Myszy transnuklearne o zdefiniowanej specyficzności receptorów limfocytów T przeciwko Toxoplasma gondii uzyskane poprzez SCNT

Podsumowanie

Wykazujemy tutaj, że przeprogramowanie epigenetyczne za pomocą transferu jąder komórek somatycznych (SCNT) może być wykorzystane jako narzędzie do tworzenia modeli mysich o zdefiniowanych specyficznościach receptorów limfocytów T (TCR). Myszy transjądrowe te wykazują ekspresję odpowiadającego TCR z ich locus endogennego pod kontrolą promotora endogennego.

Streszczenie

Limfocyty, takie jak limfocyty T, przechodzą genetyczną rekombinację V(D)J w celu wygenerowania receptora o określonej specyficzności¹. Myszy transgeniczne pod względem zreorganizowanego, swoistego antygenowo receptora limfocytów T (TCR) stanowią niezastąpione narzędzie w badaniu rozwoju i funkcji limfocytów T. Jednakże takie TCR są zazwyczaj izolowane z odpowiednich limfocytów T po długotrwałej hodowli, często następującej po wielokrotnej stymulacji antygenem, co nieuchronnie prowadzi do selekcji limfocytów T o wysokim powinowactwie. Losowa integracja genomiczna łańcuchów α i β TCR oraz ekspresja z promotorów nieendogennych mogą prowadzić do różnic w poziomie i kinetyce ekspresji.

Przeprogramowanie epigenetyczne za pomocą transferu jąder komórek somatycznych (SCNT) stanowi narzędzie pozwalające na generowanie embrionalnych komórek macierzystych oraz myszy z dowolnej wybranej komórki. W konsekwencji, gdy SCNT jest stosowane do limfocytów T o znanej swoistości, genetyczne rearanżacje V(D)J są przenoszone do embrionalnych komórek macierzystych (ESCs) powstałych w wyniku SCNT oraz do pochodzących z nich myszy, podczas gdy markery epigenetyczne zostają zresetowane. Wykazaliśmy, że limfocyty T o zdefiniowanej swoistości przeciwko Toxoplasma gondii mogą być wykorzystane do generowania modeli mysich wykazujących ekspresję swoistego TCR z ich locus endogennych, bez wprowadzania eksperymentalnych modyfikacji genetycznych. Stosunkowa łatwość i szybkość, z jaką można uzyskać takie modele transjądrowe, dają nadzieję na konstruowanie innych modeli chorób.

Protokół

Metoda ta została zastosowana w badaniach opisanych w pracy Kirak et al., Science 328 (5975), 243-248 (2010).

1. Izolacja komórek dawcy

Zanim specyficzne limfocyty T lub B zostaną wykorzystane jako komórki donora do generowania transjądrowych modeli mysich, myszy muszą zostać zainfekowane odpowiednim patogenem lub uodpornione za pomocą odpowiedniego antygenu. Ponieważ w naszych badaniach wykorzystaliśmy komórki CD8+ specyficzne dla Toxoplasma gondii, poniższy protokół opisuje generowanie i izolację tych komórek i powinien zostać dostosowany w zależności od potrzeb badawczych.

1. Cysty pochodzące z homogenatu mózgu myszy (około 40) wstrzykuje się do jamnie brzusznej myszy BL/6 x Balb/c F1 (B6CF1), co umożliwia izolację limfocytów T CD8+ z ograniczeniem H-2^b oraz H-2^d.
2. W szczytowej fazie odpowiedzi immunologicznej zakażoną mysz uśmierca się, izoluje śledzionę i umieszcza ją w naczyniu zawierającym 6 mL buforu do lizy erytrocytów (RBC).
3. Używając matowych krawędzi dwóch szkiełek nakrywkowych, śledzionę ostrożnie rozciera się i inkubuje w buforze do lizy RBC przez 5 min w RT.
4. Dodaje się 14 mL PBS, filtruje zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe (40 lub 70 μm) do probówki typu Falcon 50 mL i wiruje przez 5 min przy 300g.
5. Usuwa się supernatant, resuspendsuje osad komórkowy w 1 mL PBS i przenosi do probówki Eppendorf 1,5 mL. Wiruje się przez 5 min przy 300g, a następnie usuwa supernatant.
6. Osad komórkowy resuspendsuje się w 50 μL PBS, do zawiesiny dodaje się przeciwciała znakowane fluorescencyjnie w celu identyfikacji interesującego typu komórek (np. CD3, B220, CD8 i CD4) oraz znakowany fluorescencyjnie tetramer MHC-I (tetramer MHC-II dla limfocytów T CD4) z załadowanym interesującym peptydem, a następnie inkubuje przez 30 min w 4°C.
7. Dodaje się 1 mL PBS, wiruje przez 5 min przy 300 g, resuspendsuje osad w 3 ml PBS i filtruje zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe (40 lub 70 μm) do probówki.
8. Przeprowadza się sortowanie FACS (FACSorting), ustawiając rygorystycznie bramki (Rysunek 1B).

2. Transfer jądra komórki somatycznej

Istnieje kilka protokołów transferu jąder komórek somatycznych. Metoda opisana w niniejszej pracy wykorzystuje oocyty zatrzymane w metafazie II oraz hamowanie drugiego podziału mejotycznego za pomocą cytochalazyny B. W związku z tym wymagane są komórki dawcy znajdujące się w fazie G0/G1.

1. Przygotowanie oocytów
   1. Samicom myszy o linii BDF1 wstrzykuje się dopaszkowo 5IU PMS na mysz między godziną 17:00 a 19:00.
   2. Po około 47 godzinach każdej myszy wstrzykuje się dopaszkowo 5IU HCG.
   3. W dniu wstrzyknięcia HCG należy przygotować naczynie hodowlane (krople KSOM-AA pod warstwą oleju) dla oocytów i umieścić je w inkubatorze w temperaturze 37°C i przy 5% CO₂. Należy również przygotować igły niezbędne do SCNT (7μm do enukleacji oraz 4 lub 5μm do transferu jąder limfocytów), wypełniając je rtęcią.
   4. Około 13h po podaniu HCG (około godziny 8:00) uśmierca się myszy i izoluje jajowody. Jajowody zbiera się w 1-2 kroplach HCZB.
   5. Jajowody przenosi się pojedynczo do kropli zawierającej M2 z hialuronidazą. Jajowód ostrożnie nacinamy pęsetą i przenosimy kompleks oocyt-cumulus do kropli. Po wyizolowaniu wszystkich kompleksów oocyt-cumulus naczynie inkubuje się w temperaturze 37°C.
   6. Po 2-5 min (dokładny czas zależy od partii hialuronidazy) zbiera się oocyty, przepłukuje w HCZB i osadza w kroplach KSOM-AA.
2. Enukleacja oocytów
   1. Do przygotowania płytki do SCNT należy użyć pokrywki od szalki Petriego. Następnie ustawia się mikroskop oraz mikromanipulator.
   2. Przed rozpoczęciem enukleacji igłę do enukleacji (7 μm) należy przepłukać w PVP.
   3. Do enukleacji grupę oocytów (10-30) umieszcza się w kropli HZCB z cytochalazyną B (5 μg/mL). Podczas inkubacji (min. 5 min) oocyty ustawia się poziomo.
   4. Pojedynczy oocyt przenosi się przed igłę trzymającą. Oocyt unieruchamia się na igle trzymającej za pomocą podciśnienia. Używając igły do enukleacji, obraca się oocyt, aż kompleks wrzeciona chromosomowego (CSC, często nazywany „jądrem”) znajdzie się na pozycji godziny 3:00.
   5. Za pomocą impulsu piezoelektrycznego ostrożnie przebija się błonę przejrzystą, aby nie uszkodzić oocytu. Otwór igły umieszcza się w sąsiedztwie wrzeciona w metafazie II i aplikuje podciśnienie. „Jądro” powinno powoli przesunąć się do wnętrza igły, a błona powinna się zamknąć po jego całkowitym usunięciu.
   6. Enukleowane oocyty przenosi się z powrotem do kropli KSOM-AA i wielokrotnie przepłukuje. Kroki enukleacji powtarza się dla kolejnej grupy oocytów. Czynność kontynuuje się, aż wszystkie komórki zostaną enukleowane lub do godziny 11:00.
3. Transfer jąder
   1. W celu wykonania transferu jąder należy wymienić igłę do enukleacji (7 μm) na igłę do transferu jąder (4 lub 5 μm) i przepłukać ją w PVP.
   2. Interesujące komórki (np. limfocyty T CD8+) umieszcza się w kropli PVP, dokładnie miesza i inkubuje przez minimum 10 min.
   3. Grupę enukleowanych oocytów (10-30) umieszcza się w kropli HCZB z cytochalazyną B (2,5 μg/mL). Podczas inkubacji (min. 5 min) oocyty ustawia się poziomo za pomocą igły do transferu jąder.
   4. Z zawiesiny komórek w PVP pobiera się komórkę dawcy i aspiruje ją wielokrotnie, aż do rozpadu błony zewnętrznej (powinny być widoczne fragmenty błony i cytozolu). W razie potrzeby można zastosować impuls piezoelektryczny. Po wyizolowaniu jądra przesuwa się je nieco w górę igły i kontynuuje pobieranie jąder, aż uzyska się ich 10-30.
   5. Przechodzi się do kropli z ustawionymi enukleowanymi oocytami. Jeden oocyt unieruchamia się na igle trzymającej za pomocą podciśnienia. Igłę do transferu jąder (jądra powinny znajdować się z dala od otworu) przystawia się do błony przejrzystej i aplikuje impuls piezoelektryczny, aż igła przebije błonę przejrzystą. Ostrożnie przesuwa się jedno jądro do końcówki igły i wprowadza igłę do oocytu, aż jej końcówka znajdzie się w 2/3 wewnątrz. Aplikuje się niewielkie podciśnienie, aby fragment błony oocytu znalazł się w igle.
   6. Kolejny krok jest krytyczny, ponieważ jest to jedyny moment, w którym oocyt jest faktycznie „otwarty”. Aplikuje się pojedynczy impuls piezoelektryczny, wypycha jądro z igły za pomocą nadciśnienia, ostrożnie wycofuje igłę tak, aby jej końcówka znajdowała się w oocycie na głębokości około 1/3, a następnie aplikuje podciśnienie i kontynuuje wycofywanie igły, aby zamknąć oocyt. Krok ten powtarza się dla każdego oocytu.
   7. Po wprowadzeniu jądra do wszystkich oocytów z grupy, są one przepłukiwane i hodowane w medium KSOM-AA. Procedurę powtarza się dla wszystkich pozostałych oocytów.
   8. Po tym, jak ostatnia grupa była hodowana w KSOM-AA przez minimum 30 min, embriony SCNT przenosi się do kropli wolnego od Ca medium aktywacyjnego zawierającego SrCl2.
   9. Po 6 godzinach aktywacji określa się liczbę embrionów SCNT z obecnością pseudo-pronuclei (PPN). Następnie embriony są przepłukiwane i hodowane w kroplach KSOM-AA przez kolejne 3,5 dnia, aż osiągną stadium blastocysty.
   10. Do mediów aktywacyjnych i hodowlanych można dodać wybrane leki lub związki chemiczne (takie jak trichostatyna A).

3. Pozyskiwanie embrionalnych komórek macierzystych

Blastocysty otrzymane metodą SCNT mogą zostać wykorzystane albo do transferu do pseudyciężarnych samic (znane również jako klonowanie bezpośrednie lub jednoetapowe), albo do wyprowadzenia embrionalnych komórek macierzystych (znane również jako klonowanie pośrednie lub dwuetapowe). Ponieważ generowanie komórek ES jest znacznie bardziej efektywne, wybieramy procedurę dwuetapową. W przypadku, gdy badacza interesuje klonowanie bezpośrednie, blastocysty można przenieść bezpośrednio do pseudyciężarnych samic, zgodnie z opisem w sekcji 5.

Istnieje wiele protokołów opisujących wyprowadzanie embrionalnych komórek macierzystych. Metoda opisana w niniejszym materiale jest techniką standardową, w której wykorzystuje się komórki karmione oraz płodową surowicę cielęcą.

1. Drugiego dnia po transferze jąder, przygotuj płytkę 96-dołkową typu U do izolacji komórek ES.
2. Dodaj 100 μL żelatyny do każdego dołka płytki 96-dołkowej typu U, inkubuj przez minimum 10 min, a następnie usuń ją z dołków.
3. Rozmroź komórki karmne i resuspenduj w odpowiedniej objętości medium ESD, np. komórki karmne odpowiadające powierzchni 25 cm² resuspenduj w 10 mL medium ESD, a następnie dodaj 200 μL zawiesiny komórkowej do każdego dołka potraktowanego żelatyną.
4. Umieść płytkę w inkubatorze i hoduj w temperaturze 37°C, przy 5% CO₂.
5. Po 3,5 dniach embriony powinny znajdować się w stadium blastocysty.
6. Przygotuj sterylną szalkę bakteryjną, nakładając kilka kropli medium do komórek ES oraz kwasowy tyrode.
7. Blastocysty przenieś najpierw z kropli KSOM-AA do kropli zawierających zwykłe medium do komórek ES i przemyj dwukrotnie.
8. Ostrożnie przenieś grupę blastocyst (5-10 blastocyst) do jednej kropli kwasowego tyrode i pozostaw w niej do czasu rozpuszczenia błony przejrzystej (zona pellucida).
9. Następnie przenieś blastocysty do kropli z medium ES, przemyj dwukrotnie, a następnie umieść w płytce 96-dołkowej typu U pokrytej komórkami karmnymi (jedna blastocysta do jednego dołka).
10. Następnie hoduj embriony przez 5-7 dni w inkubatorze w temperaturze 37°C, przy 5% CO₂, nie niepokojąc ich. Daje to embrionowi czas na przytwierdzenie się do warstwy karmnej i utworzenie wyrostka.
11. Przygotuj płytki 24-dołkowe, nakładając do każdego dołka komórki karmne w medium ESD, np. resuspenduj ilość komórek karmnych odpowiadającą 50 cm² w 12 mL medium ESD i dodaj 500 μL zawiesiny komórkowej do każdego dołka.
12. Ostrożnie usuń medium ESD z płytki 96-dołkowej typu U z embrionami, przemyj każdy dołek dwukrotnie 250 μL Hepes (lub PBS), dodaj 50 μL trypsyny i inkubuj przez około 5 min w 37°C.
13. Pipetuj wielokrotnie w górę i w dół, aż wyrostek rozpadnie się do postaci zawiesiny pojedynczych komórek, przenieś do płytki 24-dołkowej i inkubuj w 37°C, przy 5% CO₂.
14. Jeśli izolacja ESC przebiegła pomyślnie, kolonie ESC powinny być widoczne po 7-10 dniach.

4. Iniekcja do blastocysty

Iniekcja blastocyst jest rutynową techniką służącą do generowania dowolnego rodzaju transgenicznego modelu mysiego. Należy zaznaczyć, że iniekcja blastocyst oraz następujący po niej transfer do pseudyciałych samic wymagają precyzyjnego zgrania czasowego.

1. Przeprowadź priming samic myszy za pomocą PMS i HCG zgodnie z opisem w sekcji 2.1. Po wstrzyknięciu HCG umieść samice razem z samcami (jedna samica i jeden samiec na klatkę).
2. Następnego dnia sprawdź obecność czopów u samic. Moment ten uznaje się za 0,5dpc (dni po kopulacji).
3. Zapłodnione embriony są następnie izolowane z jajowodu zgodnie z opisem w sekcji 2.1 i hodowane w KSOM-AA przez kolejne 3 dni.
4. Przygotuj komórki ES w dniu wstrzykiwania do blastocyst (3,5dpc).
5. Usuń pożywkę z komórek ES, przemyj je dwukrotnie Hepesem (lub PBS), dodaj trypsynę i inkubuj przez 5 min w 37°C.
6. Resuspenduj trypsynizowane komórki w pożywce ES, wysej na szalkę i inkubuj przez 45-60 min w 37°C, 5% CO₂, aby zredukować liczbę komórek karmicieli (komórki karmiciele przylegają szybciej niż komórki ES).
7. Przenieś zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe (40 lub 70 μm) do probówki i wiruj przez 5 min przy 1000rpm.
8. Usuń nadsącz, resuspenduj osad komórkowy w 500 μL pożywki ES i przechowuj na lodzie do momentu użycia.
9. Przygotuj pokrywkę sterylnej szalki bakteriostatycznej, nanosząc krople zawierające PVP i HCZB.
10. Przygotuj igłę 15 μm, ładując ją rtęcią, ustawiając w odpowiedniej pozycji i przemywając PVP.
11. Umieść grupę blastocyst (10-30 blastocyst) w kropli z HCZB, a do drugiej kropli HCZB dodaj 5-50 μL zawiesiny komórek ES (zależnie od stężenia).
12. Pobierz komórki ES (50-100 komórek) za pomocą igły do iniekcji.
13. Przenieś się do kropli z blastocystami. Ustaw blastocysty poziomo i unieruchom jedną z nich igłą trzymającą, stosując podciśnienie.
14. Za pomocą igły do iniekcji obróć blastocystę tak, aby masa komórek wewnętrznych (ICM) znajdowała się na godzinie 9.
15. Ustaw igłę do iniekcji na godzinie 3, upewnij się, że na czubku igły nie ma komórek ES, i stosuj impulsy piezoelektryczne, aż igła przebije zonę pellucidą oraz trofektodermę i wniknie do blastocele.
16. Uwolnij kilka komórek ES (5-15 komórek), tak aby przylgnęły do ICM. Kontynuuj, aż wszystkie blastocysty z grupy zostaną zaszczepione komórkami ES.
17. Po zakończeniu pracy z jedną grupą blastocyst, przemyj je dwukrotnie w KSOM-AA i przechowuj w kropli KSOM-AA do czasu wstrzyknięcia wszystkich blastocyst.

5. Transfer embrionów

Transfer zarodków do samic w stanie pseudociąży jest procedurą chirurgiczną, którą należy przeprowadzić bardzo starannie i zgodnie z wytycznymi instytutu badawczego.

1. Zanurzyć samice myszy biorcy w anestezji, ogolić prawą dolną ćwiartkę ciała i zdezynfekować obszar zabiegu.
2. Za pomocą nożyczek rozciąć skórę i oddzielić otrzewną od skóry.
3. Zlokalizować jajnik przez otrzewną (czerwony punkt) i rozciąć otrzewną w bezpośrednim sąsiedztwie jajnika.
4. Używając pęsety, ostrożnie uchwycić jajowód i wyciągnąć macicę.
5. Pobrać grupę około 10 blastocyst za pomocą kapilary połączonej z pipetą ustną.
6. Utrzymać macicę jedną pęsetą, wykonać w niej niewielki otwór za pomocą cienkiej igły i wprowadzić kapilarę z blastocystami do światła macicy.
7. Ostrożnie wprowadzić zarodki do macicy, a następnie wyciągnąć kapilarę.
8. Wsunąć macicę z powrotem do jamy brzusznej.
9. Zlokalizować brzegi otrzewnej i zamknąć ją za pomocą kilku szwów.
10. Zamknąć skórę myszy za pomocą kilku zszywek.
11. W celu uśmierzenia bólu pooperacyjnego podać 5 μg karprofenu na mg masy ciała.

Rycina 1. Transfer jąder komórek somatycznych zdefiniowanych wcześniej limfocytów T w tle genetycznym B6CF1. Bezwzględna i względna liczba embrionów uzyskanych z limfocytów T CD8+ oraz embrionalnych komórek macierzystych pochodzących z blastocyst uzyskanych metodą SCNT.

Rycina 2. Reprezentatywna analiza cytometryczna myszy chimerycznych wstrzykniętych z komórkami macierzystymi embrionalnymi uzyskanymi metodą SCNT. Bramka i liczba (procent w stosunku do całkowitej liczby komórek T CD8+) wskazują na obecność specyficznych komórek T CD8+ u myszy chimerycznych.

Dyskusja

Wykazaliśmy tutaj, że SCNT może być wykorzystane do generowania myszy transjądrowych z limfocytów T o zdefiniowanej specyficzności. Chociaż nie zostało to tutaj przedstawione, technika ta powinna być również możliwa do zastosowania w celu generowania myszy transjądrowych z limfocytów B o zdefiniowanej specyficzności.

Ważnym aspektem jest wybór szczepu i płci myszy, która zostaje zainfekowana lub zimmunizowana w celu izolacji interesujących nas limfocytów T lub B. Ze względu na to, że limfocyty T i B wykazują ogólnie bardzo niską wydajność reprogramowania, zalecamy stosowanie hybryd F1 o pożądanym haplotypie. Ponieważ komórka dawcy determinuje również płeć, zalecamy stosowanie limfocytów T lub B pochodzących od samców myszy. Oznacza to, że tylko samce myszy chimerowych przekazywałyby TCR lub BCR w linii zarodkowej, a hodowla samców myszy jest łatwiejsza i szybsza.

Biorąc to wszystko pod uwagę, uważamy, że przeprogramowanie epigenetyczne za pomocą SCNT stanowi potężne narzędzie do tworzenia nowego rodzaju modeli mysich, co będzie ogromną zaletą dla dziedziny immunologii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bufor do lizy erytrocytów	Sigma-Aldrich	R7757
Sito do separacji komórek	BD Biosciences	REF 352340
surowica z klaczy w ciąży (PMS)	Calbiochem	367222
Ludzka gonadotropina kosmórkowa (HCG)	Calbiochem	230734
Hialuronidaza	Sigma-Aldrich	H4272	Typ IV-S
KSOM-AA	EMD Millipore	MR-106-D
HCZB	EMD Millipore	MR-173-D	Podłoże dostosowane
Pożywka bez jonów Ca do aktywacji	EMD Millipore	MR-174-D	Pożywka dostosowana*
SrCl22	Sigma-Aldrich	255521	100 mM = 10x
AlbuMAX I	GIBCO, by Life Technologies	11020-021
PVP	MP Biomedicals	102787	Przygotować 10% roztwór z wykorzystaniem HCZB i dodać 0,1% AlbuMAX I
Cytochalasyna B	Sigma-Aldrich	C6762	500μg/ml = 100x
Trichostatyna A	Sigma-Aldrich	T8552	5 mM = 1000x
Olej mineralny	Sigma-Aldrich	M5310
Trzymanie igły	Humagen	MPH-SM-30
Igły do wstrzykiwania i transferu	Humagen	4-15, 7-15, 15-15
Pipeta ustna	Sigma-Aldrich	A5177
Nożyczki	Fine Science Tools	14088-10	lub coś podobnego
Pinceta	Fine Science Tools	11251-10	lub coś podobnego
Aplikator do klipsów do ran	BD Biosciences	427630
Klamry do ran	BD Biosciences	427630
Szycie	Ethicon Inc.	K871H
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
płytkim serum wołowe (FBS)	Hyclone	SH30071.03	15%
Penicylina/Streptomycyna	Lonza Inc.	17-602E	100x
Glutamina	MP Biomedicals	101806	200 mM = 100x
Aminokwasy nieesencjalne	GIBCO, by Life Technologies	11140050	100x
β-merkapto–etanol	GIBCO, by Life Technologies	21985-023	5μl w 500 ml
LIF	EMD Millipore	ESG1106	1000x
inhibitor MEK	Technologia sygnalizacji komórkowej	9900L	Wyłącznie w przypadku wyprowadzania komórek ES, dodać do pożywki ES (stężenie końcowe 50μM)