Scepter Cell Counter to przenośne, zautomatyzowane urządzenie, które umożliwia zliczanie komórek, monitorowanie ich średnicy i objętości oraz sprawdzanie stanu zdrowia i jakości populacji komórkowych w kolejnych kulturach.
Artykuł metodologiczny
Oznaczanie liczby komórek podczas hodowli komórkowej przy użyciu licznika komórek Scepter
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Liczenie komórek jest często niezbędnym, ale żmudnym etapem hodowli komórkowych in vitro. Stałe stężenia komórek zapewniają powtarzalność i dokładność eksperymentów. Liczenie komórek jest istotne w celu monitorowania stanu zdrowia i szybkości proliferacji komórek, oceny immortalizacji lub transformacji, wysiewania komórek do kolejnych doświadczeń, transfekcji lub infekcji, a także w przygotowaniu do testów opartych na komórkach. Ważne jest, aby liczenie komórek było dokładne, spójne i szybkie, szczególnie w przypadku ilościowych pomiarów odpowiedzi komórkowych.
Pomimo zapotrzebowania na szybkość i dokładność w liczeniu komórek, 71% z 400 przebadanych naukowców1 nadal stosuje hemocytometr do tego celu. Choć hemocytometria jest niedroga, jest pracochłonna i podatna na błędy użytkownika oraz niewłaściwe zastosowanie, co prowadzi do niedokładnych wyników. Hemocytometry wykonane są ze specjalnego szkła optycznego, na które nanosi się określone objętości zawiesin komórkowych, a następnie zlicza je pod mikroskopem. Źródłami błędów w hemocytometrii są: nierównomierny rozkład komórek w próbce, zbyt duża lub zbyt mała liczba komórek w próbce, subiektywne decyzje dotyczące tego, czy dana komórka znajduje się w wyznaczonym obszarze liczenia, zanieczyszczenie hemocytometru, różnice między użytkownikami oraz zmienność stopnia wypełnienia hemocytometru2.
Aby uniknąć żmudnego procesu ręcznego liczenia, 29% badaczy wykorzystuje do liczenia komórek zautomatyzowane urządzenia; należą do nich liczniki obrazowe, systemy wykrywające komórki w oparciu o zasadę Coultera lub cytometria przepływowa1. Dla większości badaczy główną barierą w stosowaniu systemów zautomatyzowanych jest cena tych dużych instrumentów laboratoryjnych1.
Licznik komórek Scepter to zautomatyzowane urządzenie ręczne, które zapewnia automatyzację i dokładność zliczania metodą Coultera przy stosunkowo niskim koszcie. System wykorzystuje zasadę Coultera opartą na detekcji cząstek za pomocą impedancji3 w zminiaturyzowanej formie, stosując kombinację analogowego i cyfrowego sprzętu do wykrywania, przetwarzania sygnałów, przechowywania danych oraz wyświetlania graficznego. Jednorazowa końcówka została zaprojektowana z mikrofabrykowaną strefą wykrywania komórek, która umożliwia rozróżnianie według rozmiaru i objętości komórek z rozdzielczością poniżej mikrona i pikolitra. Dzięki precyzyjnym kanałom do obsługi cieczy i zaawansowanej elektronice, licznik komórek Scepter raportuje statystyki populacji komórek przedstawione graficznie w formie histogramu.
Protokół
1. Znaczenie liczenia komórek
- Liczenie komórek jest niezbędnym, lecz żmudnym etapem hodowli komórkowych in vitro.
- Stałe stężenia komórek zapewniają powtarzalność i dokładność eksperymentów.
- Liczenie komórek jest istotne dla monitorowania stanu zdrowia i tempa proliferacji komórek, oceny uniesmiertelnienia lub transformacji, wysiewu komórek do kolejnych eksperymentów, transfekcji lub infekcji, a także przygotowania do testów opartych na komórkach.
- Mimo zapotrzebowania na szybkość i dokładność w liczeniu komórek, 71% z 400 ankietowanych badaczy liczy komórki przy użyciu hemocytometru. Choć hemocytometria jest tania, jest pracochłonna i podatna na błędy oraz niewłaściwe użytkowanie, co skutkuje niedokładnymi wynikami.
- Źródła błędów w hemocytometrii obejmują: nierównomierny rozkład komórek w próbce, zbyt dużą lub zbyt małą liczbę komórek w próbce, subiektywne decyzje dotyczące tego, czy dana komórka znajduje się w zdefiniowanym obszarze liczenia, zanieczyszczenie hemocytometru, różnice między użytkownikami oraz zmienność szybkości napełniania hemocytometru.
- Aby zmniejszyć żmudność związaną z ręcznym liczeniem, 29% badaczy wykorzystuje automatyczne urządzenia do liczenia komórek. Jednak dla większości badaczy ceną tych dużych instrumentów laboratoryjnych jest bariera uniemożliwiająca ich zastosowanie.
- Licznik komórek Scepter to automatyczne urządzenie ręczne, które oferuje automatyzację i dokładność liczenia metodą Coultera przy stosunkowo niskim koszcie.
- System wykorzystuje zasadę Coultera opartą na detekcji cząstek za pomocą impedancji w zminiaturyzowanym formacie, stosując kombinację analogowego i cyfrowego sprzętu do detekcji, przetwarzania sygnałów, przechowywania danych i wyświetlania graficznego.
- Jednorazowy sensor został zaprojektowany z mikrofabrykowaną strefą detekcji komórek, która umożliwia rozróżnianie komórek ze względu na ich rozmiar i objętość z rozdzielczością poniżej mikrona i pikolitra.
- Dzięki precyzyjnym kanałom do obsługi cieczy i zaawansowanej elektronice, licznik komórek Scepter graficznie prezentuje statystyki populacji komórek w formie histogramu.
2. Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek do liczenia
- Aby skorzystać z licznika komórek Scepter, należy rozpocząć od rozcieńczenia zawiesiny pojedynczych komórek w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Optymalne stężenie wynosi od 10,000 do 500,000 komórek na mL.
- Przenieś 100 μL rozcieńczonych komórek do probówki do mikrowirówki o pojemności 1.5 mL.
3. Wykonywanie zliczeń komórek przy użyciu Scepter
- Włącz licznik komórek Scepter, naciskając i przytrzymując przełącznik z tyłu urządzenia, a następnie poczekaj na pojawienie się instrukcji na ekranie.
- Po wyświetleniu prośby podłącz sensor do końca jednostki Scepter tak, aby panel elektrod pomiarowych był skierowany w stronę przedniej części urządzenia.
- Sensory Scepter składają się z precyzyjnie uformowanej komory próbkowania z elektroniczną strefą pomiarową i zintegrowanymi elektrodami do wykrywania komórek. Sensory te umożliwiają rozróżnianie wielkości komórek z rozdzielczością submikronową oraz objętości komórek z rozdzielczością subpikolitrową.
- Jednolita konstrukcja sensorów zapewnia przeliczanie równych objętości próbek oraz dokładność pomiarów wielkości.
- Po podłączeniu sensora wykonaj każdy krok procesu liczenia zgodnie z instrukcjami na ekranie w następujący sposób:
- Gdy na ekranie pojawi się komunikat „Hold down the plunger to begin” (Naciśnij tłok, aby rozpocząć), naciśnij tłok. Na ekranie pojawi się wówczas komunikat „submerge the sensor” (zanurz sensor). Zanurz sensor w roztworze zawiesiny komórkowej i zwolnij tłok, aby zassać zawiesinę komórek do sensora.
- Tłok działa jako sygnał elektryczny i wciągnie próbkę wraz z objętością martwą do sensora. Prędkość lub precyzja naciskania tłoka nie mają znaczenia, w przeciwieństwie do pipetowania. Proces ten potrwa kilka sekund. Po zakończeniu instrument wyemituje sygnał dźwiękowy, a na ekranie pojawi się napis „Sample loaded” (Próbka załadowana).
- Po załadowaniu próbki do sensora jest ona przeciągana przez strefę pomiarową w celu oceny wielkości i objętości komórek, a następnie przez mikrokanały. Po przeliczeniu 50 μL próbki sensor przesyła do urządzenia sygnał o zakończeniu liczenia.
- Po zakończeniu liczenia na ekranie urządzenia pojawi się komunikat „Count Complete. Please remove sensor and discard” (Liczenie zakończone. Proszę wyjąć i wyrzucić sensor). Postępuj zgodnie z instrukcją: wyjmij i wyrzuć sensor.
- Następnie urządzenie wyświetli na ekranie histogram wielkości lub średnicy komórek oraz stężenie komórek na mL.
4. Analiza danych
- Po zakończeniu pomiaru i wyświetleniu histogramu na urządzeniu, należy ustawić bramki (gates), naciskając przycisk przełącznika. Wybierz opcję „auto gating”, aby automatycznie ustawić bramkę na podstawie profilu histogramu, lub „use last”, aby użyć bramek z poprzedniego pomiaru.
- Niezależnie od wyboru, bramki można przesuwać ręcznie w celu precyzyjnego dostrojenia danych. Ponownie naciśnij przycisk przełącznika, aby zaznaczyć lewą bramkę, a następnie przesuń przełącznik, aby ustawić ją w pożądanym miejscu.
- Następnie ponownie naciśnij przełącznik, aby aktywować prawą bramkę i przesuń go, by ją ustawić. Kliknij ponownie; wyświetlone zostanie nowe stężenie komórek, średnia objętość oraz średnica komórek.
- Przełącznikiem można również sterować w obie strony, aby przełączać widok między datą, godziną, średnią wielkością a średnią objętością komórek.
- W pamięci urządzenia można zapisać do 72 histogramów. Aby przesłać dane na komputer osobisty, podłącz urządzenie za pomocą kabla USB do portu znajdującego się przy ekranie wyświetlacza.
- Na komputerze dwukrotnie kliknij aplikację Scepter Software, aby uruchomić oprogramowanie, a następnie kliknij „connect”. Wszystkie wyniki pomiarów zostaną automatycznie przesłane do programu.
- Oprogramowanie Scepter Application wyświetla histogram szczegółowo przedstawiający rozkład populacji hodowli w odniesieniu do objętości lub średnicy. Pobrane pliki można następnie wyeksportować do programu Microsoft Excel, w którym surowe dane zostaną wyświetlone w przedziałach (bins) dla określonych średnic lub objętości komórek.
5. Reprezentatywne wyniki
- Przygotowano dziewiętnaście różnych linii komórkowych do liczenia, a teoretyczne stężenia początkowe określono za pomocą licznika Coulter. Następnie zawiesiny te poddano dalszemu rozcieńczeniu, aby uzyskać zawiesiny o teoretycznych stężeniach komórek.
- Do wyznaczenia stężeń komórek wykorzystano licznik komórek Scepter. Rysunek 1 przedstawia 5 rozcieńczeń zmierzonych dla 5 reprezentatywnych linii komórkowych wraz z teoretycznym stężeniem komórek.
- Wysoki stopień liniowości, wskazany przez wartości R2, dowodzi, że liczenie systemem Scepter jest niezawodną metodą dla przetestowanych linii komórkowych w szerokim liniowym zakresie pracy.
- Ogólną względną dokładność liczenia systemem Scepter przedstawiono na Rysunku 2, na którym dane uzyskane z licznika Scepter porównano z wynikami uzyskanymi za pomocą licznika Coulter.
- Wykreślono logarytm liczby komórek z systemu Scepter względem logarytmu liczby komórek z licznika Coulter, co wykazuje, że dla wszystkich badanych linii komórkowych wyniki z Scepter są zgodne z wynikami z licznika Coulter.
- Liczenie 19 linii komórkowych przeprowadzono z użyciem licznika Coulter Z2, licznika komórek Scepter, zautomatyzowanego licznika opartego na analizie obrazu, takiego jak system Vi-Cell lub Countless, oraz hemocytometru.
- Liczenie przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta, używając tej samej początkowej zawiesiny komórkowej i identycznych rozcieńczeń. Wyniki przedstawione na Rysunku 3 wykazują, że stężenia komórek zmierzone za pomocą Scepter ściśle odpowiadają teoretycznym stężeniom komórek przy zachowaniu wysokiej liniowości.
- Współczynnik zmienności w procentach, czyli CV, obliczono dla każdego rozcieńczenia każdej linii komórkowej dla każdego systemu liczenia. Rysunek 4 przedstawia średnie wartości %CV dla 19 linii komórkowych w zależności od stężenia komórek i metody liczenia.
- W zakresie pracy licznik komórek Scepter jest bardziej precyzyjny niż liczenie hemocytometrem opartym na analizie obrazu, wykazując mniejsze odchylenia standardowe i mniejsze średnie współczynniki zmienności.
- Liczenie systemem Scepter jest dziesięciokrotnie szybsze niż hemocytometria i szybsze również niż inne automatyczne liczniki. Na Rysunku 5 przedstawiono liczenie komórek SF9, MCF7 i HEK293 metodami opisanymi w tym filmie.
- Zarejestrowano średni czas potrzebny na pomiar stężenia komórek. Należy zauważyć, że hemocytometria była wykonywana tylko raz na próbkę.
- Scepter wykonuje pomiary w oparciu o rozmiar komórek. W związku z tym wszelkie zmiany w morfologii komórkowej mogą zostać uchwycone na histogramie. Zdrowe kultury wykazują prawidłowy, dzwonowaty rozkład Gaussa, podczas gdy komórki niezdrowe ulegają lizie, co powoduje przesunięcie histogramu w lewo (Rysunek 6, panel lewy).
- Podobnie, gdy populację składającą się w 50% z martwych komórek zmieszano z 50% żywych komórek, zaobserwowano również przesunięcia histogramu (Rysunek 6, panel prawy).
Dyskusja
Porównując wydajność licznika komórek Scepter z wynikami uzyskanymi przy użyciu innych metod liczenia, stwierdzamy, że ten nowy, automatyczny, ręczny licznik komórek zapewnia precyzyjne, szybkie i wiarygodne zliczanie komórek w szerokim zakresie operacyjnym. Funkcjonalność licznika Scepter jest wynikiem precyzyjnie zaprojektowanej technologii wbudowanej w końcówkę czujnika oraz zaawansowanej aparatury pomiarowej opartej na zasadzie Coulter'a. Jakość działania sugeruje, że metoda liczenia Scepter pozwala na zwiększenie szybkości i poprawę powtarzalności testów opartych na komórkach. Format ręczny umożliwia szybkie i wygodne liczenie bezpośrednio w dygestorium do hodowli komórkowych.
Oświadczenia
Kathleen Ongena, Chandreyee Das, Janet L. Smith, Sónia Gil i Grace Johnston są zatrudnione przez firmę Millipore, która produkuje instrumenty wykorzystane w niniejszym artykule.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ręczny automatyczny licznik komórek Scepter 2.0 z czujnikami Scepter 40 μm | EMD Millipore | PHCC20040 | |
| Ręczny automatyczny licznik komórek Scepter 2.0 z czujnikami Scepter 60 μm | EMD Millipore | PHCC20060 | |
| Czujniki Scepter, 60 μm | EMD Millipore | PHCC60050 | Opakowanie 50 czujników |
| Czujniki Scepter, 40 μm | EMD Millipore | PHCC40050 | Opakowanie 50 czujników |
| Uniwersalny adapter zasilania | EMD Millipore | PHCCPOWER | |
| Zestaw pierścieni O-ring Scepter | EMD Millipore | PHCCOCLIP | 2 pierścienie O-ring i jedna pokrywa filtra |
Bibliografia
- Barghshoon, S. Cell Counting Survey. , Millipore. (2009).
- Tucker, K. G., Chalder, S., al-Rubeai, M., Thomas, C. R. Measurement of hybridoma cell number, viability, and morphology using fully automated image analysis. Enzyme Microb Technol. 16 (1), 29-35 (1994).
- Houwen, B. Fifty years of hematology innovation: the Coulter principle. , Medical Laboratory Observer. (2003).
Przedruki i uprawnienia
