Myszy transnuklearne o zdefiniowanej specyficzności receptorów limfocytów T przeciwko Toxoplasma gondii uzyskane poprzez SCNT

Podsumowanie

Wykazujemy tutaj, że przeprogramowanie epigenetyczne za pomocą transferu jąder komórek somatycznych (SCNT) może być wykorzystane jako narzędzie do tworzenia modeli mysich o zdefiniowanych specyficznościach receptorów limfocytów T (TCR). Myszy transjądrowe te wykazują ekspresję odpowiadającego TCR z ich locus endogennego pod kontrolą promotora endogennego.

Streszczenie

Limfocyty, takie jak limfocyty T, przechodzą genetyczną rekombinację V(D)J w celu wygenerowania receptora o określonej specyficzności¹. Myszy transgeniczne pod względem zreorganizowanego, swoistego antygenowo receptora limfocytów T (TCR) stanowią niezastąpione narzędzie w badaniu rozwoju i funkcji limfocytów T. Jednakże takie TCR są zazwyczaj izolowane z odpowiednich limfocytów T po długotrwałej hodowli, często następującej po wielokrotnej stymulacji antygenem, co nieuchronnie prowadzi do selekcji limfocytów T o wysokim powinowactwie. Losowa integracja genomiczna łańcuchów α i β TCR oraz ekspresja z promotorów nieendogennych mogą prowadzić do różnic w poziomie i kinetyce ekspresji.

Przeprogramowanie epigenetyczne za pomocą transferu jąder komórek somatycznych (SCNT) stanowi narzędzie pozwalające na generowanie embrionalnych komórek macierzystych oraz myszy z dowolnej wybranej komórki. W konsekwencji, gdy SCNT jest stosowane do limfocytów T o znanej swoistości, genetyczne rearanżacje V(D)J są przenoszone do embrionalnych komórek macierzystych (ESCs) powstałych w wyniku SCNT oraz do pochodzących z nich myszy, podczas gdy markery epigenetyczne zostają zresetowane. Wykazaliśmy, że limfocyty T o zdefiniowanej swoistości przeciwko Toxoplasma gondii mogą być wykorzystane do generowania modeli mysich wykazujących ekspresję swoistego TCR z ich locus endogennych, bez wprowadzania eksperymentalnych modyfikacji genetycznych. Stosunkowa łatwość i szybkość, z jaką można uzyskać takie modele transjądrowe, dają nadzieję na konstruowanie innych modeli chorób.

Protokół

Metoda ta została zastosowana w badaniach opisanych w pracy Kirak et al., Science 328 (5975), 243-248 (2010).

1. Izolacja komórek dawcy

Zanim specyficzne limfocyty T lub B zostaną wykorzystane jako komórki donora do generowania transnuklearnych modeli mysich, myszy muszą zostać zainfekowane odpowiednim patogenem lub uodpornione za pomocą odpowiedniego antygenu. Ponieważ w naszych badaniach wykorzystaliśmy komórki CD8+ specyficzne dla Toxoplasma gondii, poniższy protokół opisuje generowanie i izolację tych komórek; należy go dostosować w zależności od konkretnych potrzeb badawczych.

1. Cysty pochodzące z homogenatu mózgu mysiego (około 40) są wstrzykiwane do jamny brzusznej myszy BL/6 x Balb/c F1 (B6CF1), co umożliwia izolację limfocytów T CD8+ z ograniczeniem do H-2^b oraz H-2^d.
2. W szczycie odpowiedzi immunologicznej zakażoną mysz uśpiono, izolując śledzionę i umieszczając ją w naczyniu zawierającym 6 mL buforu do lizy erytrocytów (RBC).
3. Przy użyciu matowych stron dwóch szkiełek nakrywkowych śledzionę ostrożnie rozdrabnia się i inkubuje w buforze do lizy RBC przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT).
4. Należy dodać 14 mL PBS, przefiltrować zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe (40 lub 70 μm) do probówki typu Falcon o pojemności 50 mL i wirować przez 5 min przy 300g.
5. Po usunięciu supernatantu osad komórkowy resuspenduje się w 1 mL PBS i przenosi do probówki Eppendorf o pojemności 1,5 mL. Następnie wiruje się przez 5 min przy 300g i ponownie usuwa supernatant.
6. Osad komórkowy resuspenduje się w 50 μL PBS, a do zawiesiny komórkowej dodaje przeciwciała znakowane fluorescencyjnie w celu identyfikacji interesującego typu komórek (np. CD3, B220, CD8 i CD4) oraz znakowany fluorescencyjnie tetramer MHC-I (tetramer MHC-II dla limfocytów T CD4) z załadowanym odpowiednim peptydem, a następnie inkubuje przez 30 min w temperaturze 4°C.
7. Należy dodać 1 mL PBS, wirować przez 5 min przy 300 g, resuspender osad w 3 ml PBS i przefiltrować zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe (40 lub 70 μm) do probówki.
8. Należy przeprowadzić sortowanie FACS, ustawiając bramki w sposób rygorystyczny (Rysunek 1B).

2. Transfer jądra komórki somatycznej

Istnieje kilka protokołów transferu jąder komórek somatycznych. Metoda opisana w niniejszym opracowaniu wykorzystuje oocyty zatrzymane w metafazie II oraz hamowanie drugiego podziału mejotycznego przy użyciu cytochalazyny B. W związku z tym wymagane są komórki dawcy znajdujące się w fazie G0/G1.

1. Przygotowanie oocytów
   1. Samicom myszy o pochodzeniu BDF1 wstrzykuje się dopłciennie 5IU PMS na mysz w godzinach od 17:00 do 19:00.
   2. Około 47 godzin później każdej myszy wstrzykuje się dopłciennie 5IU HCG.
   3. W dniu wstrzyknięcia HCG przygotowuje się naczynie hodowlane (krople KSOM-AA pod warstwą oleju) dla oocytów i umieszcza je w inkubatorze w temperaturze 37°C, przy 5% CO₂. Należy również przygotować igły niezbędne do SCNT (7μm do enukleacji oraz 4 lub 5μm do transferu jąder limfocytów), wypełniając je rtęcią.
   4. Myszami uśmierca się i izoluje jajowody około 13 godzin po podaniu HCG (około godziny 8:00). Jajowody zbiera się w 1-2 kroplach HCZB.
   5. Jajowody przenosi się pojedynczo do kropli zawierającej M2 z hialuronidazą. Jajowód ostrożnie nacinamy pęsetą i przenosimy kompleks oocyt-cumulus do kropli. Po wyizolowaniu wszystkich kompleksów oocyt-cumulus naczynie inkubuje się w temperaturze 37°C.
   6. Po 2-5 minutach (dokładny czas zależy od partii hialuronidazy) zbiera się oocyty, przemywa w HCZB i nanosi na krople KSOM-AA.
2. Enukleacja oocytów
   1. Do przygotowania płytki SCNT należy użyć pokrywki od szalki Petriego. Następnie ustawia się mikroskop oraz mikromanipulator.
   2. Przed rozpoczęciem enukleacji igłę do enukleacji (7 μm) przemywa się w PVP.
   3. Do enukleacji grupę oocytów (10-30) umieszcza się w kropli HZCB z cytochalazyną B (5 μg/mL). Podczas inkubacji (minimum 5 min) oocyty ustawia się w linii poziomej.
   4. Pobiera się jeden oocyt i umieszcza go przed igłą trzymającą. Oocyt unieruchamia się na igle trzymającej poprzez zastosowanie próżni. Za pomocą igły do enukleacji obraca się oocyt, aż kompleks wrzeciono-chromosomy (CSC, często nazywany „jądrem”) znajdzie się na pozycji godziny 3:00.
   5. Za pomocą impulsu piezoelektrycznego ostrożnie przebija się zonę pellucida, nie uszkadzając oocytu. Otwór igły umieszcza się obok wrzeciona w stadium metafazy II i stosuje się próżnię. „Jądro” powinno powoli przesunąć się do wnętrza igły, a błona powinna zamknąć się automatycznie po jego całkowitym usunięciu.
   6. Enukleowane oocyty przenosi się z powrotem do kropli KSOM-AA i wielokrotnie przemywa. Kroki enukleacji powtarza się dla nowej grupy oocytów. Czynność kontynuuje się, aż wszystkie komórki zostaną enukleowane lub do około godziny 11:00.
3. Transfer jąder
   1. W celu wykonania transferu jąder wymienia się igłę do enukleacji (7 μm) na igłę do transferu jąder (4 lub 5 μm) i przemywa ją w PVP.
   2. Analizowane komórki (np. limfocyty T CD8+) umieszcza się w kropli z PVP, dobrze miesza i inkubuje przez minimum 10 min.
   3. Grupę enukleowanych oocytów (10-30) umieszcza się w kropli HCZB z cytochalazyną B (2,5 μg/mL). Podczas inkubacji (min. 5 min) oocyty ustawia się poziomo za pomocą igły do transferu jąder.
   4. Z zawiesiny komórek w PVP pobiera się komórkę dawcy i aspiruje ją wielokrotnie, aż do rozpadu błony zewnętrznej (powinny być widoczne fragmenty błony i cytozolu). W razie potrzeby można zastosować impuls piezoelektryczny. Po wyizolowaniu jądra przesuwa się je nieco w górę igły i kontynuuje pobieranie jąder, aż uzyska się ich 10-30.
   5. Przenosi się do kropli z ustawionymi enukleowanymi oocytami. Jeden oocyt unieruchamia się na igle trzymającej za pomocą próżni. Igłę do transferu jąder (jądra powinny znajdować się w pewnej odległości od otworu) umieszcza się przy zonie pellucida i stosuje impulsy piezoelektryczne, aż igła przejdzie przez zonę pellucida. Ostrożnie przesuwa się jedno jądro do czubka igły, wsuwa igłę do wnętrza oocytu, aż jej czubek znajdzie się w 2/3 głębokości. Stosuje się niewielkie podciśnienie, aby niewielka część błony oocytu znalazła się w igle.
   6. Kolejny krok jest krytyczny, ponieważ jest to jedyny moment, w którym oocyt jest faktycznie „otwarty”. Stosuje się pojedynczy impuls piezo, wypycha się jądro z igły za pomocą nadciśnienia, ostrożnie wycofuje igłę, tak aby jej czubek znajdował się w około 1/3 oocytu, a następnie stosuje się podciśnienie i kontynuuje wycofywanie igły, aby zamknąć oocyt. Krok ten powtarza się dla każdego oocytu.
   7. Po otrzymaniu jądra przez wszystkie oocyty w grupie, są one przemywane i hodowane w medium KSOM-AA. Procedurę powtarza się dla wszystkich oocytów.
   8. Po inkubacji ostatniej grupy w KSOM-AA przez minimum 30 min, embriony SCNT przenosi się do kropli medium aktywacyjnego wolnego od Ca, zawierającego SrCl2.
   9. Po 6 godzinach aktywacji określa się liczbę embrionów SCNT z obecnością pseudo-prądzierzy (PPN). Następnie embriony są przemywane i hodowane w kroplach KSOM-AA przez dodatkowe 3,5 dnia, aż osiągną stadium blastocysty.
   10. Do mediów aktywacyjnych i hodowlanych można dodać wybrane leki lub związki chemiczne (takie jak Trichostatin A).

3. Pozyskiwanie embrionalnych komórek macierzystych

Blastocysty powstałe w wyniku SCNT można wykorzystać albo do transferu do pseudaciążowych samic (znane również jako klonowanie bezpośrednie lub jednowstępowe), albo do pozyskania embrionalnych komórek macierzystych (znane również jako klonowanie pośrednie lub dwustępowe). Ze względu na znacznie wyższą efektywność generowania komórek ES, wybieramy procedurę dwustępową. W przypadku, gdy badacza interesuje klonowanie bezpośrednie, blastocysty mogą zostać przeniesione bezpośrednio do pseudaciążowych samic, zgodnie z opisem w sekcji 5.

Istnieje wiele protokołów opisujących metodę otrzymywania embrionalnych komórek macierzystych. Opisana tutaj technika jest metodą standardową, w której wykorzystuje się komórki karmione oraz płodową surowicę bydlęcą.

1. Drugiego dnia po transferze jąder przygotuj płytkę 96-dołkową z dołkami w kształcie U do wyprowadzenia komórek ES.
2. Do każdego dołka płytki 96-dołkowej dodaj 100 μL żelatyny, inkubuj przez co najmniej 10 min, a następnie usuń ją z dołków.
3. Rozmroź komórki zasilające i resuspenduj w odpowiedniej objętości medium ESD; na przykład komórki zasilające odpowiadające powierzchni 25 cm² resuspenduje się w 10 mL medium ESD, a następnie 200 μL zawiesiny komórkowej dodaje się do każdego dołka potraktowanego żelatyną.
4. Umieść płytkę w inkubatorze i hoduj w temperaturze 37°C, przy 5% CO₂.
5. Po 3,5 dniach zarodki powinny osiągnąć stadium blastocysty.
6. Przygotuj sterylną szalkę bakteriologiczną, nanosząc kilka kropel medium do komórek ES oraz kwasowego roztworu tyrode.
7. Blastocysty przenieś najpierw z kropel KSOM-AA do kropel zawierających standardowe medium do komórek ES i przemyj dwukrotnie.
8. Ostrożnie przenieś grupę blastocyst (5-10 sztuk) do jednej kropli kwasowego roztworu tyrode i pozostaw w niej do czasu rozpuszczenia błony przejrzystej (zona pellucida).
9. Następnie przenieś blastocysty do kropli z medium ES, przemyj dwukrotnie, a następnie umieść w płytce 96-dołkowej z dołkami w kształcie U pokrytej komórkami zasilającymi (jedna blastocysta na jeden dołek).
10. Zarodki hoduj następnie przez 5-7 dni w inkubatorze w temperaturze 37°C, przy 5% CO₂, nie zakłócając ich wzrostu. Pozwala to zarodkowi przytwierdzić się do warstwy zasilającej i utworzyć wypustkę (outgrowth).
11. Przygotuj płytki 24-dołkowe, nanosząc do każdego dołka komórki zasilające w medium ESD; na przykład resuspenduj komórki zasilające odpowiadające powierzchni 50 cm² w 12 mL medium ESD i dodaj 500 μL zawiesiny komórkowej do każdego dołka.
12. Ostrożnie usuń medium ESD z płytki 96-dołkowej z zarodkami, przemyj każdy dołek dwukrotnie 250 μL Hepes (lub PBS), dodaj 50 μL trypsyny i inkubuj przez około 5 min w temperaturze 37°C.
13. Pipetuj zawiesinę wielokrotnie w górę i w dół, aż wypustka rozpadnie się do postaci zawiesiny pojedynczych komórek, przenieś ją do płytki 24-dołkowej i inkubuj w temperaturze 37°C, przy 5% CO₂.
14. Jeśli wyprowadzenie ESC zakończyło się sukcesem, kolonie ESC powinny być widoczne po 7-10 dniach.

4. Iniekcja do blastocysty

Iniekcja blastocyst jest rutynową techniką służącą do generowania dowolnego rodzaju transgenicznego modelu mysiego. Należy zaznaczyć, że iniekcja blastocyst i następujący po niej transfer do samic w stanie pseudociąży muszą być odpowiednio zsynchronizowane czasowo.

1. Przygotuj samice myszy poprzez podanie PMS i HCG zgodnie z opisem w sekcji 2.1. Po iniekcji HCG umieść samice razem z samcami (jedna samica i jeden samiec na klatkę).
2. Następnego dnia sprawdź obecność czopów pochwowych u samic. Dzień ten uznaje się za 0,5dpc (dni po kopulacji).
3. Zapłodnione embriony są następnie izolowane z jajowodów zgodnie z opisem w sekcji 2.1 i hodowane w KSOM-AA przez kolejne 3 dni.
4. Przygotuj komórki ES w dniu iniekcji blastocyst (3,5dpc).
5. Usuń medium z komórek ES, przemyj je dwukrotnie roztworem Hepes (lub PBS), dodaj trypsynę i inkubuj przez 5 min w 37°C.
6. Resuspenduj trypsynizowane komórki w medium ES, wysiej na szalkę i inkubuj przez 45-60 min w 37°C, 5% CO₂, aby zredukować liczbę komórek feeder (komórki feeder przylegają szybciej niż komórki ES).
7. Przenieś zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe (40 lub 70 μm) do probówki i wiruj przez 5 min przy 1000rpm.
8. Usuń nadosad, resuspenduj osad komórkowy w 500 μL medium ES i przechowuj na lodzie do czasu użycia.
9. Przygotuj pokrywkę sterylnej szalki bakteriologicznej, nanosząc krople zawierające PVP oraz HCZB.
10. Przygotuj igłę 15 μm, ładując ją rtęcią, ustawiając w odpowiedniej pozycji i przemywając PVP.
11. Umieść grupę blastocyst (10-30 blastocyst) w kropli z HCZB, a do drugiej kropli HCZB dodaj 5-50 μL zawiesiny komórek ES (zależnie od stężenia).
12. Pobierz komórki ES (50-100 komórek) za pomocą igły do iniekcji.
13. Przejdź do kropli z blastocystami. Ustaw blastocysty poziomo i unieruchom jedną z nich igłą trzymającą, stosując podciśnienie.
14. Używając igły do iniekcji, obracaj blastocystę, aż masa komórkowa wewnętrzna (ICM) znajdzie się na pozycji godziny 9.
15. Umieść igłę do iniekcji na pozycji godziny 3, upewnij się, że na końcówce igły nie ma komórek ES, i stosuj impuls piezoelektryczny, aż igła do iniekcji przebije zonę pellucida i trofektodermę, wnikając do blastocele.
16. Wprowadź kilka komórek ES (5-15 komórek), tak aby przywarły do ICM. Kontynuuj, aż wszystkie blastocysty w grupie zostaną zainfekowane komórkami ES.
17. Po zakończeniu procedury dla jednej grupy blastocyst, przemyj je dwukrotnie w KSOM-AA i przechowuj w kropli z KSOM-AA, aż wszystkie blastocysty zostaną poddane iniekcji.

5. Transfer embrionów

Transfer embrionów do samic w stanie pseudociąży jest procedurą chirurgiczną, która musi być przeprowadzona bardzo starannie i zgodnie z wytycznymi instytutu badawczego.

1. Zanurz myszy biorczynie w narkozie, ogól prawy dolny kwadrant brzucha i zdezynfekuj obszar zabiegu.
2. Za pomocą nożyczek rozetnij skórę i oddziel otrzewną od skóry.
3. Zlokalizuj jajnik przez otrzewną (czerwony punkt) i rozetnij otrzewną w bezpośrednim sąsiedztwie jajnika.
4. Używając pęsety, ostrożnie chwyć jajowód i wyciągnij macicę.
5. Pobierz grupę około 10 blastocyst za pomocą kapilary połączonej z pipetą ustną.
6. Ustabilizuj macicę jedną pęsetą, wykonaj w niej mały otwór za pomocą cienkiej igły i wprowadź kapilarę z blastocystami do światła macicy.
7. Ostrożnie wprowadź embriony do macicy, a następnie wyjmij kapilarę.
8. Wprowadź macicę z powrotem do jamy brzusznej.
9. Zlokalizuj brzegi otrzewnej i zamknij ją za pomocą kilku szwów.
10. Zamknij skórę myszy za pomocą kilku zszywek.
11. W celu uśmierzenia bólu pooperacyjnego podaj 5 μg Carprofen na mg masy ciała.

Rysunek 1. Transfer jąder komórek somatycznych zdefiniowanych wcześniej limfocytów T w tle B6CF1. Bezwzględna i względna liczba embrionów uzyskanych z limfocytów T CD8+ oraz embrionalnych komórek macierzystych pochodzących z blastocyst SCNT.

Rycina 2. Reprezentatywna analiza cytometryczna przepływowa myszy chimerycznych po wstrzyknięciu embrionalnych komórek macierzystych uzyskanych metodą SCNT. Bramka i liczba (procent w stosunku do całkowitej liczby limfocytów T CD8+) wskazują na obecność specyficznych limfocytów T CD8+ w myszach chimerycznych.

Dyskusja

Wykazaliśmy tutaj, że SCNT może być wykorzystane do generowania myszy transjądrowych z limfocytów T o zdefiniowanej specyficzności. Chociaż nie zostało to tutaj przedstawione, technika ta powinna być również możliwa do zastosowania w celu generowania myszy transjądrowych z limfocytów B o zdefiniowanej specyficzności.

Ważnym aspektem jest wybór szczepu i płci myszy, która zostaje zainfekowana lub zimmunizowana w celu izolacji interesujących nas limfocytów T lub B. Ze względu na to, że limfocyty T i B wykazują ogólnie bardzo niską wydajność reprogramowania, zalecamy stosowanie hybryd F1 o pożądanym haplotypie. Ponieważ komórka dawcy determinuje również płeć, zalecamy stosowanie limfocytów T lub B pochodzących od samców myszy. Oznacza to, że tylko samce myszy chimerowych przekazywałyby TCR lub BCR w linii zarodkowej, a hodowla samców myszy jest łatwiejsza i szybsza.

Biorąc to wszystko pod uwagę, uważamy, że przeprogramowanie epigenetyczne za pomocą SCNT stanowi potężne narzędzie do tworzenia nowego rodzaju modeli mysich, co będzie ogromną zaletą dla dziedziny immunologii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bufor do lizy erytrocytów	Sigma-Aldrich	R7757
Sito do separacji komórek	BD Biosciences	REF 352340
surowica z klaczy w ciąży (PMS)	Calbiochem	367222
Ludzka gonadotropina kosmórkowa (HCG)	Calbiochem	230734
Hialuronidaza	Sigma-Aldrich	H4272	Typ IV-S
KSOM-AA	EMD Millipore	MR-106-D
HCZB	EMD Millipore	MR-173-D	Podłoże dostosowane
Pożywka bez jonów Ca do aktywacji	EMD Millipore	MR-174-D	Pożywka dostosowana*
SrCl22	Sigma-Aldrich	255521	100 mM = 10x
AlbuMAX I	GIBCO, by Life Technologies	11020-021
PVP	MP Biomedicals	102787	Przygotować 10% roztwór z wykorzystaniem HCZB i dodać 0,1% AlbuMAX I
Cytochalasyna B	Sigma-Aldrich	C6762	500μg/ml = 100x
Trichostatyna A	Sigma-Aldrich	T8552	5 mM = 1000x
Olej mineralny	Sigma-Aldrich	M5310
Trzymanie igły	Humagen	MPH-SM-30
Igły do wstrzykiwania i transferu	Humagen	4-15, 7-15, 15-15
Pipeta ustna	Sigma-Aldrich	A5177
Nożyczki	Fine Science Tools	14088-10	lub coś podobnego
Pinceta	Fine Science Tools	11251-10	lub coś podobnego
Aplikator do klipsów do ran	BD Biosciences	427630
Klamry do ran	BD Biosciences	427630
Szycie	Ethicon Inc.	K871H
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
płytkim serum wołowe (FBS)	Hyclone	SH30071.03	15%
Penicylina/Streptomycyna	Lonza Inc.	17-602E	100x
Glutamina	MP Biomedicals	101806	200 mM = 100x
Aminokwasy nieesencjalne	GIBCO, by Life Technologies	11140050	100x
β-merkapto–etanol	GIBCO, by Life Technologies	21985-023	5μl w 500 ml
LIF	EMD Millipore	ESG1106	1000x
inhibitor MEK	Technologia sygnalizacji komórkowej	9900L	Wyłącznie w przypadku wyprowadzania komórek ES, dodać do pożywki ES (stężenie końcowe 50μM)