Nasz protokół opisuje sposób wycinania brzusznego gruczołu mlekowego szczura oraz przygotowywania preparatów całych gruczołów mlekowych. Opisuje on również analizę morfologii gruczołu mlekowego z wykorzystaniem trzech punktów końcowych (liczba pąków końcowych, elongacja nabłonka i różnicowanie) oraz wykorzystanie tych wyników do przewidywania ryzyka raka piersi u szczurów poddanych modyfikacjom diety in utero lub w okresie przedpokwitaniowym.
Artykuł metodologiczny
Zmiany w morfologii gruczołów mlekowych a ryzyko raka piersi u szczurów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badania na modelach gryzoni z rakiem piersi wykazują, że ekspozycja na czynniki dietetyczne/hormonalne w okresie in utero oraz w okresie dojrzewania, kiedy gruczoł mlekowy przechodzi intensywny proces modelowania i remodelowania, zmienia podatność na nowotwory gruczołu mlekowego indukowane kancerogenami. Podobne wyniki opisano u ludzi: na przykład wysoka masa urodzeniowa zwiększa późniejsze ryzyko rozwoju raka piersi, a spożycie soi w diecie w dzieciństwie zmniejsza to ryzyko. Przypuszcza się, że te prenatalne i postnatalne modyfikacje dietetyczne wywołują trwałe zmiany morfologiczne w gruczole mlekowym, które z kolei modyfikują ryzyko raka piersi w późniejszym życiu. Zmiany morfologiczne te prawdopodobnie odzwierciedlają modyfikacje epigenetyczne, takie jak zmiany w metylacji DNA, histonach i ekspresji miRNA, które następnie wpływają na transkrypcję genów. W niniejszym artykule opisujemy, w jaki sposób zmiany w morfologii gruczołu mlekowego mogą pozwolić na przewidywanie ryzyka raka gruczołu mlekowego u szczurów. Nasz protokół szczegółowo opisuje sposób preparowania i usuwania brzusznego gruczołu mlekowego szczura oraz sposób przygotowania całych preparatów gruczołu mlekowego. Opisano również, jak analizować morfologię gruczołu mlekowego według trzech punktów końcowych (liczba pąków końcowych, elongacja nabłonka i różnicowanie) oraz jak wykorzystać te dane do przewidywania ryzyka rozwoju raka gruczołu mlekowego.
Protokół
1. Usunięcie brzusznego gruczołu mlekowego i przygotowanie preparatu całego organu
- Uśmierć zwierzę zgodnie z wytycznymi IACUC. Przypnij zwierzę na plecach za nogi za pomocą igieł lub przyklej nogi taśmą do płytki operacyjnej, a następnie przemyj skórę etanolem (EtOH). Delikatnie unieś skórę pęsetą i za pomocą ostrych nożyczek wykonaj cięcie w linii środkowej skóry, zaczynając pomiędzy piersiami z pary nr 5, prowadząc cięcie w stronę szyi. Wykonaj cięcie w kształcie odwróconej litery Y od linii środkowej w kierunku tylnych kończyn. Jeśli planowane jest również pobranie gruczołów mlecznych klatki piersiowej, wykonaj cięcie w kształcie litery Y od linii środkowej pomiędzy piersiami z pary nr 2 w kierunku przednich kończyn.
- Rozcinaj skórę nożyczkami po jednej stronie odwróconej litery Y, aby odsłonić jamy brzuszne gruczoły mleczne nr 4; gruczoły mleczne są przytwierdzone do skóry. Przypnij skórę igłami do płytki operacyjnej, aby całkowicie odsłonić gruczoł. Pracuj nad jedną stroną i jednym gruczołem na raz.
- Oddziel gruczoł mleczny od skóry za pomocą ostrych nożyczek i/lub skalpela, zaczynając od obszaru proksymalnego blisko sutka i przesuwając się w stronę końca dystalnego gruczołu, w kierunku kręgosłupa zwierzęcia. (Może to zająć kilka minut, zwłaszcza w przypadku starszczego szczura).
- Natychmiast rozłóż oddzielony gruczoł na odpowiednio opisanym szkiełku przedmiotowym (użyj trwałego markera i/lub „rylnicy diamentowej”), rozkładając gruczoł ostrożnie zgodnie z jego pierwotnym rozmiarem i kształtem in situ. Szkiełko przedmiotowe musi być większe od gruczołu. Po rozłożeniu gruczołu na szkiełku pozostaw go na stole przez chwilę, aby gruczoł przywarł do szkła, ale nie dopuść do jego wyschnięcia.
- Włóż szkiełko do słoika zawierającego utrwalacz Carnoya (75% lodowaty kwas octowy, 25% absolutny etanol=EtOH); pozostaw do utrwalenia w temperaturze pokojowej (RT) pod wyciągiem przez 2 dni lub dłużej. Szkiełka mogą pozostać w utrwalaczu przez dłuższy czas.
- Przemyj szkiełka w 70% EtOH przez 1 godzinę w RT.
- Opłucz w wodzie destylowanej przez 30 min w RT.
- Barwi w barwniku Carmine Alum*) przez 2 dni lub dłużej (aż zauważysz, że węzły chłonne zostały całkowicie zabarwione; sprawdź tył szkiełka).
- Przemyj w rosnących stężeniach EtOH, po 1 godzinie w każdym: 70% -> 95% -> 10%. Po ostatnim płukaniu w absolutnym EtOH umieść gruczoły w ksylenie. Pozostaw pod wyciągiem w RT przez co najmniej 2 dni. Ten ostatni krok to przejaśnianie gruczołu mlecznego, co oznacza odtłuszczanie tkanki tłuszczowej gruczołu i następujący po tym wzrost przezroczystości. Im bardziej tłusty jest gruczoł, tym dłuższy czas przejaśniania jest wymagany.
- Zamknij preparaty szkiełek przykrywkami, używając medium montażowego, takiego jak Permount. Pozostaw szkiełka do całkowitego wyschnięcia (kilka dni) przed obserwacją pod stereomikroskopem.
*Barwnik Carmine Alum:
Wprowadź 1 g karminu (Sigma C1022) i 2,5 g siarczanu glino-potasowego (Sigma A7167) do 500 mL wody destylowanej i gotuj przez 20 min. Doprowadź objętość końcową do 50 mL wodą. Przefiltruj i przechowuj w lodówce. Roztwór może być używany przez kilka miesięcy. Wymień, gdy kolor stanie się słaby.
2. Analiza morfologii całego preparatu gruczołu mlekowego
Morfologię preparatów całych gruczołów mlekowych analizuje się pod kątem następujących punktów końcowych, a wyniki koreluje się z ryzykiem wystąpienia raka piersi.
- Całkowity preparat gruczołu mlekowego w dniu PND 21 (wiek przedpokwitkowy):
- Wzrost nabłonkowy:
- Odległość od sutka do końca drzewa nabłonkowego (w milimetrach), mierzona przy użyciu linijki
- Potencjał do transformacji złośliwej:
- Liczba TEB (pączków końcowych), policzona pod mikroskopem świetlnym. TEB to największe struktury cebulowate, zlokalizowane wyłącznie na dystalnym końcu nabłonkowego drzewa mlekowego
- Różnicowanie:
- Ocena AB1 (pączek pęcherzykowy) (0-5). Pączki pęcherzykowe są rozmieszczone w całym nabłonku.
- Ocena AB2 (0-5)
Preparaty całkowite są oceniane pod mikroskopem świetlnym. Wartości ocen AB1 i AB2 są sumowane w celu uzyskania końcowego wyniku różnicowania. - Wzrost nabłonkowy:
- Całkowity preparat gruczołu mlekowego pobrany w dniu PND 50 (wiek pokwitkowy):
- Wzrost nabłonkowy:
- Odległość od węzła chłonnego do końca drzewa nabłonkowego (w milimetrach), mierzona przy użyciu linijki.
- Odległość od wierzchołka drzewa nabłonkowego do końca poduszki tłuszczowej, mierzona przy użyciu linijki.
- Potencjał do transformacji złośliwej:
- Liczba TEB, policzona pod mikroskopem świetlnym
- Różnicowanie:
- Ocena AB1 (0-5)
- Ocena AB2 (0-5)
- Ocena lobul (0-5)
Preparaty całkowite są oceniane pod mikroskopem świetlnym. Różnicowanie zostanie ocenione na dwa sposoby. Po pierwsze, wartości ocen AB1, AB2 i lobul są sumowane w celu uzyskania końcowego wyniku różnicowania. Dodatkowo obliczony zostanie stosunek oceny lobul do sumy ocen AB1+AB2. Pączki pęcherzykowe różnicują się w lobule, zatem im wyższy stosunek lobul do AB, tym bardziej zróżnicowany jest gruczoł. - Wzrost nabłonkowy:
3. Palpacja i pomiar guzów sutriczych u szczurów oraz korelacja z morfologią gruczołów mlekowych
- Aby rozpocząć tę procedurę, należy utrzymać szczura, obejmując całe ciało dłonią opartą o grzbiet, z palcem wskazującym za głową oraz kciukiem i palcem środkowym pod przeciwległą pachą. Przebukuj szczura na grzbiet i przeprowadź palpację w celu wykrycia ewentualnych guzów piersiowych; wyczuwalne guzy powinny przypominać „grudkę”.
- Następnie za pomocą suwmiarki zmierz szerokość, długość i wysokość guza. Oblicz objętość guza, korzystając ze wzoru na elipsoidę: Objętość = 1/6πabc, gdzie „a” = szerokość, „b” = długość i „c” = wysokość.
- Lokalizację i wielkość guza zapisuj ręcznie w zeszycie raz w tygodniu. Dane te zostaną później przeniesione do arkusza kalkulacyjnego.
4. Reprezentatywne wyniki
Staranna dysekcja tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego oraz jej przygotowanie do analizy całego preparatu (wholemount) pozwalają na ocenę stanu rozwojowego gruczołu mlekowego. Przy prawidłowym wykonaniu każdego etapu, całe drzewo nabłonka gruczołu mlekowego jest wyraźnie widoczne w obrębie tkanki tłuszczowej, co umożliwia łatwe określenie liczby TEB oraz obliczenie gęstości pączków pęcherzykowych i lobul. Błędy w przygotowaniu preparatów całego organu mogą obejmować niepełną dysekcję tkanki tłuszczowej, niewystarczającą fiksację oraz niewłaściwe przejaśnianie.
Ocena morfologii gruczołu piersiowego dostarczy informacji o liczbie struktur, z których mogą rozwijać się guzy piersi (TEB), stopniu zróżnicowania struktur nabłonkowych (pąki pęcherzykowe i lobule) oraz mierze wzrostu (wydłużenie przewodów). Ważne jest odróżnienie TEB od końców terminalnych; te drugie znajdują się na dystalnym końcu nabłonka, podobnie jak TEB, jednak są od nich mniejsze i nie prowadzą do powstania nowotworów złośliwych. Końce terminalne są również widoczne w obrębie drzewa nabłonkowego.
Rysunek 1: Reprezentatywny wynik prawidłowo przygotowanego preparatu całego gruczołu mlekowego. Wszystkie elementy gruczołu zostały prawidłowo wypreparowane, a barwienie karminem jest optymalne.
Rycina 2: Reprezentatywny wynik błędnie przygotowanego preparatu całego gruczołu mlekowego. Gruczoł został prawidłowo wypreparowany (brak dystalnej części gruczołu), nie został jednak odpowiednio rozciągnięty, a proces delipidacji nie zakończył się całkowicie.
Dyskusja
Ocena parametrów morfologicznych gruczołu mlekowego oraz wzrostu drzewa nabłonkowego może być wykorzystana do przewidywania, czy manipulacje dietetyczne we wczesnych etapach życia lub inne interwencje zmieniające środowisko hormonalne in utero lub w okresie przedpokwitności modyfikują późniejsze ryzyko raka piersi. Ponieważ rak piersi u ludzi inicjuje się w strukturach gruczołu mlekowego (jednostkach końcowych przewodowo-płacowych, TDLUs) podobnych do TEB u szczurów, technikę tę można zastosować do określenia potencjału ekspozycji we wczesnych etapach życia w zakresie wpływu na ryzyko raka piersi. Co więcej, u kobiet wysoka gęstość mammograficzna zwiększa ryzyko raka piersi 4–6 krotnie, a ocena wzrostu nabłonkowego drzewa gruczołu mlekowego może służyć do identyfikacji czynników determinujących gęstość mammograficzną oraz czynników ją redukujących. Aby uzyskać te informacje, gruczoł mlekowy należy w pełni wypreparować i odpowiednio rozciągnąć na szkiełku przedmiotowym, tak aby wszystkie jego elementy były widoczne pod mikroskopem. Ponadto właściwe barwienie karminem oraz odtłuszczanie w ksylenie pozwoli na uzyskanie preparatów całych organów odpowiednich do oceny ryzyka raka piersi.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
NCI (U54 CA00100970), NCI (1 R03 CA150040-01), ACS(116602-PF-09-018-01-CNE)
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kwas octowy lodowaty | Electron Microscopy Sciences | AX0073-9 | Fiksatyw Carnoy’a |
| Etanol bezwodny | The Waner-Graham Co. | 64-17-5 | Fiksatyw Carnoy’a |
| Karmin | Sigma-Aldrich | C1022 | Roztwór karminu |
| Siarczan glino-potasowy | Sigma-Aldrich | A7167 | Roztwór karminu |
Bibliografia
- Rasmussen, S. B., Young, L. J. T., Smith, G. H. Preparing mammary gland whole mounts form mice. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. Ip, M. M., Asch, B. B. , Kluwer Academic / Plenum Publishers. New York. 75-85 (2000).
- Consensus statements from Mammary Gland Whole Mount Round Robin meeting. Oakland, CA, , (2009).
- Hilakivi-Clarke, L., Clarke, R., Onojafe, I., Raygada, M., Cho, E., &, L. ippman, E, M. A maternal diet high in n-6 polyunsaturated fats alters mammary gland development, puberty onset, and breast cancer risk among female rat offspring. Proc Natl Acad Sci. 94, 9372-9377 (1997).
- Russo, I. H., Russo, J. Mammary gland neoplasia in long-term rodent studies. Environ. Health Perspect. 104 (9), 938-967 (1996).
- Hilakivi-Clarke, L., de Assis, S. Fetal origins of breast cancer. TRENDS in Endocrinol and Metabol. 17 (9), 340-348 (2006).
- Hilakivi-Clarke, L. Nutritional modulation of terminal end buds: its relevance to breast cancer prevention. Curr Cancer Drug Targets. 7 (4), 465-474 (2007).
- Silva Idos, S., De Stavola, B., Mccormack, V. Collaborative Group On Pre-Natal Risk Factors And Subsequent Risk Of Breast Cancer. Birth size and breast cancer risk: re-analysis of individual participant data from 32 studies. PloS Medicine. 5, e193-e193 (2008).
- Warri, A., Saarinen, N. M., Makela, S., Hilakivi-Clarke, L. The role of early life genistein exposures in modifying breast cancer risk. Br J Cancer. 98, 1485-1493 (2008).
- Russo, J., Hu, Y. F., Yang, X., Russo, I. H. Developmental, cellular, and molecular basis of human breast cancer. J Natl Cancer Inst Monogr. , 17-37 (2000).
- Oza, A. M., Boyd, N. F. Mammographic parenchymal patterns: A marker of breast cancer risk. Epidemiological Reviews. 15, 196-208 (1993).
Przedruki i uprawnienia
