Artykuł metodologiczny

Określanie liczby komórek podczas hodowli komórek za pomocą licznika komórek z berła

DOI:

10.3791/2204

⸱

26 listopada 2010

 ,  ,  ,  , 
1Bioscience Division, Millipore Inc

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Licznik komórek Scepter to przenośne automatyczne urządzenie, które może być używane do liczenia komórek, monitorowania średnicy i objętości komórek, a także do sprawdzania zdrowia i jakości populacji komórkowych z jednej kultury na drugą.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Liczenie komórek jest często koniecznym, ale żmudnym krokiem do hodowli komórkowej in vitro. Stałe stężenia komórek zapewniają eksperymentalną odtwarzalność i dokładność. Liczba komórek jest ważna dla monitorowania zdrowia komórek i tempa proliferacji, oceny nieśmiertelności lub transformacji, wysiewania komórek do kolejnych eksperymentów, transfekcji lub infekcji oraz przygotowania do testów opartych na komórkach. Ważne jest, aby zliczanie komórek było dokładne, spójne i szybkie, szczególnie w przypadku ilościowych pomiarów odpowiedzi komórkowych.

Pomimo tej potrzeby szybkości i dokładności w liczeniu komórek, 71% z 400 badaczy przeprowadziło ankietęwśród osób, które liczyły komórki za pomocą hemocytometru. Chociaż hemocytometria jest niedroga, jest pracochłonna i podlega stronniczości użytkownika i niewłaściwemu użyciu, co skutkuje niedokładnymi obliczeniami. Hemocytometry wykonane są ze specjalnego szkła optycznego, na które ładowane są zawiesiny komórek w określonych objętościach i liczone pod mikroskopem. Do źródeł błędów w hemocytometrii należą: nierównomierne rozmieszczenie komórek w próbce, zbyt wiele lub zbyt mało komórek w próbce, subiektywne decyzje co do tego, czy dana komórka mieści się w zdefiniowanym obszarze zliczania, zanieczyszczenie hemocytometru, zmienność między użytkownikami oraz zmienność szybkości napełnienia hemocytometru2.

Aby złagodzić nudę związaną z ręcznym liczeniem, 29% badaczy liczy komórki za pomocą automatycznych urządzeń do liczenia komórek; są to m.in. liczniki oparte na wizji, systemy wykrywające komórki za pomocą zasady Coultera lub cytometria przepływowa1. Dla większości badaczy główną przeszkodą w korzystaniu ze zautomatyzowanego systemu jest cena związana z tymi dużymi instrumentami laboratoryjnymi1.

Licznik komórek Scepter to zautomatyzowane urządzenie przenośne, które oferuje automatyzację i dokładność liczenia Coultera przy stosunkowo niskich kosztach. System wykorzystuje zasadę Coultera detekcji cząstek w oparciu o impedancję3 w zminiaturyzowanym formacie, wykorzystując połączenie sprzętu analogowego i cyfrowego do wykrywania, przetwarzania sygnałów, przechowywania danych i wyświetlania graficznego. Jednorazowa końcówka została zaprojektowana z mikrofabrykowaną strefą wykrywania komórek, która umożliwia rozróżnianie według rozmiaru i objętości komórki w rozdzielczości submikronowej i subpikolitrowej. Wzbogacony o precyzyjne kanały obsługi cieczy i elektronikę, licznik komórek Scepter raportuje statystyki populacji komórek w formie graficznej w postaci histogramu.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Znaczenie liczenia komórek

  1. Liczenie komórek jest koniecznym, ale żmudnym krokiem w hodowli komórkowej in vitro.
  2. Stałe stężenia komórek zapewniają eksperymentalną odtwarzalność i dokładność.
  3. Liczba komórek jest ważna dla monitorowania zdrowia komórek i tempa proliferacji, oceny nieśmiertelności lub transformacji, wysiewania komórek do kolejnych eksperymentów, transfekcji lub infekcji oraz przygotowania do testów opartych na komórkach.
  4. Pomimo potrzeby szybkości i dokładności w zliczaniu komórek, 71% z 400 badaczy przebadało komórki za pomocą hemocytometru. Chociaż hemocytometria jest niedroga, jest pracochłonna i podlega stronniczości użytkownika i niewłaściwemu użyciu, co skutkuje niedokładnymi obliczeniami.
  5. Do źródeł błędów w hemocytometrii należą: nierównomierny rozkład komórek w próbce, zbyt wiele lub zbyt mało komórek w próbce, subiektywne decyzje co do tego, czy dana komórka mieści się w zdefiniowanym obszarze zliczania, zanieczyszczenie hemocytometru, zmienność między użytkownikami oraz zmienność szybkości napełniania hemocytometru.
  6. Aby złagodzić nudę związaną z ręcznym liczeniem, 29% badaczy liczy komórki za pomocą automatycznych urządzeń do liczenia komórek. Jednak dla większości badaczy cena związana z tymi dużymi instrumentami laboratoryjnymi stanowi barierę w ich użytkowaniu.
  7. Licznik komórek Scepter to zautomatyzowane urządzenie ręczne, które oferuje automatyzację i dokładność liczenia redlic Coulter przy stosunkowo niskich kosztach.
  8. System wykorzystuje zasadę Coultera detekcji cząstek w oparciu o impedancję w zminiaturyzowanym formacie, wykorzystując połączenie sprzętu analogowego i cyfrowego do wykrywania, przetwarzania sygnału, przechowywania danych i wyświetlania graficznego.
  9. Jednorazowy czujnik został zaprojektowany z mikrofabrykowaną strefą wykrywania komórek, która umożliwia rozróżnianie na podstawie rozmiaru i objętości komórki w rozdzielczości submikronowej i subpikolitrowej.
  10. Wzbogacony o precyzyjne kanały obsługi cieczy i elektronikę, licznik komórek Scepter wyświetla graficznie statystyki populacji komórek w postaci histogramu.

2. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej do liczenia

  1. Aby użyć licznika komórek Berła, zacznij od rozcieńczenia zawiesiny komórek z pojedynczych komórek w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem. Optymalne jest stężenie 10 000-500 000 komórek na ml.
  2. Przenieś 100 μl rozcieńczonych komórek do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml.

3. Liczenie komórek za pomocą Berła

  1. Włącz licznik komórek Berła, naciskając i przytrzymując przełącznik z tyłu instrumentu i poczekaj, aż pojawią się instrukcje na ekranie.
  2. Po wyświetleniu monitu przymocuj czujnik do końca modułu Scepter tak, aby panel wykrywania elektrod był skierowany w stronę przodu przyrządu.
  3. Czujniki Scepter składają się z precyzyjnie formowanej komory do pobierania próbek, z elektroniczną strefą wykrywania i zintegrowanymi elektrodami wykrywającymi ogniwa. Czujniki umożliwiają rozróżnienie wielkości komórki w rozdzielczości submikronowej i objętości komórki w rozdzielczości subpikolitrowej.
  4. Konsekwentna inżynieria czujników zapewnia zliczanie równych objętości próbek i dokonywanie dokładnych pomiarów wielkości.
  5. Po podłączeniu czujnika wykonaj każdy krok procesu liczenia zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie w następujący sposób:
  6. Gdy na ekranie pojawi się komunikat "Przytrzymaj tłok, aby rozpocząć", naciśnij tłok. Na ekranie pojawi się komunikat "zanurz czujnik". Zanurz czujnik w roztworze zawiesiny ogniw i zwolnij tłok, aby zassać zawiesinę ogniwa do czujnika.
  7. Tłok działa jak sygnał elektryczny i wciąga próbkę wraz z objętością martwą do czujnika. Szybkość i dokładność wgłębnego nie ma znaczenia, tak jak w przypadku pipetowania. Ten proces potrwa kilka sekund. Gdy urządzenie będzie gotowe, wyda sygnał dźwiękowy, a na ekranie pojawi się komunikat "Załadowano próbkę".
  8. Po załadowaniu próbki do czujnika jest ona pobierana przez strefę wykrywania w celu oceny wielkości komórki i objętości komórki, a następnie przez mikrokanały. Po zliczeniu 50 μl próbki czujnik informuje urządzenie, aby przestało liczyć.
  9. Po zakończeniu liczenia na ekranie instrumentu pojawi się komunikat "Count Complete". Wyjmij czujnik i wyrzuć." Postępuj zgodnie z instrukcjami, a następnie wyjmij i wyrzuć czujnik.
  10. Przyrząd wyświetli następnie histogram wielkości lub średnicy komórki na swoim ekranie, a także stężenie komórek na ml.

4. Analiza danych

  1. Po zakończeniu liczenia i wyświetleniu histogramu na instrumencie, zastosuj bramki, naciskając przycisk przełączania. Wybierz "automatyczne bramkowanie" lub "użyj ostatniego", aby automatycznie ustawić bramkę na podstawie profilu histogramu lub użyć bramek z poprzedniego zliczania.
  2. Niezależnie od dokonanego wyboru, bramki można przesuwać ręcznie, aby dostroić dane. Naciśnij ponownie przycisk przełączania, aby wybrać lewą bramę i przewiń przełącznik, aby przesunąć bramę zgodnie z potrzebami.
  3. Następnie ponownie naciśnij przełącznik, aby aktywować prawą bramę i przewiń przełącznik, aby umieścić prawą bramę. Kliknij ponownie; Zostanie wyświetlone nowe stężenie komórek, średnia objętość i średnica komórek.
  4. Przełącznik można również przesunąć w dowolną stronę, aby przełączyć wyświetlanie między datą, godziną, średnim rozmiarem komórki i średnią głośnością komórki.
  5. Na samym instrumencie można zapisać do 72 histogramów. Aby przesłać dane do komputera osobistego, podłącz instrument za pomocą portu USB na ekranie wyświetlacza.
  6. Na komputerze kliknij dwukrotnie aplikację Scepter Software, aby uruchomić oprogramowanie, a następnie kliknij "połącz". Wszystkie zliczenia zostaną automatycznie przeniesione do oprogramowania.
  7. Oprogramowanie aplikacyjne Scepter wyświetla histogram szczegółowo opisujący rozmieszczenie populacji kultury pod względem objętości lub średnicy. Pobrane pliki można następnie wyeksportować do programu Microsoft Excel, gdzie surowe dane zostaną wyświetlone w pojemnikach o określonych średnicach komórek lub objętościach komórek.

5. Reprezentatywne wyniki

  1. Do zliczania przygotowano dziewiętnaście różnych linii komórkowych i określono teoretyczne stężenia wyjściowe za pomocą licznika redlic. Te zawiesiny komórek były następnie dalej rozcieńczane w celu uzyskania zawiesin komórkowych o teoretycznych stężeniach komórek.
  2. Licznik komórek Scepter został następnie użyty do określenia stężeń komórek. Rysunek 1 przedstawia 5 rozcieńczeń, które zmierzono dla 5 reprezentatywnych linii komórkowych wraz z teoretycznym stężeniem komórek.
  3. Wysoki stopień liniowości, na który wskazują wartości R2, pokazuje, że zliczanie Scepter jest niezawodną metodą dla testowanych linii komórkowych w szerokim liniowym zakresie roboczym.
  4. Ogólna względna dokładność liczenia Berła jest pokazana na rysunku 2, na którym dane uzyskane z liczenia Berła są porównywane z liczeniami uzyskanymi z liczenia Berła.
  5. Log liczby komórek Berła jest wykreślany w stosunku do logarytmu liczby komórek Coultera i pokazuje, że we wszystkich testowanych liniach komórkowych liczba Berła jest zgodna z liczbą komórek Coultera.
  6. Zliczanie 19 linii komórkowych przeprowadzono za pomocą licznika redlic Z2, licznika komórek Scepter, automatycznego licznika wizyjnego, takiego jak system Vi-Cell lub Inculum, oraz hemocytemetru.
  7. Liczenie przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta, przy użyciu tej samej zawiesiny wyjściowej komórek i identycznych rozcieńczeń. Wyniki przedstawione na rysunku 3 pokazują, że stężenia komórek mierzone za pomocą liczenia Scepter ściśle odpowiadają teoretycznym stężeniom komórek o wysokiej liniowości.
  8. Procentowy współczynnik zmienności (CV) obliczono dla każdego rozcieńczenia każdej linii komórkowej dla każdego systemu liczenia. Rysunek 4 przedstawia średni % CV w 19 liniach komórkowych w odniesieniu do koncentracji komórek i metody liczenia.
  9. W zakresie roboczym licznik ogniw Scepter jest bardziej precyzyjny niż zliczanie hemocytometru oparte na wizji, wyświetlając mniejsze odchylenia standardowe i mniejsze średnie współczynniki zmienności.
  10. Liczenie berła jest dziesięć razy szybsze niż hemocytometria i szybsze niż inne automatyczne liczniki. Na rysunku 5 komórki SF9, MCF7 i HEK293 zostały policzone przy użyciu metod opisanych w tym filmie.
  11. Zarejestrowano średni czas potrzebny do zmierzenia stężenia komórek. Należy pamiętać, że hemocytometrię wykonano tylko raz na próbkę.
  12. Berło dokonuje pomiarów na podstawie rozmiaru komórki. W ten sposób wszelkie zmiany w morfologii komórki można uchwycić na histogramie. Zdrowe kultury wykazują ładny rozkład Gaussa w kształcie dzwonu, podczas gdy niezdrowe komórki ulegają lizie i powodują przesunięcie histogramu w lewo (ryc. 6, lewy panel).
  13. Podobnie, gdy populacja 50% martwych komórek została zmieszana z 50% żywymi komórkami, zaobserwowano również przesunięcia histogramu (ryc. 6, prawy panel).

figure-protocol-1

figure-protocol-2

figure-protocol-3

figure-protocol-4

figure-protocol-5

figure-protocol-6

figure-protocol-7

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Porównując wydajność licznika komórek Scepter z wynikami innych metod liczenia, dochodzimy do wniosku, że ten nowy ręczny, zautomatyzowany licznik komórek zapewnia precyzyjne, szybkie i niezawodne zliczanie komórek w szerokim zakresie roboczym. Funkcjonalność liczenia Scepter jest wynikiem precyzyjnie zaprojektowanej technologii wbudowanej w końcówkę czujnika oraz zaawansowanego oprzyrządowania do liczenia opartego na zasadzie Coredler. Jakość wykonania sugeruje, że liczenie Scepter jest metodą zwiększania szybkości i poprawy odtwarzalności testów opartych na komórkach. Ręczny format umożliwia szybkie, beznużące liczenie bezpośrednio przy kapturze do hodowli komórkowych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kathleen Ongena, Chandreyee Das, Janet L. Smith, Sónia Gil i Grace Johnston są zatrudnione przez firmę Millipore, która produkuje instrumenty użyte w tym artykule.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Scepter 2.0 Ręczny automatyczny licznik komórek z 40 μ m Scepter SensorsEMD MilliporePHCC20040
Scepter 2.0 Ręczny automatyczny licznik komórek z 60 μ m Czujniki berłaEMD MilliporePHCC20060
Czujniki Berła, 60 μ mEMD MilliporePHCC6005050 Zestaw czujników
Czujniki Berło, 40 i mu; mEMD MilliporePHCC4005050 Zestaw czujników
Uniwersalny zasilaczEMD MilliporePHCCPOWER
Scepter O-Ring KitEMD MilliporePHCCOCLIP2 O-ringi i jedna osłona filtra

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barghshoon, S. Cell Counting Survey. , Millipore. (2009).
  2. Tucker, K. G., Chalder, S., al-Rubeai, M., Thomas, C. R. Measurement of hybridoma cell number, viability, and morphology using fully automated image analysis. Enzyme Microb Technol. 16 (1), 29-35 (1994).
  3. Houwen, B. Fifty years of hematology innovation: the Coulter principle. , Medical Laboratory Observer. (2003).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Liczenie kom rekzasada Coulteraautomatyczny licznik kom rekurz dzenie przeno nest enie kom rekanaliza wielko ci kom rekwy wietlanie histogramudetekcja impedancyjnaywotno kom rek

Powiązane artykuły