Po zidentyfikowaniu genu jako potencjalnie odpornego na malarię, należy ocenić jego rolę w zapobieganiu infekcjom Plasmodium w organizmie komara. Niniejszy protokół ilustruje sposób przeprowadzania analizy stopnia infekcji komarów przez Plasmodium. Przedstawiono techniki przygotowania hodowli gametocytów, karmienia komarów krwią ludzką przez membranę oraz oznaczania mian wirusów w jelicie środkowym komara.
Artykuł metodologiczny
Protokół zakażania komarów *Plasmodium falciparum* i określania fenotypu zakażenia
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Po zidentyfikowaniu genu jako potencjalnie opornego na malarię, należy ocenić jego rolę w zapobieganiu zakażeniom *Plasmodium* w organizmie komara. Niniejszy protokół ilustruje sposób przeprowadzania analizy zakresu zakażeń komarów *Plasmodium*. Przedstawiono techniki przygotowania hodowli gametocytów, karmienia komarów krwią ludzką przez membranę oraz oznaczania miana wirusa w jelicie środkowym komara.
Protokół
A. Przygotowanie hodowli gametocytów>:
- Doprowadzić świeżą ludzką krew i surowicę do temperatury 37oC w łaźni wodnej.
- W dygestorium, w warunkach sterylnych, pipetować 1 mL ocieplonej krwi do probówki typu Eppendorf. Wirować krew w wirówce przez 5 minut przy 2200 rpm. Erytrocyty powinny utworzyć osad; usunąć i wylać klarowną surowicę. Przemyć erytrocyty równą objętością nowej surowicy 3 razy, aby uzyskać krew pełną dla gametocytów.
- Wyjąć hodowlę gametocytów z inkubatora CO2 lub słoika z utleniaczem (candle jar). Hodowlę tę należy prowadzić na podłożu RPMI i podawać komarom w 16. dniu hodowli. Aby określić % gametocytemii (w 16. dniu hodowli), przygotować cienki rozmaz z jednej kropli krwi na szkiełku przedmiotowym i wykonać barwienie Giemsą. Określić liczbę gametocytów w polu widzenia hodowli pasożytów. Zazwyczaj mieści się ona w zakresie 2 - 4%. Obliczyć objętość krwi pełnej potrzebną do uzyskania pożądanego końcowego % gametocytemii (0,3 - 1%).
- Usunąć większość podłoża z hodowli gametocytów za pomocą pipety, uważając, aby nie zakłócić i nie wessać pasożytów (pasożyty będą widoczne jako czarne, podczas gdy podłoże będzie jasnoróżowe/czerwone). Pipetować pozostałe podłoże i pasożyty do probówki Falcon 15 ml. Wirować w wirówce przez 5 minut przy 2200 rpm. Pasożyty i erytrocyty utworzą osad; usunąć i wylać nadsącz z podłoża, nie zakłócając osadu pasożytów.
- Połączyć pasożyty z objętością przygotowanej krwi pełnej (z kroku A2), aby uzyskać pożądaną końcową gametocytemię zgodnie z wcześniejszymi obliczeniami. Mieszać dokładnie za pomocą pipety (~1 minuta).
Jest to próbka, którą podadzą Państwo komarom. Przechowywać w 37oC w łaźni wodnej.
B. Karmienie komarów>:
- Umieść komary Anopheles (~30-50 osobników) w wyłożonych woskiem kubkach tekturowych przykrytych siatką zabezpieczoną gumką recepturką lub tekturową pokrywką dołączoną do kubka. Na tym etapie używamy aspiratora zasilanego bateryjnie.
- Przygotuj cyrkulacyjną łaźnię wodną, mocując dysze po obu stronach szklanych karmników do gumowych rurek. Połącz szeregowo tyle karmników, ile jest potrzebnych; jeden koniec szeregu powinien być połączony rurką z cyrkulatorem łaźni wodnej (częścią, która tłoczy wodę przez karmniki), a drugi koniec szeregu powinien składać się z gumowej rurki zanurzonej w łaźni, aby umożliwić odpływ cyrkulującej wody z powrotem do łaźni. Włącz łaźnię, aż woda osiągnie temperaturę około 37oC i zacznie cyrkulować przez karmniki z powrotem do łaźni. Jest to niezbędne, aby krew pozostała ciepła i aby pasożyty przeżyły.
- Przygotuj membranę (używamy małych kwadratów rozciągniętej parafimy), naciągając ją wokół szklanego karmnika membranowego i dociskając w celu szczelnego zamknięcia otworu karmnika. Membrana ta będzie imitować skórę.
- Umieść jeden karmnik stroną z membraną do dołu na każdym kubku z komarami i zabezpiecz karmniki za pomocą zacisków lub taśmy. Membrana powinna przylegać do siatki, aby komary miały do niej dostęp z wnętrza kubka.
- Ostrożnie pipetuj posiłek z krwi z pasożytami (z kroku A5) do szyjki karmnika, upewniając się, że krew przedostanie się przez całą szyjkę do zbiornika i zetknie się z membraną, tak aby komary miały dostęp do krwi. Używamy około 200 μl krwi na karmnik, ale ilość ta może się różnić.
- Pozostaw komary do żerowania. Pozwalamy im żerować przez ≈30 minut (czas zmienny w zależności od eksperymentu; w większości eksperymentów okresowo monitorujemy, ile osobników już pobrało posiłek, obserwując zawartość krwi w odwłoku).
- Po żerowaniu usuń karmniki z kubków z komarami. Wyłącz łaźnię wodną i odłącz karmniki od rurek.
- Usuń membranę i namocz karmniki w 10% wybielaczu w celu dekontaminacji, a następnie wypłucz wodą. Umieść zanieczyszczone materiały (membrany, ręczniki papierowe, rękawiczki itp.) w małym worku na odpady biologiczne i wyrzuć do dużego pojemnika na odpady biologiczne.
- Uśpij komary, umieszczając kubki w lodówce lub pomieszczeniu chłodniczym. Gdy komary zostaną całkowicie uśpione, przenieś je na szalkę Petriego umieszczoną w wiadrze z lodem. Posortuj komary, uważnie obserwując odwłoki pod kątem jakichkolwiek oznak pobrania posiłku z krwi, i odrzuć te, które nie żerowały. Niektóre komary będą całkowicie przepełnione krwią, podczas gdy inne będą wykazywać wąski pas spożytej krwi; wszystkie są akceptowalne jako „nakarmione”. Włóż nakarmione komary z powrotem do kubków tekturowych.
- Zapewnij komarom posiłek cukrowy (kawałek waty nasączony 10% sacharozą) i inkubuj w normalnych warunkach insektarium przez 7 dni. Codziennie należy monitorować wskaźnik śmiertelności komarów. Ponadto wata powinna być stale wilgotna od sacharozy, aby owady nie były pozbawione pożywienia. Wskazane jest również dodanie ręcznika papierowego nasączonego wodą destylowaną, aby utrzymać odpowiednią wilgotność dla komarów. Komary te są zainfekowane P. falcipraum, dlatego należy zachować wszelkie środki ostrożności, aby żadne z nich nie uciekło z kubka. Najlepiej umieścić kubki w małej klatce dla podwójnej ochrony.
C. Disekcja jelit środkowych komarów i szacowanie liczby oocyst:
- Odessać komary (z kroku B) z tekturowych kubków za pomocą aspiratora zasilanego bateryjnie. Znieczulić komary znajdujące się w wyjmowanym zbiorniku aspiratora, przenosząc go do chłodni lub zakopując zbiornik w lodzie na co najmniej 5 minut lub do momentu, aż komary przestaną się poruszać.
- Przenieść znieczulone komary ze zbiornika do szklanej szalki Petri umieszczonej w lodzie. Rozłożyć komary w jednej warstwie i przykryć plastikową pokrywą szalki. Komary, które nie zmieściły się na szalce, pozostawić w zbiorniku i zwrócić go do chłodni lub lodu.
- Za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami przenieść pojedynczego komara z szalki do 100 ul PBS na szkiełku przedmiotowym umieszczonym pod mikroskopem sekcyjnym. Pozostałe komary pozostawić pod przykryciem w schłodzonej szalce Petri.
- Za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami chwycić komara za klatkę piersiową i tylną część odwłoka. Rozdzielić ciało, aż odsłoni się jelito środkowe. Użyć pęsety, aby usunąć nadmiar tkanki z jelita. Jelito wygląda jak biały, workowaty organ. Usunąć nadmiar tkanki z jelita. Umieścić jelito w jednym z dołków szkiełka przedmiotowego z 12 dołkami i zanurzyć w 5-10 μl 0,2% mercurochromu. Rozgnieść pozostałości ciała i wyrzucić na wilgotny ręcznik papierowy. Powtarzać czynność dla kolejnych komarów, aż szkiełko z 12 dołkami zostanie zapełnione. Przykryć zamocowane jelita szkiełkiem nakrywkowym.
- Zbadać jelita pod mikroskopem świetlnym, poszukując okrągłych oocyst, które barwią się na intensywny różowy kolor w kontraście do przeźroczystej lub bladoróżowej tkanki jelita. Policzyć oocysty, zapisać wynik i przejść do następnej próbki. Kontynuować procedurę dla wszystkich komarów ze wszystkich grup badawczych.
- Po zakończeniu przetrzeć szkiełko ręcznikiem papierowym. Ręcznik papierowy z jelitami oraz ręcznik z pozostałościami ciał umieścić w małym worku na odpady biologiczne i wyrzucić do kosza. Przez cały czas trwania procedury należy nosić rękawiczki. Należy zachować ostrożność, aby żadne zainfekowane komary nie uciekły.
Dyskusja
W procesie zakażania *Plasmodium* oraz określania fenotypu zakażenia mogą występować pewne różnice, a poszczególne laboratoria mogą stosować odmienne techniki.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Anopheles | Zwierzę | komary | ||
| Plasmodium falciparum | Zwierzę | pasożyt. Gametocyty o znanej gametocytemii. | ||
| probówki stożkowe 15 ml | tworzywo sztuczne | |||
| Surowica, krew | człowiek, O+ | |||
| 0,2% merkurochromu | ||||
| lamella szklana | płytka 12-dołkowa | |||
| mikroskop świetlny | ||||
| licznik komórek | ||||
| 10% roztwór wybielacza | ||||
| końcówki do pipet | do hodowli tkankowej | |||
| parafilm | ||||
| karmiarka dla komarów | szklane podajniki membranowe, rurki gumowe dopasowane do podajników | |||
| szalki Petriego | slass | |||
| pinceta precyzyjna | ||||
| PBS | bufor | 1X, sterylne | ||
| łaźnia wodna z cyrkulacją | ||||
| pipetman |
Bibliografia
- Avila, S. L., Ferreira, A. W. Malaria diagnosis: a review. Braz J Med Biol Res. 29 (4), 431-443 (1996).
- Bell, A. S., Ranford-Cartwright, L. C. A real-time PCR assay for quantifying Plasmodium falciparum infections in the mosquito vector. Int J Parasitol. 34 (7), 795-802 (2004).
- Collins, K. M., Hochberg, L. P., Ryan, P. R., Collins, W. E., Wirtz, R. A., Ryan, J. R. Quantification of Plasmodium malariae infection in mosquito vectors. Ann Trop Med Parasitol. 98 (5), 469-472 (2004).
- Czeher, C., Labbo, R., Djibrilla, A., Here, L., Arzika, I., Duchemin, J. B. ELISA study of oocyst-sporozoite transition in malaria vectors. Parasite. 13 (3), 257-261 (2006).
- Haghdoost, A. A., Mazhari, S., Bahadini, K. Comparing the results of light microscopy with the results of PCR method in the diagnosis of Plasmodium vivax. J Vector Borne Dis. 43 (2), 53-57 (2006).
- Patsoula, E., Spanakos, G., Sofianatou, D., Parara, M., Vakalis, N. C. A single-step, PCR-based method for the detection and differentiation of Plasmodium vivax. Ann Trop Med Parasitol. 97 (1), 15-21 (2003).
- Osta, M. A., Christophides, G. K., Kafatos, F. C. Effects of mosquito genes on Plasmodium development. Science. 303 (5666), 2030-2032 (2004).
- Srinivasan, P., Abraham, E. G., Ghosh, A. K., Valenzuela, J., Ribeiro, J. M., Dimopoulos, G., Kafatos, F. C., Adams, J. H., Fujioka, H., Jacobs-Lorena, M. Analysis of the Plasmodium and Anopheles transcriptomes during oocyst differentiation. J Biol Chem. 279 (7), 5581-5587 (2004).
Przedruki i uprawnienia
