Wzrost i różnicowanie dorosłych komórek macierzystych neuronów hipokampa wiewiórki syberyjskiej

Podsumowanie

Neuronalne komórki macierzyste przygotowano z hipokampa dorosłych, niehibernujących, rocznych wiewiórek arktycznych (AGS). Komórki te można namnażać w wielu pasażach, różnicować i utrzymywać jako kulturę neuronów i gleju w stosunku bliskim 50:50.

Streszczenie

Wiewiórki amerykańskie z rodzaju Urocitellus (Urocitellus parryii, AGS) wyróżniają się unikalną zdolnością do hibernacji przy temperaturze rdzeniowej ciała bliskiej lub poniżej punktu zamarzania ¹. Zwierzęta te wykazują również odporność na uszkodzenia niedokrwienne mózgu in vivo ^2,3 oraz na deprywację tlenowo-glukozową in vitro ^4,5. Te wyjątkowe właściwości stały się impulsem do izolacji neuronów AGS w celu zbadania wrodzonych cech neuronalnych, które mogłyby wyjaśniać zdolność neuronów AGS do opierania się uszkodzeniom i śmierci komórkowej wywołanej niedokrwieniem oraz ekstremalnie niskimi temperaturami. Identyfikacja białek lub genów odpowiedzialnych za te charakterystyczne właściwości komórek mogłaby pomóc w opracowaniu skutecznych terapii dla szeregu wskazań niedokrwiennych oraz w badaniu tolerancji zimna. Hipokamp dorosłych AGS zawiera komórki macierzyste neuronów, które nadal proliferują, co umożliwia łatwą ekspansję tych komórek w hodowli. Opisujemy tutaj metody, dzięki którym badacze mogą wykorzystać te komórki macierzyste oraz zróżnicowane neurony w wielu celach. Ścisłe przestrzeganie tych kroków pozwala na namnożenie neuralnych komórek macierzystych AGS przez dwa lub więcej pasaże, a następnie ich zróżnicowanie do kultury o wysokiej zawartości neuronów TUJ1-dodatnich (~50%) bez użycia toksycznych chemikaliów w celu zminimalizowania liczby dzielących się komórek. Niedokrwienie indukuje neurogenezę ⁶, a neurogeneza przebiegająca przez szlaki przeżycia MEK/ERK i PI3K/Akt przyczynia się do odporności na niedokrwienie in vivo⁷ oraz in vitro ⁸ (Kelleher-Anderson, Drew et al., w przygotowaniu). Dalsza charakterystyka tych wyjątkowych komórek neuralnych może przynieść postępy na wielu polach, przy zastosowaniu niektórych lub wszystkich opisanych metod.

Protokół

1. Przygotowanie neuralnych komórek macierzystych AGS oraz pożywek

1. Neuralne komórki macierzyste (NSC) z hipokampa dorosłego wiewiórkasa syberyjskiego (AGS), izolowane w sposób opisany wcześniej⁹, są obecnie dostępne w sprzedaży jako fiolki kriokonserwowane. Komórki są transportowane w ciągu jednej doby w izolowanych opakowaniach z suchym lodem, aby zapewnić ich utrzymanie w stanie kriokonserwowanym. W celu zachowania integralności komórek, należy je rozpakować natychmiast po otrzymaniu i przechowywać w temperaturze poniżej -150°C lub w fazie parowej ciekłego azotu w naczyniu Dewara.
2. Przygotować podłoże podstawowe agsNSC + 5% FBS, dodając 5 mL FBS (LS-1012) do 95 mL podłoża podstawowego agsNSC.
3. Przygotować podłoże ekspansyjne agsNSC, dodając 500 μL suplementu B-27 (Invitrogen) do 50 mL podłoża podstawowego agsNSC. Pozostałą część suplementu B27 podzielić na aliquoty po 1 mL i przechowywać w temperaturze -20°C do czasu użycia.
4. Podgrzać 25 mL podłoża podstawowego agsNSC + 5% FBS oraz 20 mL podłoża ekspansyjnego agsNSC w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C.
5. Pokryć flaszki używane do ekspansji poli-L-ornityną:
   1. Rozmrozić roztwór roboczy poli-L-ornityny (10 μg/mL). Po rozmrożeniu przechowywać roztwór w temperaturze 2-8°C przez maksymalnie jeden miesiąc.
   2. Do jednej wentylowanej flaszki T-75 dodać 8 mL roztworu roboczego poli-L-ornityny i równomiernie rozprowadzić go po całej powierzchni hodowlanej flaszki. (Dostosować ilość roztworu roboczego do innych używanych naczyń hodowlanych. Stosować 0,5 - 1,0 mL roztworu roboczego poli-L-ornityny na każde 10 cm² powierzchni hodowlanej).
   3. Inkubować flaszki w temperaturze 37°C przez minimum 24 godziny. (Do inkubacji naczyń hodowlanych pokrytych poli-L-ornityną zaleca się stosowanie inkubatora bez dodatku CO₂). Pokryte flaszki można przechowywać w inkubatorze do dwóch tygodni.
   4. Przed użyciem odessać roztwór roboczy poli-L-ornityny z flaszki i dwukrotnie przemyć ją sterylną wodą klasy do hodowli tkanek. Odessać ciecz tak, aby przed użyciem flaszka była prawie sucha.
6. Wyjąć fiolkę z naczynia Dewara i sprawdzić, czy korek jest szczelnie zamknięty. Trzymając fiolkę za górną część, zanurzyć dolną połowę w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez około 60-90 sekund lub do momentu, gdy fiolka zostanie niemal całkowicie rozmrożona; wciąż powinna być widoczna niewielka ilość lodu. Aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia, nie zanurzać korka fiolki w wodzie. Nie rozmrażać nadmiernie, ponieważ może to uszkodzić komórki.
7. Spryskać zewnętrzną stronę fiolki 70% etanolem lub izopropanolem, a następnie umieścić fiolkę w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Ostrożnie zdjąć korek, aby uniknąć zanieczyszczenia lub rozprysków.
8. Delikatnie resuspendować komórki w fiolce, dodając za pomocą sterylnej pipety 1 mL podłoża podstawowego agsNSC + 5% FBS. Przenieść resuspendowane komórki do 25 mL ciepłego podłoża podstawowego agsNSC + 5% FBS w probówce wiriórce o pojemności 50 mL.
9. Jednokrotnie przepłukać kriofiolkę rozcieńczoną zawiesiną komórkową. Wirować komórki przy 150 x g przez 6 minut. Dla uzyskania najlepszych rezultatów należy obliczyć prędkość dla każdego konkretnego typu wirówki.
10. W czasie wirowania dodać 10 mL podłoża ekspansyjnego agsNSC do suchej, pokrytej poli-L-ornityną flaszki T-75 oraz dodać 40 μL rh FGF-basic (40ng/mL). Po wirowaniu odessać supernatant, uważając, aby nie odessać osadu komórkowego. Resuspendować komórki w 10 mL podłoża ekspansyjnego agsNSC. Przenieść resuspendowane komórki w podłożu ekspansyjnym agsNSC do podłoża we flaszce T-75.
11. Delikatnie kołysać naczyniem hodowlanym z boku na bok, aby równomiernie rozmieścić komórki w naczyniu.
12. Umieścić zasiałe naczynie hodowlane w inkubatorze w temperaturze 37°C i przy 5% CO₂. Komórki powinny przytwierdzić się do flaszki i zacząć tworzyć wypustki w ciągu dwóch godzin od zasiaania. Jeśli komórki pozostają w zawiesinie i tworzą skupiska w podłożu, należy ponownie odwirować komórki w 5% FBS i powtórzyć kroki 1.8-1.10 z użyciem świeżego podłoża i flaszki.

2. Namnażanie AgsNSC

1. Dwa dni (~48 godzin) po rozmrożeniu i wysianiu komórek należy przeprowadzić pełną wymianę medium, używając 20 mL agsNSC Expansion Medium z dodatkiem 40 μL rh FGF-basic.
2. W dniu następującym po inokulacji należy dodać do kolb 40 μL rh FGF-basic. Komórki będą gotowe do trypsynizacji, gdy osiągną 75-80% konfluencji w trzecim lub czwartym dniu po inokulacji. Nie zaleca się hodowli nieróżnicujących się komórek macierzystych przez więcej niż 4 dni po inokulacji, ponieważ dłuższa inkubacja może doprowadzić do rozpoczęcia różnicowania komórek w neurony, które mogą ulec uszkodzeniu podczas trypsynizacji w kroku 3. rh FGF-basic można przechowywać w temperaturze 4°C do jednego tygodnia bez utraty aktywności. W razie potrzeby rh FGF-basic może zostać poddany jednemu dodatkowemu cyklowi zamrażania i rozmrażania w temperaturze -20°C.

3. Trypsynizacja komórek

1. Pasaż agsNSC należy przeprowadzić od 3 do 4 dni po inokulacji. Jeśli agsNSC mają być ponownie namnażane, należy przygotować kolbę powleczoną poli-L-ornityną od 24 godzin do jednego tygodnia przed pasażem.
2. Odssać medium z naczynia hodowlanego. Dodać do naczynia 2,5 mL 0,05% trypsyny/0,02% EDTA (CM-0017) na każde 75 cm² powierzchni. Delikatnie zamieszać kołysząc naczyniem, aby upewnić się, że wszystkie komórki są pokryte roztworem trypsyny/EDTA. Komórki zazwyczaj zaczynają odrywać się od powierzchni w ciągu 60 sekund, w zależności od stopnia konfluencji. Nie należy nadmiernie trypsynizować, ponieważ może to uszkodzić komórki. Delikatne opukiwanie naczynia hodowlanego z kilku stron ułatwi odrywanie się komórek.
3. Po odłączeniu się komórek dodać do kolby 10 mL podstawowego medium agsNSC + 5% FBS. Delikatnie zamieszać kołysząc naczyniem, aby zneutralizować cały roztwór trypsyny. Stosując aseptyczne techniki laboratoryjne, przenieść komórki pipetą do sterylnej probówki do wirowania zawierającej 10 mL podstawowego medium agsNSC + 5% FBS. Powtórzyć czynność, płucząc kolbę ponownie 10 mL podstawowego medium agsNSC + 5% FBS i połączyć z pierwszą porcją wypłuczyn.
4. Wirować komórki przy 150 x g przez 6 minut zgodnie z powyższym opisem. Po wirowaniu komórki powinny utworzyć wyraźny, luźny pellet. Odssać zneutralizowaną trypsynę i medium z probówki do wirowania, a pellet komórkowy resuspender w 10 mL (na każdą kolbę T-75) uprzednio ogrzanego podstawowego medium agsNSC + 5% FBS, delikatnie pipetując w górę i w dół 2 razy za pomocą pipety 10 mL. Wykonać zliczanie komórek zgodnie z poniższym opisem.

4. Standardowe obliczenia wysiewu komórek

1. Stosując technikę aseptyczną, wymieszać zawiesinę komórkową i przenieść 15 μL zawiesiny do probówki do mikrowirowania. Dodać 15 μL 0,4% Trypan Blue. Delikatnie wymieszać i nanieść 10 μL zawiesiny komórkowej do każdej z komór czystego hemacytometru, takiego jak Bright Line Counting Chamber (katalog #1490: Hausser Scientific, http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm).
2. Policzyć komórki w minimum 4 kwadratach hemacytometru. Komórki zabarwione na niebiesko, wykazujące pozytywną reakcję z Trypan Blue, są martwe i nie powinny być liczone. Dla uzyskania dokładnego wyniku, optymalna liczba komórek na kwadrat powinna wynosić od 25 do 75 komórek.
3. Po policzeniu komórek obliczyć średnią z 4 kwadratów. Pomnożyć średnią liczbę komórek przez 10 000 oraz przez czynnik rozcieńczenia (2 w przypadku zastosowania zalecanych objętości), aby wyznaczyć liczbę komórek na mL. Należy pamiętać, że jeśli całkowity procent żywotności jest mniejszy niż 92%, może to mieć kilka przyczyn. Jednym z powodów niskiej żywotności może być zbyt długa trypsynizacja przed neutralizacją trypsyny za pomocą FBS. Inną przyczyną może być zbyt niskie stężenie surowicy (FBS) w stosunku do trypsyny, przez co komórki są nadal poddawane działaniu trypsyny. Po trzecie, komórki mogły osiągnąć zbyt wysoką konfluencję, co mogło spowodować różnicowanie się komórek macierzystych w wyniku kontaktu międzykomórkowego, prowadząc do uszkodzeń podczas trypsynizacji. Ścisłe przestrzeganie tej metody pozwala oczekiwać uzyskania 3 lub więcej podwojeń, co daje populację >4 000 000 komórek z początkowej liczby ~500 000.

5. Inokulacja kolejnego kolby do amplifikacji

1. Aby określić całkowitą liczbę komórek potrzebną do zaszczepienia jednego naczynia, należy pomnożyć żądaną gęstość wysiewu (6 600 komórek na cm² lub 500 000 komórek na kolbę T-75) przez powierzchnię (w cm²) naczynia przeznaczonego do zaszczepienia. W przypadku zaszczepiania więcej niż jednego naczynia należy pomnożyć liczbę komórek na naczynie przez całkowitą liczbę naczyń. Aby określić objętość (mL) zawiesiny komórkowej niezbędną do zaszczepienia każdego naczynia, należy podzielić liczbę komórek wymaganą do zaszczepienia jednego naczynia przez liczbę żywych komórek/mL w zawiesinie komórkowej. W przypadku zaszczepiania więcej niż jednego naczynia należy obliczyć całkowitą objętość potrzebnej zawiesiny komórkowej, mnożąc objętość wymaganą dla jednego naczynia przez całkowitą liczbę naczyń do zaszczepienia.
2. Odwirować żądaną objętość komórek w agsNSC Basal Medium + 5% FBS, aż do uzyskania luźnego osadu. Zazwyczaj 500 000 komórek doprowadza się do całkowitej objętości 25 mL w agsNSC Basal Medium + 5% FBS, zgodnie z wcześniejszym opisem. Odessać ciecz i zawiesić ponownie luźny osad w 10 mL agsNSC Expansion Medium. Ten dodatkowy etap wirowania jest wymagany w celu usunięcia FBS przed zaszczepieniem. Do kolby T-75 dodać 10 mL uprzednio ogrzanego agsNSC Expansion Medium. Do kolby T-75 dodać 10 mL ponownie zawieszonej zawiesiny komórkowej, a następnie dodać do kolby 40 μL rh FGF-basic. Decydując o maksymalnej liczbie kolb, z którymi można pracować jednocześnie, należy wziąć pod uwagę, że trypsynizacja i szczepienie nie powinny trwać dłużej niż 1,5 h. Należy również zapewnić wystarczającą ilość pożywki do całkowitej wymiany medium w przypadku użycia wielu kolb.
3. Delikatnie kołysać kolbą z boku na bok, aby równomiernie rozłożyć komórki, a następnie umieścić naczynia hodowlane w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO₂, zgodnie z wcześniejszym opisem.

6. Rozcieńczanie komórek w celu inokulacji płytek do różnicowania

1. Można zastosować dowolny format wielodołkowy, jednak inokulację należy przeprowadzić w płytkach BD Biocoat Poly-_LW niniejszym rozdziale opisano zastosowanie płytek 96-dołkowych pokrytych lizyną. Oblicz objętość zawiesiny komórkowej potrzebną do przeprowadzenia eksperymentu, mnożąc liczbę dołków przeznaczonych do inokulacji przez 0,2 ml na dołek dla płytki wielodołkowej typu 96, a następnie dodaj około 10% zapasu, aby zrekompensować ewentualne straty objętości podczas inokulacji. Oblicz rozcieńczenie tak, aby uzyskać gęstość komórek na poziomie 75 000 komórek/ml. Określ ilość FBS, którą należy dodać do medium różnicującego, aby osiągnąć stężenie końcowe 2% FBS (Tabela 1). Wymieszaj FBS z medium różnicującym. Ostrożnie połącz komórki z obliczoną objętością medium różnicującego z dodatkiem FBS. (Uwaga: podczas wirowania komórki znajdują się w medium podstawowym agsNSC + 5% FBS. Chociaż FBS chroni komórki podczas wirowania i ułatwia ich adhezję, hamuje on jednocześnie różnicowanie. Rozcieńczenie FBS do poziomu 2% umożliwi adhezję komórek do powierzchni płytki wielodołkowej. Następnie 2% FBS ulega dalszemu rozcieńczeniu, aby wspomóc różnicowanie. W skład medium różnicującego wchodzi również insulina-transferyna-selen (ITS-e) w celu stymulacji procesu różnicowania).
2. W komorze z laminarnym przepływem powietrza nalać 200 µl rozcieńczonej zawiesiny komórkowej ze sterylnego zbiornika combitip do każdej studzienki płytki 96-dołkowej pokrytej poli-L-lizyną, używając pipety wielokanałowej z końcówkami o szerokim wylocie. Inkubować płytki przez 1,5–2 godziny w temperaturze 37°C, 5% CO2₂Po przywierceniu komórek, po około 90 do 120 minutach, ostrożnie usunięto 50% (100 μL (dla płytek 96-dołkowych) medium z każdego dołka, używając końcówek do pipet o szerokim otworze. Usuniętą objętość ostrożnie zastąp ciepłym medium do różnicowania agsNSC (agsNSC Differentiation Medium), ponownie używając końcówek do pipet o szerokim otworze. (Stosowanie standardowych końcówek może uszkodzić komórki).
3. Dwa dni po inokulacji (~ 48 godzin) należy wymienić 50% pożywki, używając pożywki do różnicowania agsNSC Differentiation Medium oraz końcówek do pipet z szerokim otworem.

7. Utrzymanie neuronów

1. Przygotować pożywkę do utrzymania neuronów (Neuronal Maintenance Medium), wykorzystując NeuraLife, glutaminę oraz B27 zgodnie z instrukcją. Pożywkę do utrzymania neuronów należy przygotowywać co tydzień.
2. Dwa dni po ostatniej wymianie pożywki różnicującej agsNSC (agsNSC Differentiation Medium), zazwyczaj w 4. dniu po inokulacji, przeprowadzić 50% wymianę pożywki, stosując pożywkę do utrzymania neuronów.
3. Kontynuować 50% wymiany pożywki na pożywkę do utrzymania neuronów co 2 do 3 dni. Wypustki neuronalne powinny pojawić się w ciągu kilku dni od przejścia na pożywkę do utrzymania neuronów. Komórki należy wykorzystać w ciągu 3 tygodni od przeniesienia do pożywki do utrzymania neuronów. Neurony można zidentyfikować przy użyciu szeregu dostępnych komercyjnie markerów neuronalnych. Zawsze będą obserwowane również astrocyty.
4. Populacje hodowlane zazwyczaj wykazują stosunek neuronów do całkowitej liczby komórek powyżej 40%. Stosowanie innych pożywek do utrzymania neuronów niż NeuraLife może skutkować uzyskaniem komórek o gorszych parametrach, które nie wykazują dojrzałości morfologicznej i mogą nie przetrwać tak długo w hodowli.

8. Reprezentatywne wyniki:

Dorosłe komórki macierzyste neuronów wiewiórki arktycznej będą podwajać swoją liczbę co 24 hrs przez okres od 3 do 5 dni w ciągu co najmniej dwóch pasaży, przy wysiewie 500,000-600,000 komórek/75mm flask. Komórki te łatwo ulegają różnicowaniu po usunięciu basicFGF i B27 oraz w obecności 1-2% FBS i 1% Insulin/Transferrin/Selenium, stając się neuronami pozytywnymi pod kątem TUJ1 (Covance) w ciągu 14-21 dni (patrz Rysunek 2). Stosunek neuronów do całkowitej liczby komórek będzie mieścić się w przedziale 40-60%, w zależności od wieku hodowli (Rysunek 3). Neurony mogą być wykorzystywane do eksperymentów od 12 dnia po wysiewie przez co najmniej 21 dni po wysiewie.

Rycina 1. Fotomikrografia dorosłych komórek macierzystych neuronów hipokampa AGS.
Fotomikrografia w kontraście fazowym dorosłych komórek macierzystych neuronów hipokampa AGS po 3 dniach wzrostu w pożywce podstawowej agsNSC w kolbach pokrytych poli-L-ornityną. Podwajanie liczby komórek następuje w przybliżeniu co 24h. Zdjęcie przy powiększeniu 100X.

Rycina 2. Mikrofotografia fluorescencyjna zróżnicowanych dorosłych komórek macierzystych hipokampa AGS
Komórki macierzyste AGS poddano działaniu pożywki do różnicowania przez 4 dni, a następnie utrzymywano w Neuralife przez kolejne 17 dni przed utrwaleniem. Komórki utrwalono w 4% paraformaldehydzie, a neurony zidentyfikowano przy użyciu przeciwciała pierwszorzędowego TUJ1 (Covance) oraz przeciwciała wtórnego Alexa Fluor 568 (kolor zielony) z firmy Invitrogen. W celu zabarwienia wszystkich jąder (kolor niebieski) dodano barwnik Hoechst 33343. Liczbę komórek, liczbę neuronów oraz stosunek neuronów określono przy użyciu oprogramowania do analizy wypustek neurytowych oraz instrumentu Arrayscan firmy Cellomics. Zdjęcie to reprezentuje około 57% neuronów. Powiększenie 10X

Rycina 3. Liczba neuronów i stosunek neuronów w zróżnicowanych neuralnych komórkach macierzystych AGS w trzech okresach hodowli
Neuralne komórki macierzyste AGS poddano działaniu pożywki różnicującej przez 4 dni, a następnie utrzymywano w Neuralife przez 12, 15 i 17 dni przed utrwaleniem. Komórki utrwalono, a neurony zidentyfikowano za pomocą przeciwciała pierwszorzędowego TUJ1 (Covance). Dodano barwnik Hoechst w celu zabarwienia wszystkich jąder dla identyfikacji całkowitej liczby komórek. Liczbę komórek, liczbę neuronów i procentowy stosunek neuronów określono przy użyciu oprogramowania do analizy wypustek neurytów oraz instrumentu Arrayscan firmy Cellomics. Wartości reprezentują średnią z 15 studni na warunek + SD.

Tabela 1. Przykładowe obliczenia stosowane podczas pasażowania i wysiewania

1. Przy użyciu zawiesiny komórkowej o stężeniu 700 000 cells/mL
2. Przy zastosowaniu gęstości komórkowej 75 000 cells/mL lub 15 000 komórek na studzienkę o objętości 0,2 mL w każdej studzience.
3. Zaszczepienie 96 studzienek przy 0,2 mL na studzienkę = 19,2 mL lub pożądana objętość końcowa 21 mL.
4. (Stężenie końcowe x Objętość końcowa) ÷ Stężenie początkowe = Objętość początkowa
   (21 mL x 75 000 cells/mL) ÷ 700 000 = 2,25 mL
5. Objętość FBS w zawiesinie komórkowej: 2,25 mL = 2,25 mL x 0,05 = 0,1125 mL
6. Objętość FBS potrzebna w 21 mL = 21 mL x 0,02 = 0,42 mL
7. Objętość FBS do dodania do pożywki różnicującej = 0,42 mL - 0,1125 mL = 0,3075 mL
8. Objętość pożywki różnicującej = 21 mL - 2,25 mL zawiesiny komórkowej - 0,3075 mL 5% FBS = 18,44 mL.
9. Połączyć 18,44 mL pożywki różnicującej z 0,308 mL FBS i dodać 2,25 mL zawiesiny komórkowej.

Dyskusja

Dorosłe komórki macierzyste neuronów AGS są wytrzymałe i mogą być namnażane przez wiele pasaży, co czyni je doskonałym źródłem komórek macierzystych neuronów do badania podstawowych właściwości tych komórek. Tempo ekspansji wynosi w przybliżeniu jeden podział co dwadzieścia cztery godziny, jednak komórki te muszą być pasażowane przed osiągnięciem konfluencji, ponieważ kontakt między komórkami sprzyja różnicowaniu w astrocyty. Różnicowanie pośredniczone przez kontakt spowoduje zatem gwałtowny spadek stosunku liczby neuron...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
agsNSC	Lifeline Cell Technology	FC-0004
Zestaw do ekspansji agsNSC	Lifeline Cell Technology	LL-0008	Alternatywne źródło dla DMEM/F12, B27 i rhFGFb (www.invitrogen.com)
Zestaw do różnicowania agsNSC	Lifeline Cell Technology	LL-0009	Alternatywne źródło dla DMEM/F12 i ITS-x (www.invitrogen.com)
Zestaw pożywek do utrzymania NeuraLife	Lifeline Cell Technology	LL-0012	Alternatywnymi źródłami są NeuraBasal (LifeLine) lub Neurobasal (Invitrogen), glutamina i B27 (www.invitrogen.com). Zróżnicowane komórki utrzymuje się do 3 tygodni w NeuroLife, ale nie dłużej niż 2 tygodnie w Neurobasal (www.invitrogen.com)
Mikrometr (np. komora licznikowa Bright Line Counting Chamber)	Hausser Scientific	1490	http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm
Płytki 96-dołkowe Biocoat pokryte poli-L-lizyną	BD Biosciences	356516	www.bdbiosciences.com
Końcówki do pipet o szerokim otworze	Fisher Scientific	02-707-141	Zapobiegają uszkodzeniu komórek neuronalnych podczas pipetowania. http://www.fishersci.com