Pompa perystaltyczna	Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany
Membrana z polifluorku winylidenu (PVDF)	Immobilon-P, Millipore, Eschborn, Germany
Urządzenie do transferu półsuchego	Na przykład z Bio-Rad, Munich, Germany
Rurki silikonowe (średnica 3 do 5 mm, długość 1 m)	NeoLab, Heidelberg, Germany

III. Tabela z przepisami:

Nr	Bufory i roztwory	Skład	Uwagi
1	Fosforanowy bufor solny (PBS)	Na2HPO4 8.1 mM KH2PO4 1.5 mM NaCl 138 mM KCl 2.7 mM	Roztwór powinien mieć pH 7.4, jeśli został przygotowany prawidłowo.
2	Bufor do lizy BN	Bufor podstawowy Bis-tris 20 mM kwas ε-aminokapronowy 500 mM NaCl 20 mM EDTA, pH 8.0 2 mM Glicerol 10% Dostosować pH do 7.0 za pomocą HCl. Przechowywać w 4°C. Detergent Digitonina 0.5 do 1.0% lub Brij 96 0.1 do 0.5% lub Triton X-100 0.1 do 0.5% lub Dodecylmaltozyd 0.1 do 0.5% Inhibitory proteaz i fosfataz Aprotynina 10 μg/ mL Leupeptyna 10 μg/ mL PMSF 1 mM Fluorek sodu 0.5 mM Ortowanadan sodu 0.5 mM	Odpowiedni detergent należy dobrać empirycznie i powinien być taki sam, jak ten użyty w innych recepturach buforów do lizy. Digitoninę należy dodać bezpośrednio przed użyciem z 2% roztworu zapasu w dH2O (przechowywać w alikwotach 5 ml w -20°C). Inhibitory proteaz i fosfataz należy dodać bezpośrednio przed użyciem. Po dodaniu ortowanadanu sodu bufor nabierze żółtawego koloru.
3	Bufor do dializy BN	Bufor podstawowy Bis-tris 20 mM kwas ε-aminokapronowy 500 mM NaCl 20 mM EDTA, pH 8.0 2 mM Glicerol 10% Dostosować pH do 7.0 za pomocą HCl. Przechowywać w 4°C. Detergent Digitonina 0.3 do 0.5% lub Triton X-100 0.1% lub Brij 96 0.1% lub Dodecylmaltozyd 0.1% Inhibitory proteaz i fosfataz PMSF 1 mM Ortowanadan sodu 0.5 mM	Odpowiedni detergent należy dobrać empirycznie i powinien być taki sam, jak ten użyty w innych buforach do lizy, ale w indicated niższych stężeniach. Detergent musi zostać dodany, aby zapobiec agregacji na etapie koncentrowania (stacking) w elektroforezie żelowej. Inhibitory proteaz i fosfataz należy dodać bezpośrednio przed użyciem.
4	3x Bufor do żelu BN	Bis-tris 150 mM kwas ε-aminokapronowy 200 mM Dostosować pH do 7.0 za pomocą HCl. Przechowywać w 4°C.
5	Żel rozdzielający 4%	3x Bufor do żelu BN (receptura 4) 5.00 mL Akrylamid/Bisakrylamid 1.50 mL dH2O 8.50 mL APS, 10% w dH2O 54 μL TEMED 5.4 μL	Dodać APS i TEMED bezpośrednio przed zalaniem żelu, ponieważ odczynniki te wspomagają polimeryzację. Ta receptura jest wystarczająca do przygotowania żelu o objętości 30 ml. Dostosować objętości do liczby i rozmiaru zalewanych żeli.
6	Żel rozdzielający 15%	3x Bufor do żelu BN (receptura 4) 5.00 mL Akrylamid/Bisakrylamid 5.63 mL Glicerol 70% 4.38 mL APS, 10% w dH2O 42 μL TEMED 4.2 μL	Dodać APS i TEMED bezpośrednio przed zalaniem żelu, ponieważ odczynniki te wspomagają polimeryzację. Ta receptura jest wystarczająca do przygotowania żelu o objętości 30 ml. Dostosować objętości do liczby i rozmiaru zalewanych żeli. Stężenie akrylamidu-bisakrylamidu można w razie potrzeby zmieniać w zakresie od 10 do 18%.
7	Żel koncentrujący 3.2%	3x Bufor do żelu BN (receptura 4) 3.00 mL Akrylamid/Bisakrylamid 0.72 mL dH2O 5.28 mL APS, 10% w dH2O 120 μL TEMED 12 μL	Dodać APS i TEMED bezpośrednio przed zalaniem żelu, ponieważ odczynniki te wspomagają polimeryzację. Ta receptura jest wystarczająca do przygotowania żelu o objętości 30 ml. Dostosować objętości do liczby i rozmiaru zalewanych żeli.
8	Bufor katodowy	Bis-tris 15 mM Tricyna 50 mM Błękit Coomassie G250 0.02% Przygotować 1 litr jako stężenie zapasu 10x, dostosować pH do 7.0 za pomocą HCl i przechowywać w 4°C. Przed użyciem rozcieńczyć 1:10 w dH2O.	Nie zastępować innymi rodzajami barwnika Coomassie, takimi jak Błękit Coomassie R250 lub koloidalne błękity Coomassie.
9	Bufor anodowy	Bis-tris 50 mM Przygotować 1 litr jako stężenie zapasu 10x, dostosować pH do 7.0 za pomocą HCl i przechowywać w 4°C. Przed użyciem rozcieńczyć 1:10 w dH2O.
10	Mieszanina markerów	Aldolaza (158 kD) 10 mg/ mL Katalaza (232 kD) 10 mg/ mL Ferytyna (440 i 880 kD) 10 mg/ mL Tiroglobulina (670 kD) 10 mg/ mL BSA (66 i 132 kD) 10 mg/ mL Bis-tris 20 mM NaCl 20 mM Glicerol 10% Dostosować pH do 7.0 za pomocą HCl. Przechowywać w 4°C.	Markery masy cząsteczkowej są również dostępne komercyjnie z kilku źródeł, w tym od Invitrogen lub Pharmacia.
11	Bufor do próbek SDS	Tris 12.5 mM SDS 4% Glicerol 20% Błękit bromofenolowy 0.02% Dostosować pH do 6.8. Aby zredukować mostki dwusiarczkowe, dodać 9 mL β-merkaptoetanolu.	SDS w proszku oraz β-merkaptoetanol są toksyczne. Należy zatem używać rękawiczek i pracować pod wyciągiem.
12	4x bufor dolny	Tris 1.5 M SDS 0.4% Dostosować pH do 8.8.	SDS w proszku jest toksyczny. Należy zatem używać rękawiczek i pracować pod wyciągiem.
13	4x bufor górny	Tris 0.5 M SDS 0.4% Dostosować pH do 6.8.	SDS w proszku jest toksyczny. Należy zatem używać rękawiczek i pracować pod wyciągiem.
14	Żel rozdzielający 10%	Akrylamid (30%) 2.0 mL 4x bufor dolny 1.5 mL dH2O 2.454 mL APS, 10% w dH2O 40 μL TEMED 6 μL	Dodać APS i TEMED bezpośrednio przed zalaniem żelu, ponieważ odczynniki te wspomagają polimeryzację. Ta receptura jest wystarczająca do przygotowania żelu o objętości 30 ml. Dostosować objętości do liczby i rozmiaru zalewanych żeli.
15	Żel koncentrujący 4.8%	Akrylamid (30%) 320 μL 4x bufor górny 500 μL dH2O 1.16 mL APS, 10% w dH2O 20 μL TEMED 2 μL	Dodać APS i TEMED bezpośrednio przed zalaniem żelu, ponieważ odczynniki te wspomagają polimeryzację. Ta receptura jest wystarczająca do przygotowania żelu o objętości 30 ml. Dostosować objętości do liczby i rozmiaru zalewanych żeli.
16	Bufor do transferu półsuchego	Tris 48 mM Glicyna 39 mM Metanol 20% SDS 0.1% Dopełnić objętość do 1 litra wodą dH2O. Przechowywać w temperaturze pokojowej.	SDS w proszku oraz metanol są toksyczne. Należy zatem używać rękawiczek i pracować pod wyciągiem.

Dyskusja

W niniejszym badaniu opisujemy analizę MPC za pomocą BN-PAGE. Zastosowano podejście 2D, aby najpierw rozdzielić MPC w warunkach natywnych, a następnie dalej podzielić je na poszczególne komponenty w drugim wymiarze za pomocą SDS-PAGE.

Próbki przygotowuje się z lizatów komórkowych. Do solubilizacji wielu MPC niezbędny jest odpowiedni detergent, który zachowuje strukturę kompleksów białkowych. W tym przypadku stosujemy 0,1% Triton X-100. Należy jednak empirycznie określić optymalny detergent i jego odpowiednie stężenie dla każdego MPC. W przypadku Triton X-100 zgłaszano na przykład, że niskie stężenia detergentu umożliwiają identyfikację dimeru kompleksu F₁F₀-ATPase (Arnold, Pfeiffer et al. 1998). Wyższe stężenia Triton X-100 prowadzą jednak do dysocjacji dimeru i odpowiadającego temu wzrostu ilości monomeru kompleksu F₁F₀-ATPase. Jest to zgodne z jednym z naszych wcześniejszych badań, w którym wykazaliśmy, że wielowartościowy kompleks receptora limfocytów T (TCR) zostaje zachowany podczas ekstrakcji niskimi stężeniami Brij 96, podczas gdy zastosowanie wyższego stężenia lub innego detergentu, zwanego digitoniną, skutkuje ekstrakcją monomerów TCR (Schamel, Arechaga et al. 2005). Do powszechnie stosowanych detergentów, które można przetestować, należą digitonina (0,5 do 1%), Triton X-100 (0,1 do 0,5%), Brij 96 (0,1 do 0,5%) lub dodecylmaltosid (0,1 do 0,5%). Odczynniki te są detergentami niejonowymi, które zazwyczaj najlepiej zapewniają stabilność MPC. Należy pamiętać, że należy unikać kontaktu z SDS i innymi silnymi detergentami (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004).

Dializa lizatów jest niezbędna do uzyskania rozdzielenia MPC w żelu BN (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004); (Heiss, Junkes et al. 2005). Wydaje się, że dostosowanie stężenia soli lub usunięcie zanieczyszczeń o niskiej masie cząsteczkowej ma kluczowe znaczenie dla wysokiej rozdzielczości. Warto zauważyć, że do BN-PAGE nadają się również preparaty błon oraz MPC, które zostały oczyszczone immunologicznie, a następnie eluowane z przeciwciał (Swamy, Siegers et al. 2006). W obu przypadkach próbki nie muszą być poddawane dializie przed rozdziałem BN-PAGE, jeśli liza błon lub elucja są przeprowadzane w buforze do lizy BN.

Do rozdziału białek metodą BN-PAGE niezbędny jest barwnik Coomassie blue, który wiąże się nieswoiście z białkami i nadaje im ładunki ujemne. Dzięki temu Coomassie blue umożliwia ruch elektroforetyczny białek w kierunku katody przy neutralnym pH (Schägger and von Jagow 1991); (Schägger, Cramer et al. 1994). Ponadto Coomassie blue zapobiega agregacji białek w żelu koncentrującym podczas elektroforezy. Do BN-PAGE należy stosować Coomassie G250 zamiast Coomassie blue R250 lub koloidalnych form Coomassie blue.

Przed przeprowadzeniem elektroforezy BN-gel należy upewnić się, że stężenie żelu jest odpowiednie dla oczekiwanego rozmiaru badanego MPC. Gotowe żele BN-gel o różnych gradientach wraz z odpowiednimi buforami są dostępne w sprzedaży od firmy Invitrogen (NativePAGE Novex Bis-Tris Gel System). Żele BN-gel można jednak przygotować również samodzielnie, używając mieszalnika gradientowego wraz z pompą perystaltyczną. Aby zagwarantować nienaruszony gradient, ciecz powinna płynąć stale podczas wlewania, a należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza. Zalecamy nakładanie na żel próbek o różnych rozcieńczeniach, ponieważ zbyt duże obciążenie może prowadzić do precypitacji białek w trakcie procesu elektroforezy. Ponadto elektroforezę BN-gel należy prowadzić w temperaturze 4°C, aby zapobiec degradacji białek i zachować nienaruszoną strukturę MPC.

Po wykonaniu BN-PAGE wizualizację MPC można przeprowadzić za pomocą barwienia błękitem Coomassie, barwienia srebrem lub immunoblottingu. Prążki białkowe uwidocznione po barwieniu błękitem Coomassie lub srebrem nadają się do dalszej analizy metodą spektrometrii mas (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). W przypadku immunoblottingu optymalne warunki transferu dla analizowanych MPC należy określić empirycznie. Należy pamiętać, że podczas transferu z żelu BN błękit Coomassie również ulega przeniesieniu. W związku z tym po pomyślnym transferze żel stanie się bezbarwny, natomiast membrana przybierze niebieski kolor. Ponadto ważne jest zaznaczenie, że nie każde przeciwciało pierwszorzędowe, które sprawdza się w detekcji po SDS-PAGE, nadaje się do immunoblottingu po BN-PAGE. Może się zdarzyć, że przeciwciała nie rozpoznają analizowanego MPC, ponieważ jego epitop jest ukryty w natywnej konformacji białek. Aby rozwiązać ten problem, można zdenaturować białka w żelu BN przed transferem, krótko gotując żel w 1x buforze do próbek SDS.

W naszym przykładzie nie poddaliśmy żelu BN bezpośrednio detekcji prążków białkowych. Zamiast tego, lizat rozdzielony za pomocą BN-PAGE podzieliliśmy dalej w drugim wymiarze za pomocą SDS-PAGE. W żelu SDS drugiego wymiaru białka monomerowe migrują wzdłuż hiperbolicznej przekątnej ze względu na zastosowanie żelu gradientowego w pierwszym wymiarze i żelu liniowego w drugim wymiarze (Camacho-Carvajal, Wollscheid et al. 2004). Pozwala to na łatwą identyfikację MPC, ponieważ znajdują się one poniżej tej hiperbolicznej przekątnej. Subkomponenty jednego, wyraźnego MPC są rozdzielone w linii pionowej w SDS-PAGE drugiego wymiaru. Komponenty będące składnikami kilku różnych MPC można zidentyfikować w linii poziomej, zgodnie z wielkością MPC. Należy jednak wziąć pod uwagę, że kilka plamek białkowych pojawiających się w jednej linii pionowej może również być częścią osobnych kompleksów, które migrują w tej samej pozycji w BN-PAGE. Ostateczny dowód na to, że znajdują się one w tym samym MPC, można uzyskać za pomocą testu przesunięcia w żelu z użyciem przeciwciał (antibody-based gel shift assay). W tym teście lizat komórkowy przed BN-PAGE inkubuje się z przeciwciałem przeciwko białku reprezentowanemu przez jedną z zidentyfikowanych plamek. Skutkuje to przesunięciem wszystkich MPC zawierających to białko w stronę wyższej masy cząsteczkowej w pierwszym wymiarze. Inne białka, które również są częścią tych MPC, ulegną temu specyficznemu dla kompleksu przesunięciu i są zatem łatwe do zidentyfikowania w żelu SDS drugiego wymiaru.

BN-PAGE umożliwia nie tylko analizę składu MPC, ale także określenie ich stechiometrii (Schamel and Reth 2000); (Schamel 2001), (Swamy, Minguet et al. 2007). W tym celu można przeprowadzić test NAMOS (natywny test przesunięcia ruchliwości oparty na przeciwciałach). Podobnie jak w żelowym teście przesunięcia opartym na przeciwciałach, lizaty komórkowe inkubuje się z monoklonalnymi przeciwciałami specyficznymi dla poszczególnych podjednostek. Prowadzi to do indukcji elektroforetycznych przesunięć immunologicznych w żelach BN, co pozwala wywnioskować stechiometrię MPC na podstawie zakresu przesunięcia

Podsumowując, metoda BN-PAGE nadaje się do identyfikacji MPC oraz określania ich wielkości, składu, a także względnej obfitości. Wykonana jako analiza NAMOS, oferuje ona również możliwość wyznaczenia stechiometrii konkretnego MPC. Biorąc pod uwagę jej ogólną stosowalność, technika ta stanowi bardzo użyteczne narzędzie do charakteryzacji MPC (Dekker, Müller et al. 1996); (Wittig and Schagger 2008); (Wagner, Rehling et al. 2009); (Wittig and Schägger 2009).