Konfokalna mikroskopia rogówki: Nowoczesna nieinwazyjna metoda ilościowej oceny patologii małych włókien w neuropatiach obwodowych

Podsumowanie

Mikroskopia konfokalna rogówki jest nieinwazyjną techniką kliniczną, która może być wykorzystana do ilościowej oceny uszkodzeń włókien C w celu diagnozy i stratyfikacji pacjentów z rosnącym stopniem nasilenia neuropatii.

Streszczenie

Dokładna kwantyfikacja neuropatii obwodowej jest istotna dla zdefiniowania pacjentów z grupy ryzyka, przewidywania pogorszenia stanu zdrowia oraz oceny nowych terapii. Metody konwencjonalne oceniają deficyty neurologiczne i elektrofizjologię, a ilościowe testy sensoryczne kwantyfikują zmiany funkcjonalne w celu wykrycia neuropatii. Jednakże najwcześniejsze uszkodzenia wydają się dotyczyć małych włókien, podczas gdy testy te oceniają przede wszystkim dysfunkcję dużych włókien i mają ograniczoną zdolność do wykazania regeneracji i naprawy. Jedynymi technikami umożliwiającymi bezpośrednie badanie uszkodzeń i naprawy nieumielinowanych włókien nerwowych są biopsja nerwu łydkowego z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej oraz biopsja punch skóry. Obie te metody są jednak procedurami inwazyjnymi, wymagają czasochłonnych procedur laboratoryjnych i znacznej wiedzy specjalistycznej. Konfokalna mikroskopia rogówki jest nieinwazyjną techniką kliniczną, która zapewnia obrazowanie włókien nerwowych rogówki in-vivo. Wykazaliśmy wczesne uszkodzenia nerwów, które wyprzedzają utratę wewnątrzepidermalnych włókien nerwowych w biopsjach skóry, wraz ze stratyfikacją stopnia nasilenia neuropatii i naprawy po przeszczepieniu trzustki u pacjentów z cukrzycą. Wykazaliśmy również uszkodzenia nerwów w idiopatycznej neuropatii małych włókien oraz w chorobie Fabry'ego.

Protokół

Wstęp:

Dokładna kwantyfikacja neuropatii obwodowej jest istotna dla zdefiniowania pacjentów z grupy ryzyka, przewidywania pogorszenia stanu zdrowia oraz oceny nowych terapii. Metody konwencjonalne oceniają deficyty neurologiczne i elektrofizjologię, a ilościowe testy czucia kwantyfikują zmiany funkcjonalne w celu wykrycia neuropatii. Jednak najwcześniejsze uszkodzenia zdają się dotyczyć małych włókien, podczas gdy testy te oceniają przede wszystkim dysfunkcję dużych włókien i mają ograniczoną zdolność do wykazania regeneracji oraz naprawy. Jedynymi technikami pozwalającymi na bezpośrednie badanie uszkodzeń i naprawy niezmielinizowanych włókien nerwowych są biopsja nerwu łydkowego z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej oraz biopsja punch skóry. Obie te metody są jednak procedurami inwazyjnymi, wymagającymi czasochłonnych procedur laboratoryjnych i znacznej wiedzy specjalistycznej. Konfokalna mikroskopia rogówki jest nieinwazyjną techniką kliniczną, która umożliwia obrazowanie włókien nerwowych rogówki in-vivo.

HRT III- Rostock Corneal Module (RCM)

Instrukcja obsługi

1. Przygotowanie kamery

Pierwszym krokiem w badaniu z wykorzystaniem HRT jest przygotowanie końcówki obiektywu.

1. W pierwszej kolejności w tubusie obiektywu kamery skanującej laserowo ustaw refrakcję na +12 dioptrii, a następnie przesuń kamerę do najniższej pozycji.
2. Nanieś na końcówkę soczewki dużą, jednorodną, pozbawioną pęcherzyków powietrza kroplę żelu Viscotears o wielkości ziarnka grochu.
3. Wyjmij TomoCap ze sterylnego opakowania i zamocuj go na końcówce soczewki w taki sposób, aby żel utworzył menisk między soczewką obiektywu a nakładką. Dociśnij go tak daleko, jak to możliwe, do uchwytu. Podczas montażu należy uważać, aby nie dotknąć przedniej powierzchni TomoCap.
   
   Rycina 1. Przygotowanie końcówki soczewki obiektywu (góra) – nakładanie żelu viscotear (dół) – zakładanie TomoCap.
4. Przesuń kamerę skanującą laserowo tak daleko w tył, jak to możliwe, na uchwycie kamery.
5. Zarówno wewnętrzna, jak i zewnętrzna powierzchnia TomoCap pojawiają się jako jasne odbicie laserowe. Koło regulacji płaszczyzny ogniskowej należy obracać do momentu zaobserwowania jasnego odbicia, co wskazuje, że soczewka jest ogniskowana w przedniej części nakładki. Wartość głębokości wyświetlana na ekranie pozycji ogniskowania powinna teraz znajdować się w zakresie od -150 μm do +150 μm.
6. Zresetuj ustawienie głębokości do zera.
   
   Rycina 2. Regulacja płaszczyzny ogniskowej.

2. Przygotowanie pacjenta

Oczy badanego znieczula się za pomocą kropli 0,4% chlorowodorku benoksynatu, a w celu nawilżenia przedniej powierzchni oka stosuje się preparat Viscotears.
Badanego sadza się wygodnie z podbródkiem opartym o podstawkę i prosi o mocne dociśnięcie czoła do poprzeczki stabilizującej.

Rysunek 3. Przygotowanie pacjenta

3. Ustawianie kamery

Badanie jest łatwiejsze, jeśli poprosi się pacjenta o fiksację wzroku na zewnętrznym świetle fiksacyjnym za pomocą oka, którego nie bada się w danej chwili. Kompaktowy rozmiar głowicy mikroskopu sprawia, że oko przeciwległe badanego nie jest zasłonięte, co umożliwia zastosowanie tarcz testowych w odległości.

Rycina 4. Obiektyw modułu rogówkowej.

1. Ustaw kamerę CCD tak, aby jej oś optyczna przebiegała prostopadle do osi optycznej kamery skanującej laserowo. Kamera powinna znajdować się po prawej stronie pacjenta podczas obrazowania prawego oka i odwrotnie.
   W tej pozycji przednia powierzchnia TomoCap powinna znajdować się w centrum obrazu na żywo z kamery CCD.
2. Przesuń kamerę skanującą laserowo w stronę pacjenta, aż rogówka pacjenta znajdzie się w odległości około 5 do 10 mm od TomoCap, a następnie przesuwaj kamerę skanującą laserowo w górę/dół i w lewo/prawo za pomocą czarnych pokręteł na uchwycie kamery, aż TomoCap zostanie ustawiony w centrum rogówki pacjenta. Na tym etapie można sprawdzić, czy czerwone światło lasera znajduje się w centrum rogówki, a w celu precyzyjnej regulacji należy obserwować odbicie wiązki lasera od rogówki widoczne na obrazie z kamery CCD. Odbicie to musi występować dokładnie w biegunie przednim rogówki.
   
   Rycina 5. Wyrównanie wiązki lasera w biegunie przednim rogówki w celu zarejestrowania obrazów centralnych rogówki.
3. Poproś pacjenta o otwarcie oka tak szeroko, jak to możliwe. Powoli przesuwaj kamerę skanującą laserowo w stronę pacjenta, aż TomoCap zetknie się z rogówką pacjenta. Jeśli konieczna jest korekta pozycji kamery skanującej laserowo, najpierw odsuń kamerę od pacjenta, wykonaj korektę, a następnie ponownie przesuń ją do przodu, aby zetknęła się z rogówką.
   
   Rycina 6. Demonstracja cienkiego mostka żelowego między TomoCap a rogówką.
4. Wystarczy minimalny kontakt między kamerą a rogówką. Przy optymalnym ustawieniu na obrazie na żywo z kamery CCD widoczny jest cienki mostek żelowy między TomoCap a rogówką.

Jeśli naciśniesz TomoCap lub przesuniesz rogówkę zbyt blisko kamery, na obrazie z kamery CCD w czasie rzeczywistym będzie widoczny ucisk rogówki, która przyjmie spłaszczony wygląd. Również na uzyskanych obrazach pojawi się linia wskazująca miejsce ucisku, dlatego nie należy wywierać zbyt dużego nacisku na rogówkę. Po nawiązaniu kontaktu nie zmieniaj położenia zagłówka, aby uniknąć przesunięcia rogówki po TomoCap.

Rysunek 7. (po lewej) Wygląd zmarszczki powstałej w wyniku wywarcia nadmiernego nacisku na rogówkę przez TomoCap; (po prawej) Obraz o prawidłowym wyglądzie bez nadmiernego nacisku.

4. Badanie pacjenta

Po wybraniu pola widzenia należy włączyć kamerę laserową HRT III, co spowoduje wyświetlenie na ekranie okna akwizycji obrazu. Na podstawie obrazu CCD należy odpowiednio ustawić TomoCap oraz wiązkę lasera na rogówce pacjenta. Następnie można rozpocząć badanie w wybranym trybie.

Rysunek 8. Tryb wyświetlania na monitorze podczas akwizycji obrazów.

Sposób akwizycji

W trybie sekcji obraz jest pozyskiwany i zapisywany za każdym razem po naciśnięciu przełącznika nożnego. Trybu tego używamy do rejestrowania obrazów całej warstwy rogówki, w tym błony Bowmana w centrum rogówki. Po zarejestrowaniu odpowiedniej liczby obrazów można wypróbować pozostałe tryby, w tym sekwencyjny i wolumetryczny.

Rycina 9. Ekran z wyborem różnych trybów akwizycji obrazu.

Dzięki funkcji skanowania sekwencyjnego (Sequence scan) można pozyskać sekwencję do 100 obrazów z regulowaną częstotliwością klatek. Można wybrać częstotliwość od 30 do 1 klatki na sekundę (fps), co w tym trybie pozwala na zarejestrowanie filmu o czasie trwania od 3 do 100 sekund.

W trybie skanowania objętościowego kamera automatycznie wykonuje serię 40 obrazów w kolejnych płaszczyznach ogniskowania. Przy użyciu soczewki pola „FOV 400 μm” można zeskanować całkowitą głębokość 85 μm, a odległość ogniskowa między dwoma kolejnymi obrazami wynosi około 2.1 μm.

Po wykonaniu kilku skanów można zmienić płaszczyznę ogniskowania obiektywu, aby zmierzyć głębokość warstwy komórek rogówki względem powierzchni rogówki, ustawiając ostrość na warstwie komórek nabłonka, a następnie klikając przycisk Reset, aby ustawić wartość głębokości na 0.

Na potrzeby niniejszego badania uzyskujemy obrazy z centralnej części rogówki na różnych głębokościach. W związku z tym nie przemieszczamy skanującej kamery laserowej w poziomie ani w pionie po rogówce, lecz poruszamy nią jedynie w przód i w tył, rejestrując obrazy ze wszystkich głębokości błony Bowmana w tym samym punkcie rogówki. Odległość między poszczególnymi obrazami wynosi około 1 μm; zatem, jeśli głębokość błony Bowmana wynosi 10 μm, otrzymamy 10 obrazów. Do analizy końcowej wybieramy jednak obrazy w odstępach około 2-3 μm.

Po zakończeniu badania wyłącz kamerę, klikając przycisk zasilania kamery w oknie akwizycji. Poinformuj pacjenta, aby nie pocierał oczu do czasu ustąpienia działania znieczulenia miejscowego. W ramach środków ostrożności można przeprowadzić badanie rogówki pacjenta za pomocą lampy szczelinowej po zakończeniu procedury.

Zdejmij TomoCap z kamery i go zutylizuj, a następnie wyczyść obiektyw mikroskopu za pomocą patyczka watnego zwilżonego wodą destylowaną.

5. Analiza badania

a. Wybór klatek

Aby przejrzeć i przeanalizować istniejące badania, w oknie bazy danych należy wybrać odpowiednią dokumentację pacjenta. Okno przeglądania obrazów zapewnia przegląd istniejących badań rogówki dla wybranego pacjenta. Badania wykonane w różne dni są przechowywane w oddzielnych kartach wizyt. Trzy różne typy skanowania są reprezentowane przez trzy różne ikony w karcie wizyty rogówki HRT III w oknie przeglądania obrazów programu Heidelberg Eye Explorer.

Aby przejrzeć obraz rogówki, należy dwukrotnie kliknąć odpowiednią ikonę obrazu, a funkcja „Show” otworzy następujące okno:

Rysunek 10. Wyświetlenie wszystkich zarejestrowanych obrazów po badaniu.

Rycina 11. Wyświetlanie wybranego obrazu przed eksportem z widokiem oka z kamery CCD w celu potwierdzenia prawidłowego wyrównania.

Aby wyeksportować odpowiednie obrazy do dalszej analizy, kliknij „Export” na pasku narzędzi, a następnie wybierz folder, w którym chcesz zapisać obrazy.

Pozyskujemy i rejestrujemy obrazy ze wszystkich warstw rogówki dla każdego pacjenta, jednak ponieważ głównym celem niniejszych badań jest warstwa Bowmana i nerwy rogówki, analizie poddane zostaną jedynie obrazy z tej warstwy. Dla każdego badanego wybieramy 5-6 klatek z warstwy Bowmana na różnych głębokościach rogówki.

Rysunek 12. Obraz wszystkich warstw rogówki u zdrowego badanego.

Do pomiarów ilościowych i analizy wybiera się losowo średnio 5-6 klatek z warstwy Bowmana w centrum rogówki na różnych głębokościach.

b. Analiza obrazów

Do analizy obrazów warstwy Bowmana centralnej rogówki zarejestrowanych za pomocą HRT III wykorzystujemy specjalistyczne oprogramowanie opracowane w naszej grupie o nazwie „CCM Image Analysis Tools v 0.6”.

Za pomocą tego oprogramowania mierzone są cztery główne parametry nerwów rogówki:

• Gęstość włókien nerwowych (NFD), definiowana jako liczba głównych nerwów na klatkę obrazu.
• Gęstość odgałęzień nerwowych (NBD), czyli liczba głównych odgałęzień na klatkę obrazu.
• Długość włókien nerwowych (NFL), stanowiąca całkowitą długość wszystkich nerwów na klatkę obrazu.
• Krętość włókien nerwowych (NFT) głównych nerwów na klatkę obrazu.

Aby otworzyć obraz CCM, przejdź do pliku > otwórz.

• Po załadowaniu obrazu jego rozmiar i typ są wyświetlane w polu informacji o obrazie (Image Information Box) w lewym górnym rogu panelu sterowania.
• Domyślna skala jest wyświetlana w linii edycji informacji o obrazie. Jeśli skala jest inna, należy zmienić wartość w linii edycji.
• Aby rozpocząć analizę obrazu, należy wybrać parametr do pomiaru z pola miar (Metric Box) w prawym górnym rogu panelu sterowania.
• W polu wyników na dole strony liczba NFD oraz NBD jest przedstawiona jako wartość bezwzględna, NFL w mm, a krętość jako współczynnik krętości (TC).
• Jednakże po wyeksportowaniu wyników do arkusza Excel, wyniki dla NFD i NBD zostaną przedstawione w no/mm², a dla NFL w mm/mm².
• W tym celu po zakończeniu pomiarów należy kliknąć Dodaj pomiary (Add measurements), następnie przejść do Plik > Zapisz jako i otworzyć zapisane wyniki w programie Excel.

Rysunek 13. Wyświetlenie obrazu nerwów rogówki z obrysowaniem w narzędziu analitycznym przy użyciu „CCM Image Analysis Tool”.

6. Reprezentatywne wyniki:

Wykazaliśmy postępujący wzrost degeneracji nerwów rogówki wraz ze zwiększającą się ciężkością neuropatii cukrzycowej ¹ oraz wczesne uszkodzenia nerwów w cukrzycy, które wyprzedzają utratę wewnątrzepidermalnych włókien nerwowych w biopsjach skóry ², wraz ze stratyfikacją stopnia nasilenia neuropatii i regeneracją po transplantacji trzustki ³ u pacjentów z cukrzycą. Wykazaliśmy również uszkodzenia nerwów w idiopatycznej neuropatii małych włókien ⁴ oraz w chorobie Fabry ⁵.

Rysunek 14. Obrazy z konfokalnej mikroskopii rogówki wykonane za pomocą HRT III, przedstawiające warstwę Bowmana rogówki (a) u osoby z grupy kontrolnej w porównaniu do (b) pacjenta z neuropatią i ciężkim uszkodzeniem nerwów.

Dyskusja

Konfokalna mikroskopia rogówki (CCM) to nieinwazyjna technika kliniczna, która może być wykorzystywana do wykrywania wczesnych uszkodzeń nerwów oraz ilościowej oceny patologii małych włókien w neuropatiach obwodowych, w tym w cukrzycy, chorobie Fabry oraz idiopatycznych neuropatiach małych włókien (ISFN). Bezpośredni wpływ kliniczny tej techniki stanowi ogromny skok naprzód w zakresie naszych możliwości diagnostycznych, monitorowania progresji oraz oceny odpowiedzi na leczenie u pacjentów z neuropatią cukrzycową i innymi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Urządzenie HRT III CCM - Moduł Rogówki z Rostocka			Heidelberg Engineering
Oprogramowanie do analizy obrazów CCM v0.6			University of Manchester