Metody manipulacji eksperymentalnych po przecięciu nerwu wzrokowego w OUN ssaków

Summary

Przecięcie nerwu wzrokowego jest powszechnie stosowanym modelem uszkodzenia OUN u dorosłych. Model ten jest idealny do wykonywania wielu eksperymentalnych manipulacji, które są ukierunkowane na siatkówkę globalnie lub bezpośrednio na uszkodzoną populację neuronów komórek zwojowych siatkówki.

Abstract

Komórki zwojowe siatkówki (RGC) to neurony OUN, które przesyłają informacje wizualne z siatkówki do mózgu przez nerw wzrokowy. Nerw wzrokowy może być dostępny w obrębie oczodołu oka i całkowicie przecięty (akskotomizowany), przecinając aksony całej populacji RGC. Przecięcie nerwu wzrokowego jest powtarzalnym modelem apoptotycznej śmierci komórek neuronalnych w dorosłym OUN ^1-4. Model ten jest szczególnie atrakcyjny, ponieważ komora ciała szklistego oka działa jak kapsułka do dostarczania leku do siatkówki, umożliwiając eksperymentalne manipulacje za pomocą zastrzyków wewnątrzgałkowych. Dyfuzja substancji chemicznych przez płyn szklisty zapewnia, że działają one na całą populację RGC. Wektory wirusowe, plazmidy lub krótkie interferujące RNA (siRNA) mogą być również dostarczane do komory ciała szklistego w celu zakażenia lub transfekcji komórek siatkówki ^5-12. Wysoki tropizm wektorów wirusa związanego z adenowirusem (AAV) jest korzystny dla docelowych RGC, przy wskaźniku infekcji zbliżającym się do 90% komórek w pobliżu miejsca wstrzyknięcia ^{6, 7, 13-15}. Co więcej, RGC mogą być selektywnie transfekowane poprzez zastosowanie siRNA, plazmidów lub wektorów wirusowych do przeciętego końca nerwu wzrokowego ^16-19 lub wstrzyknięcie wektorów do ich celu, górnego wzgórka ¹⁰. Dzięki temu naukowcy mogą badać mechanizmy apoptozy w uszkodzonej populacji neuronów bez zakłócającego wpływu na inne neurony postronne lub otaczający glej. Apoptoza RGC ma charakterystyczny przebieg w czasie, w którym śmierć komórki jest opóźniona o 3-4 dni po aksotomii, po czym komórki szybko się degenerują. Stwarza to okno dla eksperymentalnych manipulacji skierowanych przeciwko szlakom zaangażowanym w apoptozę. Manipulacje, które są bezpośrednio ukierunkowane na RGC z przeciętego kikuta nerwu wzrokowego, są wykonywane w czasie aksotomii, bezpośrednio po przecięciu nerwu. W przeciwieństwie do tego, gdy substancje są dostarczane drogą wewnątrzgałkową, można je wstrzyknąć przed zabiegiem chirurgicznym lub w ciągu pierwszych 3 dni po operacji, poprzedzając rozpoczęcie apoptozy w aksotomicznym RGC. W niniejszym artykule przedstawiono kilka metod eksperymentalnych manipulacji po przecięciu nerwu wzrokowego.

Protocol

1. Technika chirurgiczna

1. Eksperymenty powinny być przeprowadzane przy użyciu techniki aseptycznej i zgodnie z protokołami wykorzystania zwierząt obowiązującymi w danej instytucji. Przyrządy i materiały (roztwory, substancje badane, znaczniki, igły itp.) mające kontakt z żywymi tkankami muszą być sterylne, aby zapobiec zakażeniu i niekorzystnemu wpływowi na dobrostan zwierząt oraz potencjalnemu negatywnemu wpływowi na badanie.

2. Znieczulenie

1. Szczury zostaną znieczulone za pomocą weterynaryjnego systemu parowania izofluranu. Do odparowania izofluranu należy użyć tlenu medycznego o szybkości 0,8 l/min. Umieść zwierzę w dołączonym pudełku anestezjologicznym i ustaw stężenie izofluranu 4%, aż oddech zwolni, a zwierzę będzie spokojne.
2. Następnie przełącz przepływ gazu na nasadkę maski przeciwgazowej do ramy stereotaktycznej i umieść zwierzę w aparacie stereotaktycznym. Zmniejsz stężenie izofluranu do 2% i monitoruj znieczulenie. Większe zwierzęta (>300g) mogą wymagać wyższego stężenia izofluranu. Podczas zabiegu chirurgicznego należy monitorować znieczulenie i odpowiednio dostosować dawkę izofluranu. Głębokość i tempo oddechu powinny być stale oceniane, a także należy przeprowadzać ocenę szczypania palców u nóg (co 5 minut) pod kątem braku głębokiego bólu.
3. Po zakończeniu operacji wyłącz izofluran i pozwól zwierzęciu oddychać tlenem przez kilka minut przed usunięciem z urządzenia stereotaktycznego. Temperaturę ciała należy utrzymywać poprzez przykrycie zwierzęcia kocem chirurgicznym i/lub użycie regulowanego koca grzewczego podczas operacji.

3. Przygotowanie strzykawki do wstrzyknięć wewnątrzgałkowych

1. Najpierw należy zmontować system strzykawkowy do wykonywania wstrzyknięć do gałki ocznej. Do wstrzykiwań służy strzykawka Hamiltona RN Gastight 1701 o pojemności 10 μl. Usunąć igłę lub nakrętkę RN znajdującą się na końcu strzykawki.
2. Włóż tuleję PFA do tulejki kubka PEEK złączki zaciskowej. Następnie włóż kompletną złączkę do końca strzykawki i luźno przykręć nakrętkę RN od góry.
3. Włóż jeden koniec rurki PEEK 1/16 cala do złączki zaciskowej przez otwór w nakrętce RN. Upewnij się, że rurka PEEK jest całkowicie osadzona. Dokręć nakrętkę RN, aby ścisnąć tulejkę, uszczelniając rurkę PEEK.
4. Wykonaj krok 3.2 na obu końcach łącznika szklanego Dual RN. Przymocuj wolny koniec rurki PEEK do jednego końca łącznika szklanego Dual RN, dokręcając nakrętkę RN.
5. Wyciągnięta szklana mikropipeta utworzy igłę i cylinder systemu iniekcyjnego. Do produkcji szklanych pipet użyj grubościennej szklanej rurki kapilarnej o średnicy zewnętrznej 1.5 mm i włóż szklaną pipetę do wolnego końca szklanego łącznika Dual RN. Dokręć nakrętkę RN, aby zamocować pipetę na miejscu.
6. Cienka końcówka mikropipet z wyciąganego szkła jest zwykle zbyt mała do wykonywania iniekcji wewnątrzgałkowych. W celu wytworzenia końcówki o odpowiedniej średnicy, należy rozbić końcówkę szklanej pipety pod kierunkiem wizualnym, używając mikroskopu chirurgicznego. Matowy koniec szkiełka do szklanych próbek dobrze nadaje się do rozbijania pipety. Trzymaj pipetę pod kątem i pocieraj końcówką wzdłuż szklanego lukru, aby zrobić przerwę. Idealnie, ostatnia końcówka powinna być lekko ścięta. Uzyskanie dobrej końcówki może wymagać kilku prób, więc przed użyciem wyciągnij kilka pipet.
7. Układ wtryskowy jest hydrauliczny. Dlatego strzykawka, łącznik rurki PEEK, podwójna szklana złączka RN i szklana mikropipeta muszą być napełnione olejem mineralnym przed użyciem. Korzystając z zestawu do zalewania firmy Hamilton Syringe Co. (PRMKIT), napełnij strzykawkę do zalewania olejem mineralnym. Użyj igły o dużej średnicy, aby umożliwić łatwy przepływ lepkiego oleju. Zastąp igłę igłą Hamilton 90030, która pasuje do cylindra strzykawki Hamilton o pojemności 10 μl. Następnie umieść gumową przegrodę na igle Hamilton 90030, aby zapewnić uszczelnienie podczas wstrzykiwania oleju mineralnego.
8. Włożyć igłę Hamilton 90030 strzykawki zalewającej do tylnej części cylindra strzykawki Hamiltona o pojemności 10 μl w układzie iniekcyjnym. Dociśnij mocno przegrodę do końca strzykawki, aby utworzyć uszczelnienie.
9. Powoli wcisnąć tłok. Zobaczysz, jak olej mineralny przechodzi przez szklane elementy układu wtryskowego, a na końcu napełnia szklaną pipetę. Przepchnij cały olej przez układ wtryskowy, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza wzdłuż drogi. Jeśli w strzykawce do napełniania zaczyna brakować oleju mineralnego, należy powoli wyjąć igłę, cały czas dozując olej, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza. Ponownie napełnić strzykawkę zalewową i ponownie wykonać wstrzyknięcie.
10. Gdy cały system jest napełniony olejem mineralnym i nie ma pęcherzyków powietrza, należy włożyć oryginalny tłok strzykawki Hamilton o pojemności 10 μl. Wcisnąć tłok do końca jego skoku w celu usunięcia dodatkowego oleju mineralnego z układu. Wytrzyj szklaną mikropipetę do czysta, a końcówkę strzykawki wyczyść 70% etanolem.
11. Wykręcić tłok strzykawki do oznaczenia 2 μl na cylindrze. Końcówka szklanej mikropipety wypełni się powietrzem, zapewniając strefę buforową między olejem mineralnym a żądanym płynem do wstrzyknięcia. Cylinder pipety można teraz napełnić, umieszczając koniec mikropipety w żądanym roztworze i wyjmując tłok strzykawki Hamiltona. Nie należy wstrzykiwać więcej niż 4-5 μl roztworu do oka dorosłego szczura.

4. Procedura iniekcji wewnątrzgałkowej: globalne celowanie w siatkówkę

1. Po znieczuleniu zwierzęcia i zabezpieczeniu go w ramie stereotaktycznej (jak opisano w punkcie 2), należy użyć kropli do oczu Alcaine w celu miejscowego znieczulenia rogówki. Otwórz powieki palcami i umieść jedną kroplę roztworu znieczulającego na powierzchni rogówki.
2. Wstrzyknięcie wymaga dwóch osób: jednej do włożenia szklanej pipety do komory ciała szklistego i utrzymania pozycji pipety, a drugiej do wciśnięcia tłoka na strzykawce, która dostarcza pożądany roztwór.
3. Pod mikroskopem chirurgicznym chwyć palcami szklaną pipetę i szklaną złączkę Dual RN. Rozsunąć powieki palcami wolnej ręki, tworząc kształt litery "V" naprzeciwko miejsca wstrzyknięcia. Stosując trakcję do powiek, oko zostanie wyniesione poza orbitę, odsłaniając tylną powierzchnię za rąbkiem. Tworząc kształt litery "V" z palcami ustawionymi naprzeciwko miejsca wstrzyknięcia, tworzy się kołyska dla oka, która zapewnia stabilność podczas wstrzykiwania.
4. Delikatnie wprowadzić końcówkę szklanej mikropipety przez spojówkę, w miejsce pozbawione naczyń krwionośnych, oraz przez twardówkę, pod kątem skierowanym w dół. Powinieneś poczuć mały "trzask", gdy pipeta wniknie w twardówkę. Wprowadzenie pipety pod lekkim kątem w dół zmniejsza ryzyko uderzenia w soczewkę podczas wprowadzania igły.
5. Osoba trzymająca strzykawkę powinna teraz wstrzyknąć 4 μl roztworu, naciskając tłok do oznaczenia 2 μl na strzykawce. Wstrzyknięcie powinno trwać łącznie około jednej do dwóch sekund. Wstrzykiwanie z bardzo małą szybkością >3 sekundy zmniejsza początkowe rozprzestrzenianie się roztworu w komorze ciała szklistego. Będziesz mógł zobaczyć, jak wstrzyknięty roztwór przepłukuje się przez komorę ciała szklistego pod mikroskopem, weryfikując w ten sposób powodzenie zabiegu.
6. Trzymaj mikropipetę nieruchomo przez około 5 sekund, a następnie wyjmij ją w tym samym kierunku, w którym została wprowadzona igła. Spojówka opadnie z powrotem nad mały otwór, pomagając uszczelnić nakłucie twardówki.
7. Pokryj powierzchnię rogówki maścią okulistyczną do oczu (Tears Naturale P.M.), aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas rekonwalescencji, a następnie umieść zwierzę w klatce rekonwalescencji.
8. Pooperacyjne leki przeciwbólowe powinny być podawane zgodnie z wytycznymi organów opieki nad zwierzętami, a zwierzęta powinny być dokładnie monitorowane po operacji.

5. Selektywne celowanie w komórki zwojowe siatkówki z kikuta nerwu wzrokowego

1. Zastosowanie znaczników, leków, plazmidów, siRNA lub wektorów wirusowych do kikuta nerwu wzrokowego, po aksotomii, bezpośrednio celuje w komórki zwojowe siatkówki poprzez transport wsteczny. Osiąga się to poprzez uprzednie wykonanie transsekcji nerwu wzrokowego zgodnie z "Protokołem Transsekcji Nerwu Wzrokowego"²².
2. Istnieją dwie główne metody wykonania tej procedury: za pomocą pianki żelowej lub bezpośredniego wstrzyknięcia do nerwu wzrokowego.
3. Metoda żelpianki jest podobna do śledzenia wstecznego, jednak podczas wykonywania eksperymentalnych zabiegów na nerwie wzrokowym pożądane jest wstępne znakowanie komórek zwojowych siatkówki poprzez wstrzyknięcie znaczników wstecznych do górnego wzgórka 1 tydzień przed aksotomią. Jest to ważne dla śledzenia komórek, ponieważ w niektórych przypadkach znaczniki neuronalne mogą zakłócać wsteczny transport substancji eksperymentalnych lub odwrotnie.
4. Natychmiast po przecięciu nerwu wzrokowego na przecięty nerw wzrokowy nakłada się mały kawałek pianki żelowej nasączonej roztworem doświadczalnym. Zawartość orbity jest następnie zwracana do poprzedniej lokalizacji. Kiedy oko powróci do neutralnej pozycji, konieczne jest użycie kleszczy, aby wepchnąć kawałek pianki żelowej w dół do orbity, upewniając się, że pozostaje on nad końcem nerwu wzrokowego.
5. Technika iniekcji jest bardziej skuteczna w dostarczaniu substancji, które muszą uzyskać dostęp do cytoplazmy aksonu, aby mogły być transportowane wstecznie przez przepływ aksoplazmatyczny. Obejmuje to siRNA i plazmidy, a w niektórych przypadkach wektory wirusowe. Strzykawka Hamiltona o pojemności 5-10 μl służy do wstrzykiwania pożądanego roztworu do przeciętego nerwu wzrokowego.
6. Chwyć krawędź nerwu wzrokowego za pomocą kleszczyków Dumonta z cienką końcówką. Włóż koniec igły do nerwu wzrokowego, równolegle do nerwu, aż skos przestanie być widoczny. Wprowadzony igła zostanie otoczony ze wszystkich stron przez nerw. Pożądana jest igła z krótkim skosem.
7. Po wprowadzeniu igły do nerwu delikatnie ściśnij boki nerwu kleszczami z cienką końcówką i wstrzyknij jedną czwartą roztworu, obracając strzykawkę o jedną czwartą obrotu zgodnie z ruchem wskazówek zegara lub przeciwnie do ruchu wskazówek zegara.
8. Kontynuować powtarzanie kroku 5.7 aż do zakończenia pełnego obrotu igły i wstrzyknięcia całej zawartości strzykawki. Aby uzyskać najlepsze wyniki, wstrzyknij łącznie 10 μl roztworu za pomocą gazoszczelnej strzykawki Hamilton o pojemności 10 μl.
9. Zdjąć końcówkę strzykawki z nerwu. Pozostaw nadmiar wstrzykniętego płynu, który cofnął się z nerwu w obrębie oczodołu, ponieważ utworzy to dodatkową pulę do wchłonięcia przez końce aksonów.
10. Przywróć zawartość oczodołu do pierwotnej pozycji, zamknij ranę i pozwól zwierzęciu dojść do siebie.
11. Pooperacyjne leki przeciwbólowe powinny być podawane zgodnie z wytycznymi organów opieki nad zwierzętami, a zwierzęta powinny być dokładnie monitorowane po operacji.

6. Reprezentatywne wyniki:

Zastrzyki wewnątrzgałkowe są skierowane na wszystkie komórki siatkówki na całym świecie i działają dobrze w przypadku dostarczania substancji do uszkodzonych RGC, ponieważ komórki zwojowe znajdują się w najbardziej wewnętrznej warstwie neuronalnej siatkówki, przylegającej do komory ciała szklistego. RGC mogą być również bezpośrednio ukierunkowane poprzez dostarczanie substancji do przeciętego kikuta nerwu wzrokowego. RGC znakowane wstecznie fluorozłotem mogą być celowane za pomocą peptydów, leków, wektorów, plazmidów lub siRNA z kikuta nerwu, jak pokazano na rysunku 1. Rysunek 1A-C pokazuje lokalizację peptydu znakowanego Cy3 w somatach RGC, które zostały wstępnie znakowane przez wstrzyknięcie Fluorogold do górnego wzgórka. Peptydy znakowane Cy3 wstrzyknięto do nerwu wzrokowego natychmiast po aksotomii, a siatkówkę zobrazowano żywym, aby zapobiec wypłukiwaniu peptydów z tkanki podczas fiksacji. Rycina 1D-F pokazuje lokalizację siRNA znakowanych Cy3 i znacznika wstecznego Fluorogold w aksotomicznym RGC. SiRNA znakowane Cy3 wstrzyknięto do kikuta nerwu wzrokowego natychmiast po aksotomii, a siatkówkę zobrazowano żywą.

Rysunek 1. Mikrografie epifluorescencyjne RGC w płaskich siatkówkach po 1 dniu po aksotomii i wstrzyknięciu znakowanych peptydów lub siRNA do kikuta nerwu wzrokowego. (A) Znakowanie wsteczne fluorozłotem w aksotomizowanych RGC po 1 dniu po aksotomii (B) Fluorescencja Cy3 w RGC po wstecznym transporcie znakowanych peptydów, 1 dzień po aksotomii i wstrzyknięciu peptydu do nerwu wzrokowego. (C) Nakładanie (A) i (B) wykazujące selektywną lokalizację peptydów znakowanych Cy3 w RGC znakowanych fluorozłotem. (D-F) Ciała komórkowe RGC znakowanych Fluorogold (D) są również wypełnione siRNA (E) znakowanymi Cy3 wstrzykniętymi do kikuta nerwu wzrokowego 24 godziny wcześniej, jak pokazano na nakładce (F). Podziałka w A-C wynosi 50 μm. Podziałka w DF wynosi 20 μm.

Discussion

Przecięcie nerwu wzrokowego jest wysoce powtarzalnym modelem apoptozy neuronów ośrodkowego układu nerwowego u dorosłych. Eksperymentalne manipulacje zademonstrowane w tym manuskrypcie pozwalają na badanie mechanizmów apoptozy RGC po urazie.

Zastrzyki do gałki ocznej są przydatne do globalnego celowania w siatkówkę. Ta procedura wymaga pewnej wprawy, ponieważ bardzo ważne jest, aby nie uszkodzić soczewki końcówką szklanej pipety. Wykazano, że uszkodzenie soczewki powoduje uwalnianie czynników w...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rama stereotaktyczna	Stoelting Co.
Maska przeciwgazowa dla szczurów	Stoelting Co.
System anestezjologiczny	VetEquip	901806
Isoflurane (PrAErrane)	Baxter Internationl Inc.	DIN 02225875
	WPI, Zeiss, Leica
Alcaine Krople do oczu	Alcon
Tears Naturale P.M.
Kleszcze Dumont z cienką końcówką	Fine Science Tools	11252-00
10 μ l Strzykawka Hamilton (1701RN; 26s/2”/2)	Hamilton Co	80030
1/16 cala Złączki zaciskowe	Hamilton Co	55751-01
1/16 cala OD, 0,010 cala ID, rurka PEEK	Supelco, Sigma-Aldrich	Z226661
Podwójny łącznik szklany RN	Hamilton Co	55752-01
Zestaw do zalewania oleju mineralnego: zawiera strzykawkę, igły, gumowe septy	Hamilton Co	PRMKIT