Protokół infekcji denga w komarach (A. aegypti) i określanie fenotypu infekcji

Podsumowanie

Po zidentyfikowaniu genu jako potencjalnie opornego na wirusa dengue, należy ocenić jego rolę w zapobieganiu infekcjom wirusowym u komarów. Niniejszy protokół ilustruje sposób badania stopnia zakażenia komarów wirusem dengue. Przedstawiono techniki namnażania wirusa w kulturze, karmienia komarów krwią ludzką przez membranę oraz oznaczania miana wirusa w jelicie środkowym komara.

Streszczenie

Celem niniejszej procedury jest zakażenie komarów z rodzaju Aedes wirusem dengi w warunkach laboratoryjnych oraz zbadanie poziomu infekcji i dynamiki wirusa w tkankach komara. Protokół ten jest rutynowo stosowany do badania interakcji między komarem a wirusem, w szczególności do identyfikacji nowych czynników gospodarza, które determinują kompetencję wektora. Cały eksperyment musi być przeprowadzony w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego BSL2. Podobnie jak w przypadku zakażeń *Plasmodium falciparum*, przez cały czas należy nosić odpowiednią odzież ochronną, w tym rękawiczki i fartuch laboratoryjny. Po zakończeniu eksperymentu wszystkie materiały, które miały kontakt z wirusem, muszą zostać poddane działaniu 75% etanolu oraz wybielacza przed przystąpieniem do standardowego mycia. Wszystkie pozostałe materiały należy poddać autoklawowaniu przed ich utylizacją.

Protokół

A. Namnożenie wirusa w linii komórkowej C6/36.

1. Hodować komórki do osiągnięcia 80% konfluencji w kolbie 75 cm²;
2. Usunąć pożywkę, pozostawiając w kolbie 3-4 ml;
3. Pobrać 0,5 ml zawisu wirusa i dodać do powyższych komórek przy wielokrotności zakażenia (MOI) wynoszącej 1,5 cząstki wirusa na komórkę. Powoli wstrząsać kolbą przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
4. Inkubować przez 45 minut w atmosferze 5% CO₂ w temperaturze 37°C
5. Dodać 30 ml pożywki i inkubować przez 5 dni.

B. Przygotowanie mieszaniny wirusa i krwi

1. Odczepić komórki za pomocą skrobaczki i przenieść komórki wraz z medium do probówek stożkowych o pojemności 50 mL;
2. Wirować przy 800g przez 10 minut; zebrać nadsącz, pozostawiając 1ml nadsączu z osadem komórkowym;
3. Zamrozić powyższy osad komórkowy  w suchym CO₂, a następnie rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37°C; powtórzyć czynność dwa do trzech razy;
4. Wirować przy 800g przez 10 minutes, zebrać nadsącz i połączyć go z nadsączem zebranym w kroku 3;
5. Pobrać pełną krew ludzką stosując tę samą procedurę (krok 3) w celu przygotowania kultury gametocytów do zakażenia komarów Anopheles pasożytem Plasmodium falciparum;
6. Połączyć równą ilość powyższej pełnej krwi ludzkiej z nadsączem wirusowym z kroku 4 i dodać surowicę ludzką (10% całkowitej objętości).
7. Inkubować powyższą mieszaninę krwi ludzkiej i wirusa dengi przez 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37°C

C. Karmienie komarów

Procedura ta jest niemal identyczna z opisaną w sekcji dotyczącej zakażeń Plasmodium falciparum u komarów. Stopień zakażenia jelita środkowego oceniamy w 7. dniu, a zakażenie gruczołów ślinowych w 14. dniu po pobraniu krwi. Wszystkie materiały, które miały kontakt z wirusem, są najpierw traktowane 75% etanolem, a następnie 10% wybielaczem.

D. Oznaczenie miana wirusa w tkance komara

1. Na dwa lub trzy dni przed sekcją tkanek komara należy wysiać komórki C6/36 na płytce 24-dołkowej w taki sposób, aby w dniu przeprowadzenia analizy osiągnęły one 80% konfluencji;
2. Komary należy znieczulić w temperaturze 4°C, uśmiercić i wysterylizować powierzchnię ciała, mocząc je w 75% etanolu przez 1 minutę. Następnie komary dwukrotnie przemyto sterylną wodą przed sekcją jelita środkowego lub ślinianek pod mikroskopem sekcyjnym. Od tego momentu wszystkie poniższe procedury muszą być wykonywane w środowisku sterylnym, np. w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Tkanki te przenosi się do probówki zawierającej 150 µl medium i homogenizuje za pomocą motorowego tłuczka Kontes przez 90 sekund;
3. Należy przygotować rozcieńczenie 1:100, dodając 10 µl homogenatu do 990 µl medium;
4. W płytce 96-dołkowej należy przygotować kolejne rozcieńczenia 1:10, 1:100 i 1:1000 w medium;
5. Należy usunąć medium z płytki 24-dołkowej i dodać 100 µl każdego z czterech powyższych rozcieńczeń do odpowiadających im dołków;
6. Płytkę należy powoli wstrząsać przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie inkubować przez 45 minut w 5% CO₂ i 37°C;
7. Do każdego dołka należy dodać 1 ml nakładki z metylocelulozy (1%);
8. Płytki inkubować w 37°C przy 5% CO₂ przez 5 dni;
9. Kolejne kroki nie wymagają środowiska sterylnego, jednak jak przy każdym innym patogenie, należy zachować ostrożność w każdym momencie. Usunąć nakładkę z metylocelulozy z każdej płytki i odsączyć nadmiar medium;
10. Do każdego dołka dodać 1 ml fiksaty z metanolu i acetonu (1:1). Przechowywać w 4°C przez 1 h;
11. Odlać fiksaty i przemyć raz 1X PBS;
12. Przygotować rozcieńczenie 1:1000 przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko wirusowi w 5% blotto;
13. Do każdego dołka dodać 200 µl rozcieńczonego płynu hiperimmunnego, inkubować w 37°C przez 1 h;
14. Usunąć płyn hiperimmuny i przemyć płytkę 1X PBS;
15. Przygotować rozcieńczenie 1:1000 koniugatu koziego anty-mysiego (KPL Cat# 074-1806) w 5% blotto (5 g mleka w proszku w 100 ml 1X PBS), a następnie dodać 200 µl do każdego dołka i inkubować w 37°C przez 1 h;
16. Przygotować substrat w następujący sposób: dodać 1 tabletkę tetrahydrochlorku 3'-diaminobenzydyny (Sigma Cat# D5905) do 20 ml 1X PBS, a po rozpuszczeniu dodać 8 µl 30% nadtlenku wodoru;
17. Do każdego dołka dodać 200 µl powyższego substratu. Pozostawić w temperaturze pokojowej na 10 minut;
18. Usunąć substrat i zatrzymać reakcję, dodając 1 ml wody destylowanej do każdego dołka;
19. Odlać wodę i osuszyć płytki;
20. Policzyć cząstki wirusa;

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Inkubator				w 5% CO2, 37°C
probówki stożkowe 50 ml				tworzywo sztuczne
końcówka do pipety				do hodowli tkankowych
Pipettman
pipety Pasteura				szkło, sterylnie
łaźnia wodna				37°C
wirówka
parafilm
łaźnia wodna z cyrkulacją
dozowniki z membraną szklaną				z gumowymi rurkami dopasowanymi do podajników
kubeczki do komarów
75% etanol
10% roztwór wybielacza
Płytki do hodowli tkankowych				płytki 6-dołkowe, 24-dołkowe i 96-dołkowe
szalka Petriego				szkło
Slajdy
pinceta precyzyjna
PBS				1X, sterylne
mikroskop stereoskopowy	Mikroskop
komórki C6/36	komórki			Do propagacji wirusa
pożywka C6/36				MEM z dodatkiem 10% nieaktywowanej termicznie FBS, 1% L-glutaminy i nieessentialnych aminokwasów oraz 1% (v/v) penicyliny-streptomycyny.
3’-Tetrachlorowodorek diaminobenzydyny		Sigma-Aldrich	D5905	1 tabletkę w 20 ml 1X PBS, rozpuścić, a następnie dodać 8 μl 30% nadtlenku wodoru
30% nadtlenek wodoru
*A. aegypti*	Zwierzę			komar