Mikroskopia konfokalna rogówki jest nieinwazyjną techniką kliniczną, która może być wykorzystana do ilościowej oceny uszkodzeń włókien C w celu diagnozy i stratyfikacji pacjentów z rosnącym stopniem nasilenia neuropatii.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Konfokalna mikroskopia rogówki: Nowoczesna nieinwazyjna metoda ilościowej oceny patologii małych włókien w neuropatiach obwodowych
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dokładna kwantyfikacja neuropatii obwodowej jest istotna dla zdefiniowania pacjentów z grupy ryzyka, przewidywania pogorszenia stanu zdrowia oraz oceny nowych terapii. Metody konwencjonalne oceniają deficyty neurologiczne i elektrofizjologię, a ilościowe testy sensoryczne kwantyfikują zmiany funkcjonalne w celu wykrycia neuropatii. Jednakże najwcześniejsze uszkodzenia wydają się dotyczyć małych włókien, podczas gdy testy te oceniają przede wszystkim dysfunkcję dużych włókien i mają ograniczoną zdolność do wykazania regeneracji i naprawy. Jedynymi technikami umożliwiającymi bezpośrednie badanie uszkodzeń i naprawy nieumielinowanych włókien nerwowych są biopsja nerwu łydkowego z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej oraz biopsja punch skóry. Obie te metody są jednak procedurami inwazyjnymi, wymagają czasochłonnych procedur laboratoryjnych i znacznej wiedzy specjalistycznej. Konfokalna mikroskopia rogówki jest nieinwazyjną techniką kliniczną, która zapewnia obrazowanie włókien nerwowych rogówki in-vivo. Wykazaliśmy wczesne uszkodzenia nerwów, które wyprzedzają utratę wewnątrzepidermalnych włókien nerwowych w biopsjach skóry, wraz ze stratyfikacją stopnia nasilenia neuropatii i naprawy po przeszczepieniu trzustki u pacjentów z cukrzycą. Wykazaliśmy również uszkodzenia nerwów w idiopatycznej neuropatii małych włókien oraz w chorobie Fabry'ego.
Protokół
Wprowadzenie:
Dokładne ilościowe określenie stopnia neuropatii obwodowej jest istotne dla zdefiniowania pacjentów z grup ryzyka, przewidywania pogorszenia stanu zdrowia oraz oceny nowych terapii. Metody konwencjonalne oceniają deficyty neurologiczne i elektrofizjologię, a ilościowe badania czucia pozwalają określić zmiany funkcjonalne w celu wykrycia neuropatii. Jednakże najwcześniejsze uszkodzenia dotyczą najprawdopodobniej małych włókien, podczas gdy testy te oceniają głównie dysfunkcję dużych włókien i mają ograniczoną zdolność do wykazania regeneracji oraz naprawy. Jedynymi technikami umożliwiającymi bezpośrednią ocenę uszkodzeń i naprawy nieumielinowanych włókien nerwowych są biopsja nerwu suralnego z badaniem w mikroskopii elektronowej oraz biopsja punch skóry. Obie te metody są jednak procedurami inwazyjnymi, wymagającymi czasochłonnych analiz laboratoryjnych i znacznego doświadczenia. Konfokalna mikroskopia rogówki jest nieinwazyjną techniką kliniczną, która umożliwia obrazowanie włókien nerwowych rogówki in-vivo.
HRT III- Rostock Corneal Module (RCM)
Instrukcja obsługi
1. Przygotowanie kamery
Pierwszym krokiem w badaniu z użyciem HRT jest przygotowanie końcówki obiektywu.
- Najpierw w tubusie obiektywu kamery skanującej laserowo ustaw refrakcję na +12 dioptrii, a następnie przesuń kamerę do najniższej pozycji.
- Nanieś na końcówkę soczewki dużą, jednorodną, pozbawioną pęcherzyków powietrza kroplę żelu Viscotears o wielkości ziarnka grochu.
- Wyjmij TomoCap ze sterylnego opakowania i zamocuj go na końcówce soczewki w taki sposób, aby żel utworzył menisk między soczewką obiektywu a nakładką. Przesuń go tak daleko, jak to możliwe, w stronę uchwytu. Należy uważać, aby podczas montażu nie dotknąć przedniej powierzchni TomoCap.
Rycina 1. Przygotowanie końcówki soczewki obiektywu (góra), nakładanie żelu viscotear (dół), nakładanie TomoCap. - Przesuń kamerę skanującą laserowo tak daleko w tył, jak to możliwe, na uchwycie kamery.
- Zarówno wewnętrzna, jak i zewnętrzna powierzchnia TomoCap pojawiają się jako jasne odbicia laserowe. Koło regulacji płaszczyzny ogniskowej należy obracać do momentu zaobserwowania jasnego odbicia, co wskazuje, że soczewka jest ogniskowana w przedniej części nakładki. Wartość głębokości wyświetlana w wskaźniku pozycji ogniskowania powinna teraz wynosić od -150 μm do +150 μm.
- Zresetuj ustawienie głębokości do zera.
Rycina 2. Regulacja płaszczyzny ogniskowej.
2. Przygotowanie pacjenta
Oczy badanego zostają znieczulone za pomocą kropli 0,4% hydrochlorku benoksynatu, a w celu nawilżenia przedniej części oka stosuje się preparat Viscotears.
Badany zostaje wygodnie posadzony z podbródką opartą na podstawce i proszony o mocne dociśnięcie czoła do poprzeczki stabilizującej.
Rycina 3. Przygotowanie pacjenta
3. Ustawianie kamery
Badanie jest łatwiejsze, jeśli poprosimy pacjenta o utrwalenie wzroku na zewnętrznym świetle fiksacyjnym okiem, które nie jest w danej chwili badane. Kompaktowy rozmiar głowicy mikroskopu sprawia, że oko przeciwległe badanej osoby nie jest zasłonięte, co umożliwia wykorzystanie celów dystansowych.
Rysunek 4. Obiektyw modułu rogówkowej.
- Ustaw kamerę CCD w taki sposób, aby jej oś optyczna przebiegała prostopadle do osi optycznej kamery skanującej laserowo. Podczas obrazowania prawego oka kamera powinna znajdować się po prawej stronie pacjenta i odwrotnie.
W tej pozycji przednia powierzchnia TomoCap powinna znajdować się w centrum obrazu na żywo z kamery CCD. - Przesuwaj kamerę skanującą laserowo w stronę pacjenta, aż rogówka pacjenta znajdzie się w odległości około 5 do 10 mm od TomoCap, następnie przesuwaj kamerę skanującą laserowo w górę/dół i w lewo/prawo, używając czarnych pokręteł na uchwycie kamery, aż TomoCap zostanie ustawiony w centrum rogówki pacjenta. Na tym etapie można sprawdzić, czy czerwone światło laserowe znajduje się w centrum rogówki, a w celu precyzyjnej regulacji należy obserwować odbicie wiązki lasera od rogówki, które jest widoczne na obrazie z kamery CCD. Odbicie to musi wystąpić dokładnie w biegunie przednim rogówki.
Rysunek 5. Ustawienie wiązki lasera na biegunie przednim rogówki w celu wykonania centralnych obrazów rogówki. - Poproś pacjenta, aby otworzył oko tak szeroko, jak to możliwe. Powoli przesuwaj kamerę skanującą laserowo do przodu w stronę pacjenta, aż TomoCap zetknie się z rogówką pacjenta. Jeśli konieczne jest skorygowanie pozycji kamery skanującej laserowo, należy najpierw odsunąć kamerę od pacjenta, dokonać korekty, a następnie ponownie przesunąć ją do przodu, aby zetknęła się z rogówką.
Rysunek 6. Demonstracja cienkiego mostka żelowego między TomoCap a rogówką. - Wystarczający jest minimalny kontakt kamery z rogówką. Przy optymalnym ustawieniu na obrazie na żywo z kamery CCD widoczny jest cienki mostek żelowy między TomoCap a rogówką.
Jeśli naciśniesz TomoCap lub przesuniesz rogówkę zbyt blisko kamery, w obrazie na żywo z kamery CCD zauważysz ucisk rogówki, która będzie wyglądać na spłaszczoną. Podobnie na uzyskanych obrazach pojawi się linia wskazująca miejsce nacisku, dlatego nie należy wywierać zbyt silnego nacisku na rogówkę. Po nawiązaniu kontaktu nie zmieniaj położenia zagłówka, aby uniknąć przesuwania się rogówki po TomoCap.
Rycina 7. (lewo) Wygląd strie z powodu zastosowania nadmiernego nacisku na rogówkę przez TomoCap; (prawo) Obraz o normalnym wyglądzie bez nadmiernego nacisku.
4. Badanie pacjenta
Po wybraniu pola widzenia należy włączyć kamerę laserową HRT III, wówczas na ekranie pojawi się okno akwizycji obrazu. Na podstawie obrazu CCD należy ustawić TomoCap oraz światło laserowe na rogówce pacjenta. Następnie można rozpocząć badanie w wybranym trybie.
Rysunek 8. Tryb wyświetlania na monitorze podczas akwizycji obrazów.
Sposób akwizycji
W trybie przekroju (section mode) pojedynczy obraz jest rejestrowany i zapisywany przy każdym naciśnięciu przełącznika nożnego. Trybu tego używamy do przechwytywania obrazów całej warstwy rogówki, w tym warstwy Bowmana w centrum rogówki. Po zarejestrowaniu odpowiedniej liczby obrazów można wypróbować pozostałe tryby, w tym sekwencyjny (sequence) i wolumetryczny (volume).
Rysunek 9. Ekran z wyborem różnych trybów akwizycji obrazu.
Dzięki funkcji Sequence scan można zarejestrować sekwencję do 100 obrazów z regulowaną częstotliwością klatek. Można wybrać częstotliwość od 30 do 1 klatki na sekundę (fps), co w tym trybie pozwala na nagranie filmu o czasie trwania od 3 do 100 sekund.
W trybie skanowania objętościowego kamera automatycznie wykonuje serię 40 obrazów w kolejnych płaszczyznach ogniskowania. Przy zastosowaniu soczewki pola „FOV 400 μm” można zeskanować całkowitą głębokość 85 μm, a odległość ogniskowa między dwoma kolejnymi obrazami wyniesie około 2,1 μm.
Po wykonaniu kilku skanów można zmienić płaszczyznę ogniskowania obiektywu, aby zmierzyć głębokość warstwy komórek rogówki względem jej powierzchni, ustawiając ostrość na warstwie komórek nabłonka, a następnie klikając przycisk Reset w celu ustawienia wartości głębokości na 0.
Na potrzeby niniejszego badania uzyskujemy obrazy z centralnej części rogówki na różnych głębokościach. W związku z tym nie przesuwamy skaningowej kamery laserowej poziomo ani pionowo po rogówce, lecz jedynie przemieszczamy ją w przód i w tył, rejestrując obrazy ze wszystkich głębokości błony Bowmana w tym samym punkcie rogówki. Odległość między poszczególnymi obrazami wynosi około 1 μm; zatem jeśli głębokość błony Bowmana wynosi 10 μm, uzyskamy 10 obrazów. Jednak do końcowej analizy wybieramy obrazy z odstępem około 2-3 μm między nimi.
Po zakończeniu badania wyłącz kamerę, klikając przycisk zasilania kamery w oknie akwizycji. Poinformuj pacjenta, aby nie pocierał oczu do czasu ustąpienia działania znieczulenia miejscowego. W ramach środków ostrożności można przeprowadzić badanie rogówki pacjenta za pomocą lampy szczelinowej po zakończeniu procedury.
Zdejmij TomoCap z kamery i go wyrzuć, a następnie oczyść soczewkę mikroskopu za pomocą patyczka higienicznego zwilżonego wodą destylowaną.
5. Analiza badania
a. Wybór klatek
Aby przejrzeć i przeanalizować istniejące badania, w oknie bazy danych należy wybrać odpowiednią dokumentację pacjenta. Okno przeglądania obrazów zapewnia przegląd istniejących badań rogówki dla wybranego pacjenta. Badania wykonane w różne dni są przechowywane w oddzielnych kartach wizyt. Trzy różne typy skanowania są reprezentowane przez trzy różne ikony w karcie wizyt rogówki HRT III w oknie przeglądania obrazów programu Heidelberg Eye Explorer.
Aby przejrzeć obraz rogówki, należy dwukrotnie kliknąć odpowiednią ikonę obrazu, wówczas funkcja „Show” otworzy następujące okno:
Rycina 10. Wyświetlenie wszystkich zarejestrowanych obrazów po badaniu.
Rycina 11. Wyświetlanie wybranego obrazu przed eksportem z widokiem oka z kamery CCD w celu wykazania prawidłowego ustawienia.
Aby wyeksportować odpowiednie obrazy do dalszej analizy, kliknij „Export” na pasku narzędzi, a następnie wybierz folder, w którym chcesz zapisać obrazy.
Dla każdego pacjenta pozyskujemy i rejestrujemy obrazy ze wszystkich warstw rogówki, jednak ponieważ głównym celem niniejszych badań jest warstwa Bowmana i nerwy rogówki, analizowane będą jedynie obrazy z tej warstwy. Dla każdego badanego wybieramy 5-6 klatek z warstwy Bowmana na różnych głębokościach rogówki.
Rycina 12. Prezentacja wszystkich warstw rogówki u zdrowego osobnika.
Średnio 5-6 klatek z warstwy Bowmana w centrum rogówki na różnych głębokościach jest wybieranych losowo do pomiarów ilościowych i analizy.
b. Analiza obrazów
Do analizy obrazów warstwy Bowmana centralnej rogówki wykonanych za pomocą HRT III wykorzystujemy specjalistyczne oprogramowanie opracowane w naszej grupie o nazwie „CCM Image Analysis Tools v 0.6”.
Za pomocą tego oprogramowania mierzy się cztery główne parametry nerwów rogówki:
- Gęstość włókien nerwowych (NFD), definiowana jako liczba głównych nerwów na kadr.
- Gęstość odgałęzień nerwowych (NBD), liczba głównych odgałęzień na kadr.
- Długość włókien nerwowych (NFL), która stanowi całkowitą długość wszystkich nerwów na kadr.
- Krętość włókien nerwowych (NFT) głównych nerwów na kadr.
Aby otworzyć obraz CCM, przejdź do Plik > Otwórz.
- Po załadowaniu obrazu jego rozmiar i typ są wyświetlane w polu informacji o obrazie (Image Information Box) w lewym górnym rogu panelu sterowania.
- Domyślna skala jest wyświetlana w linii edycji informacji o obrazie. Jeśli skala jest inna, należy zmienić wartość w linii edycji.
- Aby rozpocząć analizę obrazu, należy wybrać z pola metryk (Metric Box) w prawym górnym rogu panelu sterowania parametr, który ma zostać zmierzony.
- W polu wyników na dole strony liczba NFD i NBD jest przedstawiona jako wartość bezwzględna, NFL w mm, a krętość jako współczynnik krętości (TC).
- Jednak po wyeksportowaniu wyników do arkusza Excel, wyniki dla NFD i NBD zostaną przedstawione w no/mm2, a dla NFL w mm/mm2.
- W tym celu, po zakończeniu pomiarów, należy kliknąć Dodaj pomiary (Add measurements), przejść do Plik > Zapisz jako, a następnie otworzyć zapisane wyniki w programie Excel.
Rysunek 13. Prezentacja obrazu nerwu rogówki z obrysem w narzędziu analitycznym przy użyciu „CCM Image Analysis Tool”.
6. Reprezentatywne wyniki:
Wykazaliśmy postępujący wzrost degeneracji nerwów rogówki wraz ze zwiększającym się stopniem nasilenia neuropatii cukrzycowej 1 oraz wczesne uszkodzenia nerwów w cukrzycy, które wyprzedzają utratę wewnątrzepidermalnych włókien nerwowych w biopsjach skóry 2, wraz ze stratyfikacją nasilenia neuropatii i regeneracją po transplantacji trzustki 3 u pacjentów z cukrzycą. Wykazaliśmy również uszkodzenia nerwów w idiopatycznej neuropatii małych włókien 4 oraz w chorobie Fabry 5.
Rycina 14. Obrazy z konfokalnej mikroskopii rogówki wykonane za pomocą HRT III warstwy Bowmana rogówki: (a) osoba z grupy kontrolnej w porównaniu do (b) pacjenta z neuropatią i ciężkim uszkodzeniem nerwów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Konfokalna mikroskopia rogówki (CCM) to nieinwazyjna technika kliniczna, która może być wykorzystywana do wykrywania wczesnych uszkodzeń nerwów oraz ilościowej oceny patologii małych włókien w neuropatiach obwodowych, w tym w cukrzycy, chorobie Fabry oraz idiopatycznych neuropatiach małych włókien (ISFN). Bezpośredni wpływ kliniczny tej techniki stanowi ogromny skok naprzód w zakresie naszych możliwości diagnostycznych, monitorowania progresji oraz oceny odpowiedzi na leczenie u pacjentów z neuropatią cukrzycową i innymi...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Ryciny 4 - 6: Dzięki uprzejmości Heidelberg Engineering
Podziękowania
Niniejsza praca była wspierana przez Juvenile Diabetes Research Foundation International (grant 17-2008-1031) oraz National Institutes of Health (grant 1R01DK077903-01A1).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Urządzenie HRT III CCM - Moduł Rogówki z Rostocka | Heidelberg Engineering | ||
| Oprogramowanie do analizy obrazów CCM v0.6 | University of Manchester |
Bibliografia
- Abbott, C. A., Kallinikos, P., Marshall, A., Finnigan, J., Morgan, P., Efron, N., Boulton, A. J. M., Malik, R. A. Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Test to Diagnose and Assess Progression of Human Diabetic Neuropathy. Diabetes Care. 33, 1792-1797 (2010).
- Quattrini, C., Tavakoli, M., Jeziorska, M., Kallinikos, P., Tesfaye, S., Marshall, A., Finnigan, J., Boulton, A. J. M., Efron, N., Malik, R. A. Surrogate Markers of Small Fiber Damage in Human Diabetic Neuropathy. Diabetes. 56, 2148-2154 (2007).
- Mehra, S., Tavakoli, M., Efron, N., Boulton, A. J. M., Augustine, T., Malik, R. A. Corneal Confocal Microscopy Detects Early Nerve Regeneration After Pancreas Transplantation in Patients with Type 1 Diabetes. Diabetes Care. 30, 2608-2612 (2007).
- Tavakoli, M., Marshall, A., Pitceathly, R., Fadavi, H., Gow, D., Roberts, M. E., Efron, N., Boulton, A. J. M., Malik, R. A. Corneal confocal microscopy: A novel means to detect nerve fibre damage in patients with impaired glucose tolerance and idiopathic small fibre neuropathy. Experimental Neurology. 223, 245-250 (2010).
- Tavakoli, M., Marshall, A., Thompson, L., Kenny, M., Waldek, S., Efron, N., Malik, R. A. Corneal confocal microscopy: A novel technique to detect small-fibre neuropathy in patients with Fabry disease. Muscle & Nerve. 40, 976-984 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
