Przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania pierwotnych komórek wydzielonych z embrionów Drosophila. Zdolność do przeprowadzania skutecznej perturbacji RNAi, wraz z innymi molekularnymi, biochemicznymi i obrazowymi metodami analizy komórek, pozwoli na rozstrzygnięcie wielu kwestii badawczych w pierwotnych komórkach Drosophila.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Podstawowe hodowle komórkowe z embrionów Drosophila w stadium gastruli
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opisujemy tutaj metodę przygotowania i hodowli pierwotnych komórek wydzielonych z embrionów Drosophila w stadium gastruli. W skrócie, dużą ilość embrionów o określonym stadium rozwoju, pochodzących od młodych i zdrowych muszek, poddaje się sterylizacji, a następnie dysocjacji fizycznej w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek przy użyciu homogenizatora szklanego. Po wysianiu na płytki hodowlane lub szkiełka z komorą przy odpowiedniej gęstości w medium hodowlanym, komórki te mogą ulegać dalszej różnicowaniu w kilka morfologicznie odrębnych typów komórek, które można zidentyfikować za pomocą specyficznych markerów komórkowych. Ponadto przedstawiamy warunki traktowania tych komórek dwuniciowym (ds) RNA w celu wywołania wyciszenia genów. Efektywny RNAi w pierwotnych komórkach Drosophila osiąga się poprzez proste inkubowanie komórek w medium hodowlanym zawierającym dsRNA. Możliwość przeprowadzania skutecznych perturbacji za pomocą RNAi, wraz z innymi analizami molekularnymi, biochemicznymi oraz obrazowaniem komórkowym, pozwoli na udzielenie odpowiedzi na szereg pytań badawczych w pierwotnych komórkach Drosophila, szczególnie tych związanych z zróżnicowanymi komórkami mięśniowymi i neuronalnymi.
Protokół
1. Przygotowanie klatek dla much
- Hodować Drosophila (szczepy typu dzikiego, takie jak Oregon-R lub dowolny genotyp) w odpowiednich pojemnikach, na przykład w kubkach dla owadów o pojemności 32 oz.
- Przenieść nowo wyklute muchy do dużych klatek do zbierania embrionów lub klatek dla populacji much.
- Przenieść klatki do pomieszczenia o temperaturze ~25 °C i wilgotności ~65% w cyklu 12 h światła i 12 h ciemności, aby ułatwić zbieranie synchronicznych embrionów.
- Utrzymywać muchy w klatkach, podając im pastę z zabitych drożdży naniesioną na płytki z melasą. Wymieniać płytki z melasą (z pastą z zabitych drożdży) raz dziennie przez....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wzorzec rozwojowy kultur pierwotnych komórek Drosophila może znacznie się różnić, co prawdopodobnie wynika z wielu zmiennych występujących podczas procesu przygotowania komórek pierwotnych. Po pierwsze, muchy wykorzystywane do składania jaj powinny być młode (do tygodnia życia) i zdrowe (wolne od infekcji wirusowych lub bakteryjnych). Należy unikać zarodków niezapłodnionych lub zainfekowanych, ponieważ są one bezużyteczne, a komórki z nich pochodzące nie mogą ulegać różnicowaniu i przeżywają jedynie 1-2 dni. Po .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
J.B. otrzymał wsparcie w ramach stypendium DRG-1716-02 fundacji Damon Runyon Cancer Research Foundation. J.Z. otrzymał wsparcie w ramach stypendium NIH/NIGMS F32 GM082174-02. N.P. jest badaczem w Howard Hughes Medical Institute.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pożywka Shields and Sang M3 | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| Płodowa surowica bydlęca | JRH Biosciences | 12103-500M | |
| Insulina z trzustki bydlęcej | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Duże klatki do zbierania embrionów | Genesee Scientific | 59-101 | |
| Sito testowe standardu US #25 | VWR international | 57334-454 | |
| Sito testowe standardu US #45 | VWR international | 57334-462 | |
| Sito testowe standardu US #120 | VWR international | 57334-474 | |
| Homogenizator tkankowy Dounce, Wheaton 7 mL | VWR international | 62400-620 | |
| Homogenizator tkankowy Dounce, Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0040 | |
| Homogenizator tkankowy Dounce, Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0100 | |
| Costar, płytka 384-dołkowa | VWR international | 29444-078 | |
| Pokrywek szkiełkowy z komorami Lab-Tek II | Fisher Scientific | 171080 |
Bibliografia
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Laboratory culture of Drosophila. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 588-599 (1999).
- Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elong....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
