Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Produkcja transgenów C. elegans poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK

14.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2331

⸱

11 stycznia 2011

 ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Department of Medicine, Division of Geriatric Medicine and Pittsburgh Institute for Neurodegenerative Diseases, University of Pittsburgh

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Zdolność do wytwarzania transgenów dla Caenorhabditis elegans z wykorzystaniem DNA genomicznego przenoszonego przez fosmidy jest szczególnie korzystna, ponieważ wszystkie rodzime elementy regulacyjne zostają zachowane. Opisano prostą i niezawodną procedurę wytwarzania transgenów poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK.

Streszczenie

Tworzenie zwierząt transgenicznych jest szeroko wykorzystywane w badaniach nad C. elegans, w tym poprzez zastosowanie białek fuzyjnych GFP do badania regulacji i wzorców ekspresji genów docelowych lub generowanie wersji specyficznych genów z tagiem do tandemowej oczyszczania powinowactwem (TAP), aby ułatwić ich izolację. Zazwyczaj transgeny generuje się poprzez umieszczenie promotora powyżej genu reporterowego GFP lub cDNA genu docelowego, co często pozwala uzyskać reprezentatywny wzorzec ekspresji. Jednakże w takim podejściu mogą zostać pominięte krytyczne elementy regulacji genów, takie jak elementy kontrolne w 3' niezakodowanej regionie (UTR) lub promotory alternatywne. Co więcej, metodą tą zazwyczaj można badać tylko jeden wariant splicingowy. W przeciwieństwie do tego, zastosowanie genomowego DNA nicienia przenoszonego przez klony DNA fosmidów prawdopodobnie obejmuje większość, jeśli nie wszystkie elementy zaangażowane w regulację genów in vivo, co pozwala na dokładniejsze uchwycenie autentycznego wzorca i czasu ekspresji. Aby ułatwić generowanie transgenów przy użyciu DNA fosmidowego, opisujemy procedurę rekombineeringu opartą na E. coli, służącą do wstawiania GFP, tagu TAP lub innych sekwencji docelowych w dowolnym miejscu w genie. Procedura wykorzystuje gen galK jako marker selekcyjny zarówno dla etapu selekcji pozytywnej, jak i negatywnej w rekombineeringu, co pozwala na uzyskanie pożądanej modyfikacji z wysoką wydajnością. Ponadto dostępne są plazmidy zawierające gen galK flankowany ramionami homologii do powszechnie stosowanych genów fuzyjnych GFP i TAP, co redukuje koszt oligosów o 50% podczas generowania białek fuzyjnych GFP lub TAP. Plazmidy te wykorzystują sekwencję startową replikacji R6K, co eliminuje potrzebę rozbudowanego oczyszczania produktów PCR. Na koniec prezentujemy technikę integrowania markera unc-119 z szkieletem fosmidu, co umożliwia bezpośrednie wstrzykiwanie lub bombardowanie fosmidem nicieni w celu wygenerowania zwierząt transgenicznych. Niniejszy film prezentuje procedury generowania transgenu za pomocą rekombineeringu z wykorzystaniem tej metody.

Protokół

Przegląd

Wiele transgenów wykorzystywanych do tworzenia transgenicznych C. elegans składa się z sekwencji promotorowych i ewentualnie cDNA genu sklonowanego do jednego z wektorów opracowanych w laboratorium dr. Andy'ego Fire'a 1. Choć transgeny te często okazują się skuteczne w kontekście produkcji genu reporterowego GFP lub ekspresji cDNA w pożądanym wzorcu, mogą one nie posiadać alternatywnych promotorów, elementów wzmacniających (enhancerów) oraz elementów 3' niekodującej regionu (UTR), które odgrywają istotne role w kontroli ekspresji genów in vivo 2. Na przykład oba geny, daf-12 oraz fah-1, posiadają ważne elementy wzmacniające znajdujące się poza proksymalnym promotorem, które pominięto w konstruktach zawierających tylko promotor 3,4,5. Co więcej, wiele konstruktów transgenicznych wykorzystuje 3'UTR genu unc-54, co uniemożliwia regulację przez odpowiednie geny mikroRNA 6,7,8. W konsekwencji, generowanie transgenów z dużymi fragmentami genomowego DNA nicieni byłoby idealne dla uchwycenia wszystkich promotorów, wariantów splicingowych i elementów kontrolnych 3' UTR. Niedawno stworzono bibliotekę fosmidów C. elegans, która składa się z regionów genomowego DNA o długości ~40 kb i obejmuje niemal cały genom. Wykorzystanie genomowego DNA nicieni przenoszonego przez te klony DNA fosmidów pozwala na lepsze uchwycenie autentycznego wzorca i czasu ekspresji specyficznych genów 2,8,9,10,11.

Jednakże praca z dużymi regionami genomowego DNA wiąże się z wyzwaniami praktycznymi, takimi jak znaczne trudności w stosowaniu standardowych technik biologii molekularnej 12. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano techniki modyfikacji fosmidów lub bakteryjnych sztucznych chromosomów poprzez rekombinację homologiczną w E. coli, określane jako recombineering 12,13. Recombineering umożliwia bezszwową insercję GFP, tagu do tandemowego oczyszczania powinowactwa (TAP) lub innych sekwencji zainteresowania w dowolnym miejscu w genie przenoszonym przez klon fosmidowy C. elegans 2,10,14. Rekombinacja homologiczna zachodzi pomiędzy produktem PCR flankowanym przez 50 bp regiony homologii do miejsca docelowego a docelowym DNA w specjalnie zmodyfikowanych szczepach E. coli.

Opisaliśmy niedawno dwuetapową procedurę modyfikacji fosmidów C. elegans za pomocą rekombineeringu, która polega na wstawieniu genu galK w pożądanej lokalizacji, a następnie zastąpieniu tego genu pożądaną sekwencją 2. Gen galK służy jako skuteczny marker selekcyjny dla obu etapów procesu, ponieważ umożliwia on selekcję pozytywną i negatywną przy użyciu selektywnych pośrodków hodowlanych 15. W pierwszym etapie modyfikacji fosmidu gen galK jest wstawiany poprzez rekombinację homologiczną w pożądanej lokalizacji, a prawidłowo zmodyfikowane fosmidy są identyfikowane za pomocą selekcji pozytywnej na zdolność do wykorzystywania galaktozy jako źródła węgla 2,15. W drugim etapie gen galK zostaje zastąpiony pożądaną sekwencją, a prawidłowo zmodyfikowane fosmidy są identyfikowane poprzez selekcję negatywną przeciwko genowi galK z wykorzystaniem toksycznej pochodnej galaktozy, doksygalaktozy, która zabija bakterie galK+ 2,15. Zaletą wykorzystania galK jest możliwość użycia jednego genu do etapów selekcji pozytywnej i negatywnej, w przeciwieństwie do innych markerów, które wymagają osobnych genów dla każdego etapu, co pozwala na uzyskanie pożądanej modyfikacji z wysoką wydajnością 2,15.

Aby ułatwić zastosowanie tej techniki w badaniach nad C. elegans, wprowadziliśmy kilka zmian w dostępnych zasobach. Po pierwsze, znaczniki GFP i TAP są powszechnie stosowane do generowania transgenów u nicieni, dlatego w plazmidach pMOD4 galK-G i pMOD4 galK-GT, które służą jako źródło genu galK, wprowadziliśmy 50 pb regionów homologii do każdego z tych znaczników 2. Regiony te umożliwiają wykorzystanie jednego zestawu oligonukleotydów w obu etapach modyfikacji fosmidu, co eliminuje konieczność zamawiania drugiego zestawu kosztownych oligonukleotydów. Po drugie, plazmidy te wykorzystują miejsce inicjacji replikacji R6K, co sprawia, że nie ma potrzeby trawienia plazmidu macierzystego ani rozległego oczyszczania produktu PCR, ponieważ plazmid macierzysty nie jest w stanie replikować się w bakteriach stosowanych do rekombineeringu i może replikować się jedynie w specjalnych szczepach, takich jak EC100 2,16 (Tabela 1 i Tabela 2). Wreszcie, powszechną metodą generowania transgenicznych C. elegans jest bombardowanie biolistyczne, po którym następuje selekcja transgenicznych nicieni poprzez ratowanie mutacji unc-119 17. Aby uczynić fosmidy kompatybilnymi z bombardowaniem, opracowaliśmy plazmid pLoxP unc-119, który może być użyty do integracji markera unc-119 z szkieletem fosmidu 2.

I. Projektowanie oligonukleotydów

Dzięki rekombineeringowi pożądane sekwencje mogą zostać wprowadzone w dowolnym miejscu w obrębie genu. Powszechne miejsca insercji znajdują się na końcu 5' lub 3', w zależności od domen funkcjonalnych, wariantów splicingowych lub modyfikacji potranslacyjnych, takich jak cięcie przez proteazy. Plazmid pMOD4 GFP stworzony w naszym laboratorium może być wykorzystany do wprowadzenia GFP z tagiem FLAG w dowolnym miejscu, ponieważ plazmid zawiera kodon startowy i nie posiada kodonu stop 3' (Rycina 1). W przeciwieństwie do niego, tag TAP posiada specyficzne wersje dla fuzji 5' i 3' ze względu na cięcie przez proteazę TEV stosowane podczas oczyszczania 18,19.

  1. Zaplanuj miejsce insertcji tagu w obrębie genu. Przy wyborze miejsca insertcji należy uwzględnić alternatywne promotory, domeny funkcjonalne, alternatywny splicing oraz modyfikacje potranslacyjne. Różne miejsca insertcji mogą być wykorzystane do tagowania wszystkich, jednego lub niektórych izoform konkretnego genu. Zidentyfikuj regiony o długości 50 bp powyżej (upstream) i poniżej (downstream) punktu insertcji.
  2. Zaprojektuj oligosy (Tabela 1). W procedurze można zastosować oligosy w skali 100 nM oczyszczone żelowo lub oligosy Ultramer firmy Integrated DNA Technologies.

    Aby przeprowadzić rekombineering galK, należy zaprojektować primery galK z 50 bp homologii do obszaru flankującego wybrany punkt modyfikacji; końce 3' tych primerów wiążą się z kasetą galK, która występuje zarówno w pMOD4 galK-G, jak i w pMOD4 galK-GT (Rysunek 1). Oligo forward będzie miało sekwencję: 5'------- 50 bp homologii -------CCTGTTGACAATTAATCATCGGCA-3', a oligo reverse: 5'------- 50 bp homologii na nici komplementarnej ------- TCAGCACTGTCCTGCTCCT-3'.

    Aby przeprowadzić rekombineering galK z GFP, należy zaprojektować primery pMOD4 galK-G lub pMOD4 galK-GT z 50 bp homologii do obszaru flankującego wybrany punkt modyfikacji (Rysunek 1). Należy upewnić się, że białko fuzyjne pozostaje w odpowiedniej ramce odczytu. Jeśli jest to pożądane, sekwencję ATG można pominąć. Końce 3' tych primerów wiążą się z regionami homologii GFP flankującymi kasetę galK. Uwaga: pierwszy i ostatni kodon GFP zostały podkreślone, aby wskazać ramkę odczytu. Oligo forward będzie miało sekwencję: 5'------- 50 bp homologii ------- ATGGATTACAAGGACGATGACGATAAGATGAG -3' 3', a oligo reverse: 5'------- 50 bp homologii na nici komplementarnej ------- CAAAGCTTGTGGGCTTTTGTATAG-3'

    Aby przeprowadzić rekombineering galK dla TAP C-końcowego, należy zaprojektować primery pMOD4 galK-GT z 50 bp homologii do obszaru flankującego wybrany punkt modyfikacji (Rysunek 1). Należy upewnić się, że białko fuzyjne pozostaje w odpowiedniej ramce odczytu. Końce 3' tych primerów wiążą się z regionami homologii TAP flankującymi kasetę galK. Uwaga: pierwszy i ostatni kodon TAP zostały podkreślone, aby wskazać ramkę odczytu. Oligo forward będzie miało sekwencję: 5'------- 50 bp homologii ------ ATGGAAAAGAGAAGATGGAAAAAG - -3', a oligo reverse: 5'------- 50 bp homologii na nici komplementarnej ------- GGTTGACTTCCCCGC -3'

    Aby przeprowadzić rekombineering galK dla TAP N-końcowego, należy zaprojektować primery pMOD4 galK-GT z 50 bp homologii do obszaru flankującego wybrany punkt modyfikacji (Rysunek 1). Należy upewnić się, że białko fuzyjne pozostaje w odpowiedniej ramce odczytu. Końce 3' tych primerów wiążą się z regionami homologii TAP flankującymi kasetę galK. Uwaga: pierwszy i ostatni kodon TAP zostały podkreślone, aby wskazać ramkę odczytu. Oligo forward będzie miało sekwencję: 5'------- 50 bp homologii ------ ATGGCAGGCCTTGCGC - -3', a oligo reverse: 5'------- 50 bp homologii na nici komplementarnej -------AAGTGCCCCGGAGGATGAGATTTTCT -3'

  3. Przygotuj zestaw oligosów flankujących do przeprowadzenia PCR w późniejszych etapach oraz do sekwencjonowania fosmidu. Są to standardowe oligosy do PCR, które powinny wiązać się w odległości ok. 100 bp powyżej (upstream) i poniżej (downstream) miejsca insertcji.

II. Transfer fosmidu do bakterii SW016

Fosmidy z biblioteki fosmidów C. elegans są dostarczane w szczepie bakteryjnym EPI300 (F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG trfA tonA) (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI), który pozwala na zwiększenie ekspresji fosmidu powyżej jednej kopii na komórkę w celu poprawy wydajności DNA podczas oczyszczania (Tabela 2). Do celów rekombineeringu fosmid musi zostać przeniesiony do szczepu bakteryjnego SW106 (mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) ΔlacX74 deoR endA1 araD139 Δ(ara, leu) 7697 rpsL recA1 nupG φ80dlacZΔM15 [λc1857 (cro-bioA)<>Tet] (cro-bioA)<>araC-PBAD Cre ΔgalK) (NCI-Frederick), który niesie geny rekombinacji homologicznej λred pod kontrolą temperaturozależnego represora λ oraz indukowanej arabinozą rekombinazy cre (Tabela 2) 15.

  1. Zamów klon fosmidowy interesującego genu (G.O.I.) z GeneService (Cambridge, Wielka Brytania), korzystając z Wormbase jako przewodnika. Podczas wyboru klonów wybieramy takie, w których G.O.I. znajduje się w centrum sekwencji. Preferowane mogą być klony wykluczające sąsiednie geny, jednak mogą być one trudne do znalezienia.
  2. Hoduj klon fosmidowy G.O.I. w pożywce LB zawierającej 12,5 μg/mL chloramphenicolu w temperaturze 37°C.
  3. Przygotuj 1,5 mL nocnej hodowli fosmidu, a następnie przeprowadź mini-prep DNA fosmidowego przy użyciu zestawu do preparatyki fosmidów Epicentre (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI). Stosujemy alternatywny protokół opisany w instrukcji, który polega na dodaniu mieszaniny Riboshredder na wcześniejszym etapie.
  4. Wyznacz stężenie DNA fosmidowego za pomocą spektrofotometru.
  5. Przygotuj elektrokompetentne komórki SW106, hodując 5 ml nocnej kultury SW106 w 14 mL probówce z nakrętką typu snap-cap w bulionie LB z 12,5 μg/mL chloramphenicolu w temperaturze 32°C.
  6. Zaszczep 1 mL do 100 mL LB z chloramphenicolem w kolbie o pojemności 2 L. Hoduj bakterie SW106 do uzyskania OD600 0,6-0,8. NIE stosuj szoku termicznego.
  7. Odwirować osad przez centryfugowanie przy 5000xg przez 5 minut, resuspender osad poprzez delikatne wierzchołkowanie (vortexing) i dodać 50 mL lodowatego 10% glicerolu. Powtórz ten etap płukania raz.
  8. Odwirować komórki SW106 i odessać cały supernatant z wyjątkiem około 500 μl.
  9. Resuspender osady poprzez delikatne wierzchołkowanie. Zamrozić alikwoty po 100 μl w ciekłym azocie lub na suchym lodzie i przechowywać w -80°C do przyszłego użycia.
  10. Transformuj DNA fosmidowe do elektrokompetentnych komórek SW106 poprzez elektroporację bakterii z ilością ~50 ng DNA fosmidowego, używając elektroporatora Eppendorf 2510 przy napięciu 1350 V w kuwetach z przerwą 0,1 cm.
  11. Rytregeneruj bakterie w 1 mL LB przez 1 godzinę w temperaturze 32°C.
  12. Wysiej alikwoty na płytki LB z chloramphenicolem (12,5 μg/mL) i inkubuj przez noc w temperaturze 32°C.
  13. Zweryfikuj obecność G.O.I. za pomocą PCR kolonii. Przygotuj 5 mL nocnej hodowli w LB z 12,5 μg/mL chloramphenicolu w temperaturze 32°C. Dodaj 0,5 μL hodowli do standardowej reakcji PCR z flankującymi oligosami i wydłuż początkową inkubację w 95°C do 5 minut, aby zlizować bakterie przed PCR.
  14. Przygotuj stok glicerolowy do długoterminowego przechowywania.

III. Wstawienie genu galK metodą recombineeringu

W pierwszym etapie modyfikacji fosmidu gen galK jest wprowadzany do fosmidu poprzez rekombinację homologiczną, a prawidłowo zmodyfikowane fosmidy są selekcjonowane poprzez hodowlę na podłożu minimalnym zawierającym galaktozę jako jedyne źródło węgla (Ryc. 2A). Bakterie SW106 rosną powolnie na podłożu minimalnym i wymagane jest 3-5 dni, aby zaobserwować kolonie.

  1. Przygotować płytki z minimalnym podłożem MOPS zawierającym 0,2% galaktozy. Minimalne podłoże MOPS jest dostępne w firmie Teknova Inc. (Hollister, CA) (katalog nr M2106), jednak nie należy używać dołączonej glukozy.

    Minimalne podłoże MOPS z 0,2% galaktozy (1 L)
    Autoklawować 15 g agaru w 870 mL wody
    Schłodzić do 55°C i dodać:
    100 mL10X minimalne podłoże MOPS
    5 mL0,2 mg/ml d-biotyny (filtrowane sterylnie)
    4,5 mL10 mg/ml L-leucyny (1%, podgrzana, następnie schłodzona i filtrowana sterylnie)
    10 mL20% galaktozy (autoklawowanej)
    1 mL12,5 mg/ml chloramfenikolu w EtOH
    2,55 mL20% NH4Cl
    10 mL 0,132 M fosforanu potasu dwuzasadowego
  2. Przeprowadzić amplifikację PCR kaset pMOD4 galK-G lub pMOD4 galK-GT, używając powyższych starterów. Stosowano polimerazę Phusion (New England Biolabs, Ipswich, MA) lub GoTaq (Promega, Madison, WI).
  3. Oczyścić otrzymany prążek za pomocą elektroforezy na żelu. Ilość produktu ocenić za pomocą żelu lub spektrofotometru Nanodrop. Ten produkt PCR jest gotowy do etapu 3.14.
  4. Zaszczepić nocną kulturę komórek SW106 zawierających DNA fosmidu w 5 ml LB z chloramfenikolem (12,5 μg/μL). Hodować w temperaturze 32°C.
  5. Ustawić wstrząsową kąpiel wodną na 42°C, aby ją rozgrzać, umieszczając w uchwycie sterylną kolbę o pojemności 250 ml. Użycie wstrząsowej kąpieli wodnej jest kluczowe dla uzyskania wysokiej wydajności.
  6. Dodać 1 ml nocnej kultury do 100 ml LB z chloramfenikolem w kolbie o pojemności 2 L. Hodować do uzyskania O.D. 0,6-0,8. Zazwyczaj zajmuje to 3-4 godziny.
  7. Przenieść 50 ml komórek SW106 do kolby 250 ml i poddać szokowi termicznemu w temperaturze 42°C przez dokładnie 20 min. we wstrząsowej kąpieli wodnej przy 100 obr./min. Pozostałe bakterie pozostawić w temperaturze 32°C jako kontrolę nieindukowaną.
  8. Schłodzić bakterie indukowane i nieindukowane na lodzie przez 10 minut.
  9. Przenieść próbki do dwóch sterylnych probówek do wirowania i odwirować przy ~5000xg przez 5 minut.
  10. Odlać cały supernatant i resuspender osad w 1 ml lodowatego 10% glicerolu, delikatnie mieszając na wortexie (np. ustawienie 3-4).
  11. Po resuspensji dodać kolejne 49 ml lodowatego 10% glicerolu i odwirować próbki przy ~5000xg przez 5 minut.
  12. Powtórzyć kroki 3.9, 3.10 i 3.11.
  13. Usunąć cały supernatant, odwracając probówki, a osad resuspender w pozostałej cieczy (około 500 μL na próbkę). Rozdzielić na aalikwoty po 100 μL, zamrozić na suchem lodzie i przechowywać w -80°C. Takie próbki są stabilne od kilku tygodni do kilku miesięcy. (Zazwyczaj na tym etapie przerywamy pracę i przeprowadzamy elektroporację następnego dnia).
  14. Przeprowadzić elektroporację indukowanych i nieindukowanych komórek SW106 z użyciem 150 ng produktu PCR, stosując kuwety z przerwą 0,1 cm w elektroporatorze Eppendorf 2510 ustawionym na 1350 V.
  15. Regenerować bakterie w 1 mL LB w probówce Falcon 14 ml. Inkubować w temperaturze 32°C przez 4,5 godziny.
  16. Odwirować bakterie w mikrowirówce przy 13 200 obr./min. przez 15 sekund. Bakterie resuspender w M9, a następnie przemyć dwukrotnie, aby usunąć bogate podłoże (przepis poniżej).
    • Podłoże M9 (1 L)
    • 6g Na2HPO4
    • 3g KH2PO4
    • 1g NH4Cl
    • 0,5g NaCl
    • AUTOKLAWOWAĆ
  17. Po drugim przemywaniu usunąć supernatant i resuspender osad w 1 mL M9 przed wysianiem rozcieńczeń szeregowych w M9 (100 μL, 100 μL rozcieńczenia 1:10 oraz 100 μL rozcieńczenia 1:100) na minimalne podłoże MOPS.
  18. Inkubować przez 3-5 dni w temperaturze 32°C w inkubatorze. Uwaga: Należy uzbroić się w cierpliwość, ponieważ prawdziwe pozytywy rosną powoli.
  19. Przenosić wybrane kolonie na wskaźnikowe płytki z agarem MacConkey (BD #281810) uzupełnione o 1% galaktozy i chloramfenikol 12,5 μg/mL. Wszystkie kolonie pojawiające się po ostatnim etapie powinny być galK+, ale aby wyeliminować ewentualne zanieczyszczenia galK-, ważne jest uzyskanie pojedynczych, intensywnie różowych kolonii przed przejściem do drugiego kroku. Kolonie galK- będą białe/bezbarwne, a bakterie galK+ będą intensywnie czerwone/różowe z powodu zmiany pH wynikającej z fermentacji galaktozy po nocnej inkubacji w 32°C.
  20. Wybrać pojedynczą kolonię i zaszczepić nocną kulturę w 5 ml LB + chloramfenikolu, hodując ją w 32°C.
  21. Potwierdzić wstawienie genu galK w odpowiednim miejscu za pomocą PCR z użyciem flankujących starterów. Dodać 0,5 μL kultury do standardowej reakcji PCR i wydłużyć początkową inkubację w 95°C do 5 minut w celu lizy bakterii. Produkt PCR powinien wykazywać wzrost rozmiaru ze względu na obecność genu galK.
  22. Przygotować stok glicerolowy do przechowywania.

IV. Zastąpienie galK sekwencjami znacznikowymi za pomocą rekombineeringu

Na tym etapie gen galK zostaje zastąpiony pożądanymi sekwencjami znaczników, a prawidłowo zmodyfikowane fosmidy są wyselekcjonowane poprzez selekcję negatywną przeciwko genowi galK przy użyciu toksycznego analogu galaktozy, deoxygalaktozy (DOG) (Rysunek 2B).

  1. Przygotuj płytki z minimalnym podłożem MOPS zawierającym 0,2% deoksygalaktozy (DOG) i 0,2% glicerolu. Minimalne podłoże MOPS jest dostępne w firmie Teknova Inc. (Hollister, CA) (numer katalogowy #M2106), jednak nie należy używać dołączonej glukozy.

    Minimalne podłoże MOPS z 0,2% DOG i glicerolem (1 L)
    Autoklawuj 15 g agaru w 860 mL wody
    Schłodź do 55°C i dodaj:
    100 mL10X minimalne podłoże MOPS
    5 mL0,2 mg/ml d-biotyny (filtrowana sterylnie)
    4,5 mL10 mg/ml L-leucyny (1%, podgrzana, następnie schłodzona i filtrowana sterylnie)
    10 mL20% deoksygalaktozy (filtrowana sterylnie)
    10 mL20% glicerolu (autoklawowany)
    1 mL12,5 mg/ml chloramfenikolu w EtOH
    2,55 mL20% NH4Cl
    10 mL0,132 M fosforanu potasu zasadowego
  2. Przeprowadź amplifikację PCR fragmentów znaczników z pMOD4 GFP, pBS1761 (N-term TAP) lub pBS1479 (C-term TAP), używając tych samych oligosów, co w pierwszej rundzie, lub krótszych oligosów specyficznych dla GFP lub TAP (sekwencje wewnętrzne w kroku 1.2). W przypadku tworzenia wielu konstruktów szczególnie użyteczne jest zastosowanie krótszych oligosów, ponieważ ten sam produkt PCR może być wykorzystany do wszystkich konstruktów.
  3. Oczyść produkt PCR metodą żelową i zmierz jego stężenie za pomocą żelu lub spektrofotometrii.
  4. Przygotuj indukowane i nieindukowane kompetentne komórki SW106 zawierające fosmid z wstawionym genem galK, postępując zgodnie z krokami 3.4-3.13 opisanymi powyżej.
  5. Przeprowadź elektroporację indukowanych i nieindukowanych komórek SW106 przy użyciu ~100 ng produktu PCR, stosując kuwety z przerwą 0,1 cm w elektroporatorze Eppendorf 2510 ustawionym na 1350 V.
  6. Przeprowadź regenerację w 1 ml LB w probówce 14 ml z zakrętką snap-cap i inkubuj w wytrząsarkach w temperaturze 32°C przez 4,5 godziny.
  7. Przemyj i rozcieńcz bakterie zgodnie z krokami 3.16 i 3.17. Wysiej bakterie na płytki z minimalnym podłożem MOPS zawierającym 0,2% 2-deoksy-galaktozy (DOG) i 0,2% glicerolu.
  8. Inkubuj w temperaturze 32°C przez trzy dni.
  9. Cztery kolonie zostaną wykorzystane do przygotowania 5 mL kultur nocnych w LB z 12,5 μg/mL chloramfenikolu. Służą one do przeprowadzenia PCR kolonii, jak opisano powyżej, aby potwierdzić wstawienie kasety. Używamy zarówno krótszych oligosów specyficznych dla GFP/TAP, jak i oligosów flankujących, aby wykazać prawidłowy insert i prawidłowe miejsce wstawienia. GFP ma ~800 p.z. i TAP ma ~550 p.z., podczas gdy galK ma 1,4 kb.
  10. Przygotuj zapas glicerolowy.

V. Wprowadzenie genu unc-119 poprzez rekombinację cre-loxP

Powszechnym sposobem generowania zwierząt transgenicznych z zmodyfikowanymi fosmidami jest wykorzystanie bombardowania biolistycznego. Technika ta wykorzystuje pokryte DNA cząsteczki złota do wprowadzania DNA fosmidowego do C. elegans. Zwierzęta transgeniczne są zazwyczaj identyfikowane poprzez ratowanie mutanta unc-119 za pomocą transgenu unc-119. W tym kroku gen unc-119 jest dodawany do szkieletu fosmidu w cis poprzez rekombinację cre-loxP z plazmidem pLoxP unc-119 (Rysunek 2C).

  1. Przygotować kompetentne bakterie SW106 niosące zmodyfikowany fosmid z kroku 4.9, stosując procedurę z kroków 2.5-2.9. NIE indukować w temperaturze 42°C.
  2. Przeprowadzić elektroporację z użyciem 50 ng pLoxP unc-119 z mini-prep, wykorzystując kuwety z przerwą 0,1 cm w elektroporatorze Eppendorf 2510 ustawionym na 1350 woltów.
  3. Regenerować bakterie w pożywce LB zawierającej 0,1% arabinozy przez 1 godzinę w temperaturze 32°C.
  4. Wysiać alikwoty na płytki LB zawierające 50μg/mL ampicyliny i 12,5 μg/mL chloramfenikolu. Inkubować przez noc w temperaturze 32°C, co pozwoli na selekcję integracji pLoxP unc-119 z fosmidem.
  5. Wyhodować kulturę nocną w pożywce LB zawierającej 50μg/mL ampicyliny i 12,5 μg/mL chloramfenikolu. Użyć 0,5 μL do weryfikacji obecności genu unc-119 za pomocą PCR z użyciem oligosów unc-119 F (5'-CAAATCCGTGACCTCGACAC-3') i unc-119 R (5'-CACAGTTGTTTCTCGAATTTGG-3') (Tabela 1).
  6. Przygotować mrożony stok glicerytowy końcowego fosmidu.

VI. Przygotowanie fosmidów na dużą skalę

Aby ułatwić uzyskanie większych ilości DNA fosmidów niezbędnych do bombardowania, w tym kroku fosmid jest przenoszony do bakterii EPI300. Szczep ten posiada zdolność do zwiększania liczby kopii fosmidu w celu zwiększenia wydajności podczas preparacji DNA.

  1. Przygotować 5 mL nocnej hodowli bakterii z kroku 5.5 w podłożu LB zawierającym ampicylinę i chloramfenikol w temperaturze 32°C. Do wyizolowania fosmidu z 1,5 mL hodowli użyć zestawu Epicentre fosmid prep kit.
  2. Przeprowadzić elektroporację ~50 ng do bakterii EPI300, używając kuwet z przerwą 0,1 cm w elektroporatorze Eppendorf 2510 ustawionym na 1350 V. Bakterie EPI300 można nabyć od Epicentre Biotechnologies (Madison, WI).
  3. Regenerować bakterie w podłożu LB przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Wysiać alikwoty na agar LB zawierający 50 μg/mL i 12,5 μg/mL chloramfenikolu.
  4. Wychować i indukować bakterie EPI300 zawierające zmodyfikowany fosmid zgodnie z załączoną instrukcją. 50 mL indukowanej hodowli dostarczy >10 μg oczyszczonego DNA fosmidowego. Oczyścić fosmid za pomocą zestawu Epicentre fosmid prep kit.

VII. Bombardowanie

  1. Użyć 10 μg fosmidowego DNA do bombardowania szczepu nicieni DP38 zgodnie z opisem (D. Hochbaum, A. Ferguson i A. Fisher, JoVE, w druku).

VIII. Reprezentatywne wyniki

Modyfikacja fosmidów za pomocą recombineeringu wykazuje wysoką skuteczność, a w kroku selekcji negatywnej rutynowo obserwuje się wskaźniki sukcesu przekraczające >90% 2. Realizacja niniejszego protokołu zajmuje około 2 tygodni, co sprawia, że przygotowanie transgenów jest stosunkowo szybkie. Protokół ten został z sukcesem zastosowany również w innych laboratoriach 20.

OligoSekwencja
TAP C-końcowe FATGGAAAAGAGAAGATGGAAAAAG
TAP R z końcem CGGTTGACTTCCCCGC
FLAG-GFP FATGGATTACAAGGACGATGACGATAAGATGAG
FLAG-GFP RCAAAGCTTGTGGGCTTTTGTATAG
N-końcowy TAP FATGGCAGGCCTTGCGC
R TAP N-końcowyAAGTGCCCCGGAGGATGAGATTTTCT
galK FCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA
galK RTCAGCACTGTCCTGCTCCT
unc-119 FCAAATCCGTGACCTCGACAC
unc-119 RCACAGTTGTTTCTCGAATTTGG

Tabela 1. Oligonukleotydy użyte do PCR.

PlazmidyŹródłoDostępne w
Klon fosmidowyGeneservice Ltd.Geneservice
pGalK15NCI-Frederick
pMOD4-RT-G2Addgene
pMOD4-galK-G
pMOD4-galK-GT
pLoxP- unc-119
pMOD4-GFP
Bakterie
SW10615NCI-Frederick
EPI300Epicentre BiotechnologiesEpicentre
EC100D pir-116

Tabela 2. Dostępność szczepów i wektorów.

Schemat wektorów; rekombineering GalK; przedstawiający komponenty plazmidów, FLAG, GFP, miejsca LoxP.
Rycina 1.
Schemat pMOD4-galK-G, pMOD4-galK-GT, pMOD4 GFP oraz pLoxP-unc-119
Plazmid pMOD4-galk-G składa się z kasety galK (czarna), flankowanej przez 50-nukleotydowe regiony identyczne z końcami 5' i 3' FLAG(brązowy)-GFP (zielony), natomiast pMOD4-galK-GT składa się z kasety galK flankowanej zarówno przez regiony homologiczne FLAG-GFP, jak i przez 50-nukleotydowe regiony identyczne z końcami 5' i 3' N- oraz C-końcowego TAP (odpowiednio niebieski i pomarańczowy). pMOD4-FLAG-GFP składa się z pełnej kasety GFP z tagiem FLAG na końcu 5', a pLoxP unc-119 składa się z genomowej sekwencji unc-119 (fioletowa) w plazmidzie zawierającym miejsce loxP. Wszystkie plazmidy wykorzystują szkielet pMOD4 (czerwony) oparty na R6K, który nie jest zdolny do replikacji w SW106.

Rysunek 2.
Przegląd procesu recombineeringu z wykorzystaniem galK
Rysunki 2A–2C – oddzielne schematy przedstawiające etapy i czas trwania procesu recombineeringu z użyciem kasety galK. Są to te same rysunki, które zostały połączone na rysunku 2D, lecz przedstawiono je osobno dla większej przejrzystości i łatwości odczytu. W pierwszej kolejności fosmid budzący zainteresowanie jest modyfikowany w dwuetapowej procedurze, obejmującej insercję kasety galK, flankowanej przez 50 bp regionów homologii do FLAG-GFP lub TAP (Rysunek 2A), a następnie zastąpienie tej kasety FLAG-GFP lub TAP (Rysunek 2B). W dalszej kolejności marker unc-119, służący do generowania zwierząt transgenicznych, jest insertowany w miejsce LoxP na szkielecie fosmidu (Rysunek 2C).
Rysunek 2D przedstawia połączony schemat procedury recombineeringu z wykorzystaniem galK.
Zarys procedury recombineeringu z wykorzystaniem galK opisanej powyżej, obejmujący czas wymagany dla każdego etapu, opracowany na podstawie połączenia rysunków 2A–2C.

Schemat procesu rekombineeringu genów z selekcją GalK i miejscami LoxP do modyfikacji DNA.
Rysunek 2a. Wstawka galk w rekombineeringu galk.

Schemat edycji genów, przedstawiający proces rekombinacji z użyciem Gal K i Lox P dla układu eksperymentalnego.
Rysunek 2b. Wstawienie TAG (GFP /TAP) w procesie rekombineeringu galk.

Schemat edycji genów za pomocą rekombinazy Cre; metoda pLoxP; rekombinacja DNA z arabinozą.
Rycina 2c. Dodanie unc-119.

Proces recombineeringu genów, schemat z LoxP-Cre, selekcją pozytywną/negatywną, PCR.
Rysunek 2d. Połączony przegląd recombineeringu galk.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Generowanie transgenów z fosmidów daje korzyść w postaci zachowania wszystkich natywnych elementów promotora, wariantów splicingowych oraz regulacyjnych elementów 3' UTR. Może to prowadzić do skonstruowania transgenu, który w większym stopniu odzwierciedla natywny wzorzec ekspresji, lub do stworzenia funkcjonalnego transgenu w sytuacjach, gdy inne podejścia zawodzą 5. Powstałe transgeny mogą przenosić różne znaczniki epitopowe, w tym GFP lub znacznik TAP.

Konstrukcja transgenów obe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować Lindsey Nash za pomoc w opracowaniu techniki. Praca ta była finansowana z grantu NIH AG028977 dla A.L.F., grantu na projekt pilotażowy z University of Pittsburgh OAIC (AG024827) oraz środków zakładowych z University of Pittsburgh.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
zestaw FosmidMAXEpicentre BiotechnologiesFMAX046
GoTaqPromega Corp.M7122
pożywka MOPSTEKnova, Inc.M2120
0.132 M roztwór fosforanu potasuTEKnova, Inc.M2102
D-galaktozaSigma-AldrichG0750
2-deoksygalaktozaSigma-AldrichD4407
BiotynaSigma-AldrichB4639
LeucynaSigma-AldrichL8000
NH4ClSigma-AldrichA9434
polimeraza DNA PhusionNew England BiolabsF-530S
podłoże agar MacConkeyBD Biosciences281810
ArabinozaSigma-AldrichA3131
ChloramphenikolSigma-AldrichC1919
Fosforan sodu dwuzasadowySigma-AldrichS5136
Fosforan potasu jednozasadowySigma-AldrichP5655
Chlorek soduSigma-AldrichS5886
GlicerolSigma-AldrichG2025
Bacto AgarBD Biosciences214010

Bibliografia

  1. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
  2. Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering. BMC Dev Biol. 8, 119-119 (2008).
  3. Antebi, A., Yeh, W. H., Tait, D., Hedgecock, E. M., Riddle, D. L. daf-12 encodes a nuclear receptor that regulates the dauer diapause and developmental age in C. elegans. Genes and Development. 14, 1512-1527 (2000).
  4. Snow, M. I., Larsen, P. L. Structure and expression of daf-12: a nuclear hormone receptor with three isoforms that are involved in development and aging in Caenorhabditis elegans. Biochim. Biophys. Acta. 1494, 104-116 (2000).
  5. Fisher, A. L., Page, K. E., Lithgow, G. J., Nash, L. The Caenorhabditis elegans K10C2.4 Gene Encodes a Member of the Fumarylacetoacetate Hydrolase Family. A CAENORHABDITIS ELEGANS MODEL OF TYPE I TYROSINEMIA. J Biol.Chem. 283, 9127-9135 (2008).
  6. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
  7. Lehrbach, N. J. LIN-28 and the poly(U) polymerase PUP-2 regulate let-7 microRNA processing in Caenorhabditis elegans. Nat Struct Mol Biol. 16, 1016-1020 (2009).
  8. Tursun, B., Cochella, L., Carrera, I., Hobert, O. A toolkit and robust pipeline for the generation of fosmid-based reporter genes in C. elegans. PLoS One. 4, e4625-e4625 (2009).
  9. Bamps, S., Hope, I. A. Large-scale gene expression pattern analysis, in situ, in Caenorhabditis elegans. Brief. Funct. Genomic. Proteomic. , (2008).
  10. Dolphin, C. T., Hope, I. A. Caenorhabditis elegans reporter fusion genes generated by seamless modification of large genomic DNA clones. Nucleic Acids Res. 34, e72-e72 (2006).
  11. Sarov, M. A recombineering pipeline for functional genomics applied to Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 3, 839-844 (2006).
  12. Yang, X. W., Model, P., Heintz, N. Homologous recombination based modification in Escherichia coli and germline transmission in transgenic mice of a bacterial artificial chromosome. Nat Biotechnol. 15, 859-865 (1997).
  13. Court, D. L., Sawitzke, J. A., Thomason, L. C. Genetic engineering using homologous recombination. Annu.Rev.Genet. 36, 361-388 (2002).
  14. Westenberg, M., Bamps, S., Soedling, H., Hope, I. A., Dolphin, C. T. Escherichia coli MW005: lambda Red-mediated recombineering and copy-number induction of oriV-equipped constructs in a single host. BMC Biotechnol. 10, 27-27 (2010).
  15. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36-e36 (2005).
  16. Penfold, R. J., Pemberton, J. M. An improved suicide vector for construction of chromosomal insertion mutations in bacteria. Gene. 118, 145-146 (1992).
  17. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
  18. Puig, O. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
  19. Rigaut, G. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat.Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
  20. Achilleos, A., Wehman, A. M., Nance, J. PAR-3 mediates the initial clustering and apical localization of junction and polarity proteins during C. elegans intestinal epithelial cell polarization. Development. 137, 1833-1842 (2010).
  21. Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Procedura rekombineeringuklony DNA w fosmidachrekombinacja Lambda Redbiałka fuzyjne GFPintegracja znacznika TAPweryfikacja metodą PCR koloniikomórki elektrokompetentneselekcja na pożywkach minimalnych
Produkcja transgenów C. elegans poprzez rekombineering z wykorzystaniem markera selekcyjnego galK
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.