Wyznaczanie metylacji DNA genów imprintowanych w endospermie Arabidopsis

Podsumowanie

Imprinting jest zjawiskiem występującym w reprodukcji roślin i ssaków. Metylacja DNA odgrywa istotną rolę w mechanizmach imprintingu. Izolacja endospermy oraz określenie stanu metylacji genów podlegających imprintingowi u Arabidopsis mogą być trudne. W niniejszym protokole opisujemy, jak izolować endospermę i określać poziom metylacji za pomocą sekwencjonowania z bisulfitem.

Streszczenie

Arabidopsis thaliana jest doskonałym organizmem modelowym do badania mechanizmów epigenetycznych. Jednym z powodów jest fakt, że mutanty null z utratą funkcji metylotransferaz DNA są żywotne, co zapewnia system do badania, w jaki sposób utrata metylacji DNA w genomie wpływa na wzrost i rozwój. Imprinting odnosi się do różnicowej ekspresji alleli matczynych i ojcowskich i odgrywa istotną rolę w rozwoju rozrodczym zarówno u ssaków, jak i u roślin. Metylacja DNA jest kluczowa dla określenia, czy allele matczyne lub ojcowskie genu podlegającego imprintingowi są ekspresowane, czy wyciszone. U roślin kwitnących w procesie rozmnażania dochodzi do podwójnego zapłodnienia: jedna komórka plemnika zapładnia komórkę jajową, tworząc zarodek, a drugi plemnik łączy się z komórką centralną, dając początek endospermowi. Endosperm jest tkanką, w której u roślin zachodzi imprinting. MEDEA, gen grupy Polycomb z domeną SET, oraz FWA, czynnik transkrypcyjny regulujący kwitnienie, to dwa pierwsze geny, w których wykazano imprinting w endospermie, a ich ekspresja jest kontrolowana przez metylację i demetylację DNA w roślinach. Aby określić status imprintingowy genu i wzorzec metylacji w endospermie, musimy najpierw potrafić go wyizolować. Ponieważ nasiona Arabidopsis są bardzo małe, izolacja endospermu Arabidopsis i badanie jego metylacji pozostają wyzwaniem. W niniejszym protokole wideo opisujemy, jak przeprowadzić krzyżówkę genetyczną, wyizolować tkankę endospermu z nasion oraz określić stan metylacji za pomocą sekwencjonowania z bisulfitem.

Protokół

I. Krzyżowanie genetyczne

1. Kastracja rośliny żeńskiej

Aby rozróżnić allele matczyne i ojcowskie za pomocą polimorfizmu sekwencji DNA, jako rodzice żeński i męski zostaną wybrane dwa różne ekotypy, np. Columbia-0 (Col-0) i Ler. Rośliny powinny być młode i zdrowe. Rodzica żeńskiego można poddać emaskulacji, korzystając z mikroskopu stereoskopowego, wizjera powiększającego lub gołym okiem. Należy zlokalizować kwiaty w stadium 12 (Smyth et al., 190) i usunąć wszelkie kwiaty lub strąki znajdujące się powyżej i poniżej nich, odcinając nożyczkami podstawę szypułki. Pęsetę należy wysterylizować, delikatnie zanurzając końcówkę w zlewce z 95% etanolem, co usunie ziarna pyłku z pęsety i jednocześnie je zabije. Używając pęsety, należy delikatnie rozdzielić pąki kwiatowe, a następnie ostrożnie usunąć 4 działki kielicha, 4 płatki i 6 pręcików, pozostawiając słupek nieosłonięty i nienaruszony. Podczas tego procesu należy starać się nie uszkodzić słupków.

2. Wybór dawcy pyłku i przeprowadzenie zapylania

Najlepszymi dawcami pyłku są rozwinięte kwiaty w stadium 14, w których płatki są rozpostarte pod kątem 90 ° względem słupka (Smyth et al., 190), co wiąże się z obfitym uwalnianiem pyłku. Należy uchwycić kwiat u podstawy, tuż powyżej szypułki, co spowoduje jego pełne otwarcie. Następnie należy przenieść pyłek z pręcika na znamię przygotowanego słupka. Po zapyleniu znamię zostanie pokryte żółtym pyłkiem, co można łatwo zaobserwować pod mikroskopem.

3. Oznakowanie krzyża

Po zapyleniu wszystkich wykastrowanych słupków na roślinie, oznaczamy krzyżówkę za pomocą etykiety jubilerskiej, podając informacje o rodzicach żeńskich i męskich oraz datę. W glebie w pobliżu rośliny umieszczamy palik, za pomocą sznurka przywiązujemy łodygę kwiatostanu do palika, a zapylone słupki przykrywamy plastikową torebką.

II. Izolacja tkanek endospermy u Arabidopsis

1. Przygotowanie materiałów

Zazwyczaj przygotowujemy niezbędne materiały przed pobraniem tkanek endospermy i embrionu: zbiornik z ciekłym azotem, ciekły azot, mikroskop stereoskopowy, dwie nowe pary pęset precyzyjnych (5 INOX. FST firmy Dumont biology, Szwajcaria), szkiełka przedmiotowe do mikroskopu (3" X 1" X 1,0 mm) oraz roztwór 0,3 M sorbitolu i 5 mM MES o pH 5,7.

2. Zbieranie strączków

W 7. lub 8. dniu po zapyleniu (DAP) nasiona są gotowe do zbioru w fazie od średniej do późnej torpedy embriogenezy i mogą zostać poddane sekcji w celu wyodrębnienia endospermy oraz zarodka. Czasami może to zająć 9–10 DAP, jeśli ewmaskulowane kwiaty były zbyt młode.

3. Izolacja endospermy i zarodka

Ponieważ nasiona Arabidopsis są bardzo małe, do izolacji endospermy i embrionu używamy mikroskopu stereoskopowego. Umieszczamy łuszczkę w 8. dniu po zapyleniu (8-DAP) pod mikroskopem, za pomocą jednej pęsety trzymamy szypułkę łuszczki, a końcówką drugiej pęsety rozsuwamy łuszczkę w miejscu zrastania się dwóch pręcików. Za pomocą pęsety przenosimy jedno nasiono do roztworu 0,3 M sorbitolu i 5 mM MES o pH 5,7, wykonujemy niewielkie nacięcie od strony mikropylu, aby wysunąć embrion, a następnie ściskamy nienacięty koniec, by wypchnąć endospermę i oddzielić ją od łupiny nasiona (Kinoshita et al., 204). Embrion oraz endospermę umieszczamy w oddzielnych mikroprobówkach w ciekłym azocie. Proces ten powtarzamy, aż zgromadzimy embriony lub endospermę z 10-15 łuszczek, a następnie przechowujemy probówki w zamrażarce w temperaturze -80°C. W niektórych przypadkach nie ma konieczności oddzielania endospermy od łupiny nasiona, tzn. do analizy imprinting-u genów można izolować całkowite RNA z mieszaniny endospermy i łupiny nasiona.

III. Sekwencjonowanie z bisulfitem

1. Wymagane odczynniki

Cetylotrimetylammonyk bromek (CTAB) do przygotowania genomowego DNA, enzymy restrykcyjne, 3 M NaOH (świeżo przygotowany), 6,42 M mocznik/4 M pirosiarczyn sodu (2 M pirosiarczyn sodu, Sigma-Aldrich, S90, Na2S2O5, masa cząsteczkowa: 190), 10 mM hydrochinon, zestaw do oczyszczania DNA (Promega Wizard DNA Clean-up System, kat. nr A7280), bufor TE, 6,3 M NaOH (świeżo przygotowany), 10 M NH₄OAc, 20 μg/μL tRNA oraz 100% etanol.

2. Szczegóły protokołu traktowania pirosyryczanem

1. Wyizolować genomowy DNA z endospermy lub zarodka za pomocą procedury z użyciem CTAB (Rogers i Bendich, 198).
2. Trawienie 100 ng - 2 μg kwasu DNA genomowego w 20 μL do 100 μL całkowita objętość z enzymami restrykcyjnymi, które tną poza obszarem poddanym analizie. W przypadku promotora MEA stosujemy XhoI, NdeI oraz PstI lub HindIII.
3. Zdenaturuj enzymy restrykcyjne, gotując DNA przez pięć minut, a następnie schłodź próbkę na lodzie.
4. Dodaj 1/9 objętości (2.2 μL dla 20 μL strawionego DNA) 3 M NaOH i inkubować w 37 °C przez 15 minut.
5. Przenieś roztwór do 250 μL probówka do PCR
6. Rozpuścić 7,5 g mocznika w 10 ml sterylnej wody destylowanej; powoli dodawać 7,6 g pirosiarczynu sodu w ciągu 1–2 godzin (podgrzewanie zazwyczaj wspomaga rozpuszczanie); dostosować pH do wartości 5 przy użyciu świeżo przygotowanego 10 M NaOH; dopełnić objętość do 20 ml sterylną wodą destylowaną. Otrzymany roztwór to 6,24 M mocznika/4 M pirosiarczynu sodu.
7. Dodać roztwór mocznika (6,24 M) i pirosiarczynu sodu (4 M) do stężeń końcowych odpowiednio 5,36 M i 3,4 M (Paulin i wsp., 198). Na przykład dodać 208 μL roztworu mocznika (6,42 M)/pirosiarczynu sodu (4 M) do powyższego 22.2 μL z denaturowanego DNA genomicznego (Xiao i wsp., 2003).
8. Dodaj hydrochinon o stężeniu 10 mM do DNA, tak aby uzyskać stężenie końcowe 0,5 mM (12 μL dla 20 μL trawienie).
9. Przeprowadzenie konwersji pirosulfatowej w termocyklerze: 30 cykli 55 °C przez 15 minut, a następnie 95 °C przez 30 sekund.
10. Przeprowadź odsolenie DNA poddanego konwersji pirosiarczynowej za pomocą systemu Wizard DNA Clean-Up System firmy Promega, postępując zgodnie z protokołem (Jacobsen it al., 2000).
11. Zmierz dokładną objętość buforu TE odzyskanego z kolumny po odsoleniu i dodaj NaOH o stężeniu 6,3 M do uzyskania stężenia końcowego 0,3 M. Inkubuj w 37 °C przez 15 minut.
12. Dodać 10 M NH4OH₄OAc (pH 7,0) do stężenia końcowego 3 M, 2 μL z 20 μg/μL tRNA, a następnie dodać 3 objętości 10% etanolu i wymieszać. Wirować przez 15 minut przy 14 0 obr./min.
13. Przemyj osad raz 70-procentowym etanolem, przeprowadź krótkie wirowanie i usuń nadmiar etanolu.
14. Osusz pellet w wirówce odparowującej (speedvac) przez 5–10 minut, a następnie resuspenduj w 25 µl 100 μL bufor TE w zależności od początkowej ilości DNA. DNA poddane działaniu pirosyrczynanu sodu jest teraz gotowe do analizy PCR.

3. Amplifikacja PCR

1. Ponieważ niezmetylowane cytozyny są przekształcane w uracyl, trudna jest amplifikacja dużego fragmentu przy użyciu DNA poddanego działaniu pirosyfitu jako matrycy. Dlatego zazwyczaj projektujemy startery tak, aby amplifikowany produkt nie przekraczał 50 bp. W celu zsekwencjonowania 4-kb promotora MEA zaprojektowaliśmy wiele zestawów starterów i amplifikowaliśmy 14 nakładających się fragmentów, aby objąć cały ten region (Xiao et al., 203).
2. Aby zsekwencjonować nić górną, projektując starter forward: I) wybieramy region bogaty w G (guaninę), aby uzyskać wyższą temperaturę anelowania bez konieczności wydłużania starterów; II) zamieniamy C (cytozynę) na Y (pirymidynę) w kontekstach CG i CNG, a pozostałe C zamieniamy na T (tyminę). Projektując starter reverse: I) wybieramy region bogaty w C; II) zamieniamy G na R (purynę) w kontekstach CG i CNG, a pozostałe G zamieniamy na A (adeninę).
3. Aby zsekwencjonować nić dolną, projektując starter forward: I) wybieramy region bogaty w C; II) zamieniamy G na R w kontekstach CG i CNG, a pozostałe G zamieniamy na A. Projektując starter reverse: I) wybieramy region bogaty w G; II) zamieniamy C na Y (pirymidynę) w kontekstach CG i CNG, a pozostałe C zamieniamy na T.
4. Zazwyczaj używamy 1-2 μL DNA poddanego działaniu pirosyfitu sodu jako matrycy dla każdej amplifikacji PCR (Xiao et al., 203). Produkt PCR musi zostać przeanalizowany za pomocą elektroforezy żelowej w celu potwierdzenia prawidłowej wielkości fragmentu, a następnie oczyszczony z żelu i sklonowany jako wkład do wektora klonującego TOPO TA pCR2.1 (Invitrogen). Wybieramy i hodujemy pojedynczą kolonię, a następnie ekstrahujemy DNA plazmidowe i przesyłamy je do sekwencjonowania.

4. Analiza sekwencji

Zasada sekwencjonowania z bisulfitem polega na tym, że niezmetylowana cytozyna zostaje przekształcona w uracyl w wyniku deaminacji hydrolitycznej wywołanej wysokim stężeniem pirosyrczynanu sodu przy pH5.0, co w produkcie PCR objawia się jako tymina; natomiast 5-metylocytozyna nie ulega modyfikacji przez pirosyrczynan sodu i po amplifikacji PCR pozostaje cytozyną (Clark et al., 194; Frommer et al., 192). Po uzyskaniu wyniku sekwencjonowania porównujemy go z matrycą specyficzną dla nici użytej do amplifikacji PCR. Jeśli reszta cytozyny w matrycy jest odczytana jako tymina w wyniku sekwencjonowania, wskazuje to, że cytozyna nie była zmetylowana. Jeśli reszta cytozyny w matryce pozostaje cytozyną w sekwencjonowaniu, oznacza to, że cytozyna jest zmetylowana.

IV. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1.

Dyskusja

Oddzielenie zarodka od endospermy i łupiny nasienia jest stosunkowo łatwe, jednak oddzielenie endospermy od łupiny nasienia jest żmudne, szczególnie w przypadku nasion wczesnej lub środkowej fazy torpedowatej embriogenezy. Ponieważ łupina nasienia dostarcza bardzo niewielką ilość tkanki, w przypadku niektórych genów, np. MEA i FWA, nie ma konieczności oddzielania endospermy od łupiny nasienia. Oznacza to, że możemy izolować RNA z mieszaniny tkanek endospermy i łupiny nasienia, sprawdzać ekspresję alleli...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Materiały i odczynniki Mikroskop stereoskopowy Nożyczki Pęseta z cienkimi końcówkami Etykieta jubilerska Paliki do roślin Sznurek lub wiązania drutowe 4" X 2" X 8" Worki polietylenowe 3" X 1" szkiełka przedmiotowe do mikroskopu o grubości 1,0 mm Azot ciekły Zbiorniki na ciekły azot Blok grzejny Probówki do PCR Termocykler Probówki do mikrocentrifugowania Mikrowirówka Zaplecze do elektroforezy żelowej Arabidopsis thaliana Rośliny Columbia-0 Arabidopsis thaliana Rośliny *Landsbergia erecta* Odczynniki 70% etanol 95% etanol 100% etanol 0,3 M sorbitolu i 5 mM MES-pH 5,7 bromek cetylotrimetylammonium (CTAB) 100% etanol Chloroform Enzymy restrykcyjne 3 M NaOH 6,3 M NaOH 6,24 M mocznika/ 4 M pirosiarczynu sodu Sterylna woda destylowana H2O2O 10 mM hydrochinonu System oczyszczania DNA Wizard DNA Clean-Up System (Promega) 10 M NH₄OH4OAc 20 μg/ μtRNA L bufor TE Zestaw TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen)