Metody genetyki odwrotnej okazały się niezwykle użyteczne w określaniu, które geny odpowiadają za odporność komarów na patogeny przenoszone przez wektory. Niniejszy protokół wideo przedstawia metodę stosowaną w laboratorium Dimopoulosa do wstrzykiwania dsRNA komarom Anopheles gambiae, będącym nosicielami pasożyta malarii. Przedstawiono technikę przygotowania zestawu do iniekcji oraz proces wstrzykiwania dsRNA do klatki piersiowej owada.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Protokół analiz RNAi u dorosłych komarów (A. gambiae)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Metody genetyki odwrotnej okazały się niezwykle przydatne w określaniu, które geny odpowiadają za oporność komarów na patogeny przenoszone przez wektory. Niniejszy protokół wideo przedstawia metodę stosowaną w laboratorium Dimopoulosa do wstrzykiwania dsRNA komarom Anopheles gambiae, będącym żywicielami pasożyta malarii. Przedstawiono technikę przygotowania zestawu do iniekcji oraz proces wstrzykiwania dsRNA do klatki piersiowej owada.
Protokół
Wyciszanie genów za pomocą RNAi u komarów wymaga wcześniejszego przygotowania i oczyszczania specyficznych dsRNA celujących w wybrany gen. Do syntezy dsRNA zalecamy zestaw Ambion Megascript, który wykorzystuje reakcję transkrypcji in vitro z udziałem polimerazy RNA T7. Do oczyszczania dsRNA zalecamy zestaw Qiagen RNeasy. Próbki dsRNA należy skwantyfikować i dostosować do stężenia 3 μg/μL w wodzie. Pozostałe niezbędne materiały to: pęseta z cienkimi końcami, szkiełko przedmiotowe, szklane igły mikrokapilarne, mikroiniekcyjnik (używamy Drummond's Nanoject II), mikroskop świetlny zamontowany nad blokiem chłodzącym, przykryta szklana szalka Petriego, ręczniki pa....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wydajność wyciszania genów jest bardzo zmienna i zależy od wielu czynników, w tym od tempa obrotu transkryptów i białek oraz wydajności pobierania dsRNA przez komórki i organy. Stwierdziliśmy, że wyciszanie rozpoczyna się już 1 dzień po iniekcji i może trwać do 6 dni po iniekcji. W celu walidacji wyciszania należy zastosować metody detekcji transkryptów i białek, takie jak ilościowa PCR oraz Western blotting.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Megascript | zestaw | Ambion | do syntezy dsRNA; reakcja transkrypcji in vitro za pośrednictwem polimerazy RNA T7 | |
| RNeasy | Qiagen | Do oczyszczania dsRNA | ||
| dsRNA | należy określić ilość i dostosować stężenie do 3 μg/ μL w wodzie | |||
| pęseta z cienkimi końcówkami | ||||
| szkiełko przedmiotowe | ||||
| szklane igły mikrokapilarne | ||||
| mikroinjektor | Drummond Scientific | Nanoject II | ||
| mikroskop świetlny | zamontowany nad blokiem chłodzącym | |||
| szalka Petriego | szklana, z przykrywką | |||
| ręczniki papierowe | ||||
| 10% sacharoza | pokarmowa | |||
| A. gambiae | Zwierzę | komary |
Bibliografia
- Boisson,, et al. , (2006).
- Blandin,, et al. , (2002).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
