Przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania pierwotnych komórek wydzielonych z embrionów Drosophila. Zdolność do przeprowadzania skutecznej perturbacji RNAi, wraz z innymi molekularnymi, biochemicznymi i obrazowymi metodami analizy komórek, pozwoli na rozstrzygnięcie wielu kwestii badawczych w pierwotnych komórkach Drosophila.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Podstawowe hodowle komórkowe z embrionów Drosophila w stadium gastruli
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opisujemy tutaj metodę przygotowania i hodowli pierwotnych komórek wydzielonych z embrionów Drosophila w stadium gastruli. W skrócie, dużą ilość embrionów o określonym stadium rozwoju, pochodzących od młodych i zdrowych muszek, poddaje się sterylizacji, a następnie dysocjacji fizycznej w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek przy użyciu homogenizatora szklanego. Po wysianiu na płytki hodowlane lub szkiełka z komorą przy odpowiedniej gęstości w medium hodowlanym, komórki te mogą ulegać dalszej różnicowaniu w kilka morfologicznie odrębnych typów komórek, które można zidentyfikować za pomocą specyficznych markerów komórkowych. Ponadto przedstawiamy warunki traktowania tych komórek dwuniciowym (ds) RNA w celu wywołania wyciszenia genów. Efektywny RNAi w pierwotnych komórkach Drosophila osiąga się poprzez proste inkubowanie komórek w medium hodowlanym zawierającym dsRNA. Możliwość przeprowadzania skutecznych perturbacji za pomocą RNAi, wraz z innymi analizami molekularnymi, biochemicznymi oraz obrazowaniem komórkowym, pozwoli na udzielenie odpowiedzi na szereg pytań badawczych w pierwotnych komórkach Drosophila, szczególnie tych związanych z zróżnicowanymi komórkami mięśniowymi i neuronalnymi.
Protokół
1. Przygotowanie klatek dla much
- Hodować Drosophila (szczepy typu dzikiego, takie jak Oregon-R lub dowolny genotyp) w odpowiednich pojemnikach, na przykład w kubkach dla owadów o pojemności 32 oz.
- Przenieść nowo wyklute muchy do dużych klatek do zbierania embrionów lub klatek dla populacji much.
- Przenieść klatki do pomieszczenia o temperaturze ~25 °C i wilgotności ~65% w cyklu 12 h światła i 12 h ciemności, aby ułatwić zbieranie synchronicznych embrionów.
- Utrzymywać muchy w klatkach, podając im pastę z zabitych drożdży naniesioną na płytki z melasą. Wymieniać płytki z melasą (z pastą z zabitych drożdży) raz dziennie przez 2-3 d.
2. Pobieranie synchronicznych zarodków
- W dniu przygotowania komórek pierwotnych, podać muchom świeże płytki pokryte pastą z zabitych drożdży w okresie przedskładania jaj trwającym 1-2 h.
- Tuż przed 12-godzinnym cyklem ciemności, zastąpić płytki do przedskładania świeżymi płytkami z melasą, posianymi minimalną ilością pasty drożdżowej. Usunąć zebrane wcześniej jaja, które zawierają asynchroniczne, starsze embriony.
- Zbierać embriony przez okres 1-2 h.
- Zdjąć płytki zawierające względnie synchronizowaną populację embrionów i przechowywać je w temperaturze 25°C przez 5-6 h. W tym czasie embriony będą znajdować się w zaawansowanym stadium gastrulacji.
3. Zbieranie i przemywanie zarodków
- Poluźnić zarodki z płytek za pomocą mokrego pędzla, a następnie dokładnie opłukać je letnią wodą z kranu przez zestaw sit ułożonych jedno na drugim, tak aby zarodki zebrały się w sicie o najgęstszym oczku na dole. Płukać przez kilka minut, aby usunąć jak najwięcej drożdży i resztek muchy.
- Przechylić sita tak, aby zarodki zgromadziły się z jednej strony, a następnie delikatnie spłukać je z sita do koszyka do dechorionacji.
- Przenieść próbki do strefy z dygestorium do hodowli tkankowych, nie dopuszczając do wyschnięcia zarodków.
4. Homogenizacja zarodków i wysiew komórek
- Zsterylizuj i usuń chorion z embrionów, zanurzając je w 50% (vol/vol) roztworze wybielacza na 5-10 min. Spłucz embriony ze ścianek koszyka 70% (vol/vol) etanolem. Alternatywnie, przed obróbką etanolem wypłucz wybielacz z embrionów wodą destylowaną. Od tego momentu embriony należy manipulować w warunkach sterylnych, w komorze do hodowli tkankowej.
- Dokładnie wypłucz embriony autoklawowaną wodą destylowaną, aby usunąć wybielacz i/lub etanol.
- Podczas etapu usuwania chorionu napełnij homogenizator Dounce odpowiednią objętością pożywki M3 w temperaturze pokojowej, w zależności od liczby embrionów. Stosunek objętości embrionów do objętości pożywki nie powinien przekraczać 0,5 ml embrionów na 40 ml pożywki (lub ~100-200 embrionów/ml).
- Umieść wypłukane embriony w wysterylizowanym zlewce z ilością pożywki M3 wystarczającą do ich całkowitego zanurzenia. Pozostaw embriony do namoczenia na 2-5 min.
- Zdemontuj koszyki do usuwania chorionu i osusz siatkę Nitex sterylnymi ręcznikami papierowymi.
- Przenieś embriony do homogenizatora za pomocą wysterylizowanego pędzla.
- Homogenizuj delikatnie, wykonując krótkie ruchy luźnym tłokiem, nie docierając do dna probówki, aż wszystkie embriony zostaną zawieszone. Następnie delikatnie, ale zdecydowanie, homogenizuj, wykonując osiem pełnych ruchów. Nie obracaj tłoka podczas ruchu w górę i w dół.
- Przenieś homogenizat do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, przelewając go lub pipetując, a następnie zakręć probówkę.
- Wiruj przez 10 min przy 40g w temperaturze pokojowej, aby osadzić resztki tkanek, duże skupiska komórek i błony żółtkowe. Przenieś nadosad zawierający komórki i żółtko do czystej probówki i powtórz etap wirowania przez 5 min.
- Ostrożnie przenieś nadosad, przelewając go lub pipetując do czystej probówki, i wiruj przez 10 min przy 360g w temperaturze pokojowej, aby osadzić komórki. Odlej nadosad. Resuspenduj osad komórkowy w 10 ml pożywki hodowlanej (pożywka bezsurowicza w przypadku eksperymentów RNAi).
- Policz żywe komórki za pomocą hemocytometru, aby oszacować gęstość komórek. W międzyczasie powtórz krok 4.10, aby ponownie osadzić komórki.
- Resuspenduj komórki do pożądanej koncentracji. Na początek wypróbuj zakres 1~5 x106 komórek /ml i wysiej w gęstości od 1,7 do 2,5 x105 komórek /cm2.
5. RNAi w komórkach pierwotnych hodowanych na płytce 384-dołkowej
- Do każdej studzienki płytki 384-dołkowej nanieś 5 μl dsRNA, tak aby końcowe stężenie wynosiło ~250 ng na studzienkę.
- Za pomocą pipety wielokanałowej nanieś 10 ml (1~4x106 komórek/ml) komórek pierwotnych na studzienkę w bezserwatkowym medium M3 do płytki 384-dołkowej, w której każda studzienka zawiera inny dsRNA. Alternatywnie komórki można hodować na szklanych szkiełkach do komór 8-dołkowych w celu obrazowania konfokalnego.
- Wiruj płytki przez 1 min przy 300g w temperaturze pokojowej. Hoduj komórki w bezserwatkowym medium w temperaturze 25°C przez 22 h lub w temperaturze 18°C przez 1-2 d.
- Do każdej studzienki dodaj 30 ml medium hodowlanego z dodatkiem surowicy.
- Wiruj płytki przez 1 min przy 300g w temperaturze pokojowej.
- Umieść płytki w wilgotnej komorze i hoduj komórki pierwotne przez kolejne 5~7 d w temperaturze 25°C.
- Wykonaj obrazowanie komórek na żywo lub po barwieniu immunofluorescencyjnym.
6. Reprezentatywne wyniki:
W optymalnych warunkach komórki w hodowli będą wyglądać zdrowo i posiadać okrągłą morfologię. Hodowla będzie zawierać niewielką ilość szczątków komórkowych i osiągnie 50~80% konfluencji po początkowym wysiewie. Komórki te ulegną zmianom morfologicznym po dłuższym okresie hodowli. Zazwyczaj pełne zróżnicowanie komórek w hodowli w temperaturze 25°C zajmuje około 5-8 dni. O dobrej jakości hodowli pierwotnych zazwyczaj sądzi się po stopniu zróżnicowania interesujących nas komórek w kulturze. Na przykład pierwotne komórki mięśniowe często mają morfologię rozgałęzioną i przekształcają się w wielojądrowe miotuby z prążkowanymi miofibrylami składającymi się z serii sarkomerów. W pełni zróżnicowane miotuby zazwyczaj poruszają się w hodowli spontanicznie. Z kolei zróżnicowane pierwotne neurony tworzą skupiska swoimi ciałami komórkowymi i łączą się z innymi skupiskami za pomocą aksonów.
Rysunek 1. Komórki pierwotne przechodzą zmiany morfologiczne po wysianiu w hodowli
(A) Obraz w jasnym polu komórek pierwotnych bezpośrednio po wysianiu w studzience płytki 384-dołkowej. Większość komórek jest okrągła, nienaruszona i dobrze oddzielona od siebie. (B) Obraz w jasnym polu hodowli komórek pierwotnych 20 godzin po wysianiu. Komórki pierwotne tworzą już skupiska (duża strzałka z grotem), a na tym etapie można rozpoznać mięśnie o morfologii rozgałęzionej (długa strzałka). (C) Obraz w kontraście fazowym hodowli pierwotnej 5 dni po wysianiu. Hodowla wygląda na znacznie bardziej rozwiniętą, z widocznymi wypustkami neuronalnymi (małe strzałki), skupiskami neuronalnymi (duże strzałki z grotem) oraz mięśniami (strzałka średniej wielkości).
Rycina 2. Przykłady komórek pierwotnych traktowanych dsRNA hodowanych na płytce 384-dołkowej
Komórki pierwotne wyizolowano z embrionów niosących transgeny Dmef2-Gal4, D42-Gal4 oraz UAS-mito-GFP, w których Dmef2-Gal4 i D42-Gal4 sterują ekspresją mito-GFP odpowiednio w mięśniach i neuronach ruchowych. Komórki traktowano dsRNA celującymi w lacZ (A-C) lub inflated(if) (D-F). Zarówno pierwotne komórki mięśniowe, jak i neurony są widoczne dzięki GFP (A, C, D, F). Białe strzałki wskazują wypustki neuronalne. Barwienie aktyny faloidyną (groty strzałek) ujawnia rozgałęzioną strukturę mięśni w hodowli traktowanej dsRNA lacZ (B i C), natomiast zaokrągloną morfologię mięśni w hodowli traktowanej dsRNA if (E i F). Na obrazach z nałożeniem (C, F) mięśnie są zabarwione na żółto, natomiast kolor czerwony wskazuje neurony i ich wypustki (białe strzałki).
Rysunek 3. Mikrografie konfokalne pierwotnych mięśni hodowanych na szkiełkach podstawowych pokrytych ludzką witronektyną
Pierwotne mięśnie poddano barwieniu immunofluorescencyjnemu przeciwko titynie Drosophila (KZ) (kolor czerwony na obrazie złożonym) oraz faloidyną na aktynę (kolor zielony na obrazie złożonym). Górne panele przedstawiają kontrolny mięsień typu dzikiego, a dolne mięsień sals(CG31374) RNAi z upośledzonymi, skróconymi sarkomerami.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wzorzec rozwojowy kultur pierwotnych komórek Drosophila może znacznie się różnić, co prawdopodobnie wynika z wielu zmiennych występujących podczas procesu przygotowania komórek pierwotnych. Po pierwsze, muchy wykorzystywane do składania jaj powinny być młode (do tygodnia życia) i zdrowe (wolne od infekcji wirusowych lub bakteryjnych). Należy unikać zarodków niezapłodnionych lub zainfekowanych, ponieważ są one bezużyteczne, a komórki z nich pochodzące nie mogą ulegać różnicowaniu i przeżywają jedynie 1-2 dni. Po ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
J.B. otrzymał wsparcie w ramach stypendium DRG-1716-02 fundacji Damon Runyon Cancer Research Foundation. J.Z. otrzymał wsparcie w ramach stypendium NIH/NIGMS F32 GM082174-02. N.P. jest badaczem w Howard Hughes Medical Institute.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pożywka Shields and Sang M3 | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| Płodowa surowica bydlęca | JRH Biosciences | 12103-500M | |
| Insulina z trzustki bydlęcej | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Duże klatki do zbierania embrionów | Genesee Scientific | 59-101 | |
| Sito testowe standardu US #25 | VWR international | 57334-454 | |
| Sito testowe standardu US #45 | VWR international | 57334-462 | |
| Sito testowe standardu US #120 | VWR international | 57334-474 | |
| Homogenizator tkankowy Dounce, Wheaton 7 mL | VWR international | 62400-620 | |
| Homogenizator tkankowy Dounce, Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0040 | |
| Homogenizator tkankowy Dounce, Kontes 40 mL | VWR international | KT885300-0100 | |
| Costar, płytka 384-dołkowa | VWR international | 29444-078 | |
| Pokrywek szkiełkowy z komorami Lab-Tek II | Fisher Scientific | 171080 |
Bibliografia
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Laboratory culture of Drosophila. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 588-599 (1999).
- Bai, J., Hartwig, J. H., Perrimon, N. S. A. L. S. a WH2-domain-containing protein, promotes sarcomeric actin filament elongation from pointed ends during Drosophila muscle growth. Dev. Cell. 13, 828-842 (2007).
- Bai, J. RNA interference screening in Drosophila primary cells for genes involved in muscle assembly and maintenance . Development. 135, 1439-1449 (2008).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PloS. Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Donady, J. J., Fyrberg, E. Mass culturing of Drosophila embryonic cells in vitro. TCA Manual. 3, 685-687 (1977).
- Seecof, R. L., Alleaume, N., Teplitz, R. L., Gerson, I. Differentiation of neurons and myocytes in cell cultures made from Drosophila gastrulae. Exp. Cell Res. 69, 161-173 (1971).
- Bai, J., Sepp, K. J., Perrimon, N. Culture of Drosophila primary cells dissociated from gastrula embryos and their use in RNAi screening. Nature Protocols. 4, 1502-1512 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
