W niniejszym protokole opisano metodę izolacji i aktywacji spermatyd z samców C. elegans. Odcięcie tylnego końca samca powoduje uwolnienie spermatyd. Spermatydy można aktywować poprzez dodanie proteazy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja i aktywacja in vitro plemników Caenorhabditis elegans
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Samce i hermafrodyty to dwie naturalnie występujące formy płciowe u nicienia C. elegans. Plemniki ameboidalne są produkowane zarówno przez samce, jak i hermafrodyty. We wczesnej fazie gametogenezy komórki zarodkowe hermafrodyt różnicują się w ograniczoną liczbę plemników – około 300 – które są przechowywane w niewielkim „worku” zwanym spermateką. Następnie hermafrodyty stale produkują oocyty1. W przeciwieństwie do nich, samce przez cały okres dorosłości produkują wyłącznie plemniki. Samce produkują tak dużą ilość plemników, że stanowią one >50% wszystkich komórek w typowym dorosłym osobniku2. W związku z tym izolacja plemników od samców jest łatwiejsza niż od hermaprodytów.
Tylko niewielka część samców powstaje naturalnie w wyniku spontanicznego niepodziału chromosomu X3. Krzyżowanie hermafrodytów z samcami lub, co jest bardziej wygodne, wprowadzanie mutacji prowadzących do fenotypu Him (High Incidence of Males), to niektóre ze strategii, które pozwalają na zwiększenie liczebności populacji samców3.
Samce można łatwo odróżnić od hermafrodytów, obserwując morfologię ogona4. Ogon hermafrodytów jest spiczasty, natomiast ogon samców jest zaokrąglony i posiada struktury kopulacyjne.
Odcięcie ogona uwalnia ogromną liczbę spermatyd zgromadzonych w obrębie męskiego układu rozrodczego. Disekcja jest przeprowadzana pod mikroskopem stereoskopowym przy użyciu igieł o rozmiarze 27 G. Ponieważ spermatydy nie są fizycznie połączone z żadnymi innymi komórkami, ciśnienie hydrauliczne wypycha zawartość wnętrza ciała samca, w tym spermatydy2.
Samce są bezpośrednio sekcjowane na niewielkiej kropli „podłoża dla plemników” (Sperm Medium). Spermatydy są wrażliwe na zmiany pH. Dlatego w podłożach dla plemników stosuje się HEPES, związek o dobrej zdolności buforującej. Glukoza i inne sole obecne w podłożach dla plemników pomagają utrzymać ciśnienie osmotyczne, co pozwala zachować integralność plemników.
Podział postmeiotyczny spermatyd w dojrzałe plemniki nazywany jest spermiogenezą lub aktywacją plemników. Shakes5 oraz Nelson6 wykazali wcześniej, że okrągłe spermatydy mogą być indukowane do różnicowania się w plemniki poprzez dodanie różnych związków aktywujących, w tym Pronazy E. W niniejszej pracy demonstrujemy spermiogenezę in vitro spermatyd C. elegans z wykorzystaniem Pronazy E.
Pomyślna spermiogeneza jest warunkiem koniecznym dla płodności, dlatego mutanty z wadami spermiogenezy są bezpłodne. Do tej pory wykazano, że kilka mutantów wykazuje defekty specyficznie w procesie spermiogenezy7. Nieprawidłowości zaobserwowane podczas aktywacji in vitro nowych mutantów Spe (Spermatogenesis defective) pomogą nam odkryć dodatkowe czynniki uczestniczące w tym zdarzeniu.
Protokół
1) Wzbogacenie populacji samców
- W zależności od potrzeb eksperymentalnych, dużą liczbę samców można uzyskać, stosując jedną z następujących strategii:
- Dużą populację samców typu dzikiego można uzyskać poprzez skrzyżowanie 5 samców typu dzikiego i 1 hermafrodyty na niewielkim obszarze namnożonych szczepu OP50 w centrum płytki NGM. Około 50% kolejnego pokolenia będą stanowić samce typu dzikiego.
- him-5(e1490) lub him-8(Nie podano tekstu źródłowego do tłumaczenia. Proszę o dostarczenie treści, którą należy przetłumaczyć na język polski.hermafrodyty wydalają liczną populację samców. him-5 i him-8 samce są płodne i nie stwierdzono wyraźnych wad w morfologii i funkcji plemników. Zatem, him-5 lub him-8 można używać samców zamiast samców typu dzikiego do wielu eksperymentów.
2) Identyfikacja i izolacja samców
- Zbadaj morfologię ogona nicieni; ogon samca jest zaokrąglony.
- Wybierz samce w stadium L4 i przenieś je na płytkę NGM zaszczepioną E. coli OP50 i pozostaw do wzrostu na jeden lub dwa dni. Hodowanie celibatowych samców w obecności hermafrodytów zapobiega utracie plemników, dzięki czemu podczas procedury eksperymentalnej dostępna będzie duża liczba spermatyd.
- W dniu sekcji przenieś celibatowe samce na płytkę NGM bez bakterii i pozostaw je na kilka minut. Ten krok pomaga usunąć cienką warstwę E. coli przylegającą do powierzchni nicieni. Alternatywnie, nanieś pipetą niewielką objętość buforu M9 (6g Na2HPO4, 3g KH2PO4, 5g NaCl, 0,25g MgSO4.7H2O na litr) na szkiełko zegarkowe i przenieś tam samce.
3) Disekcja samców i aktywacja in vitro
- Należy wziąć szkiełko przedmiotowe i zaznaczyć na nim małe koło za pomocą pisaka. W obrębie koła należy nanieść pipetą 30-50 μl 1X Sperm Medium (50mM HEPES, 25mM KCl, 45mM NaCl, 1mM MgSO4, 5mM CaCl2, 10mM Dextrose; pH 7.8). Hydrofobowy okrąg pomaga utrzymać medium dla plemników w wyznaczonym obszarze.
- Przenieść od 5 do 10 samców do medium dla plemników.
- Obserwując szkiełko pod mikroskopem, należy trzymać w obu dłoniach dwie strzykawki z igłami o średnicy 27 gauge.
- Jedną igłę należy wykorzystać do „przytrzymania” nicienia, a drugą do przecięcia tylnego końca samców w celu uwolnienia spermatyd.
- Przecięcie nicienia zazwyczaj powoduje natychmiastowe wydalenie ogromnej liczby spermatyd. Spermatydy są widoczne pod mikroskopem stereoskopowym jako drobne „ziarnistości”. Jednak czasami część lub większość spermatyd może pozostać wewnątrz ciała zwierzęcia. W takim przypadku delikatne „przeciąganie” ciała po szkiełku przedmiotowym może ułatwić uwolnienie spermatyd z organizmu.
- Aby aktywować spermatydy, należy przeprowadzić sekcję nicieni w 1X Sperm Medium zawierającym Pronase E(20μg/ml) i pozostawić je na 5 minut.
- Nie wolno dopuścić do wyschnięcia szkiełek na żadnym etapie eksperymentu. W razie potrzeby należy dodać więcej 1X Sperm Medium.
4) Wizualizacja spermatyd i plemników
- Ostrożnie połóż szkiełko nakrywkę na powierzchni preparatu.
- Znajdź pole widzenia zawierające spermatydy przy małym powiększeniu (10X).
- Szczegóły budowy spermatyd lub spermatozoów można obserwować, przełączając na większe powiększenie – zazwyczaj 100X z zastosowaniem imersji olejowej.
5) Reprezentatywne wyniki
Przykład obrazu DIC spermatyd wyizolowanych od samca C. elegans przedstawiono na Rysunku 1. Spermatydy mają kształt kulisty i wyraźne jądra. Aktywowane in vitro plemniki przedstawiono na Rysunku 2.
Rycina 1. Obraz DIC spermatyd C. elegans.
Rycina 2. Obraz DIC aktywowanych in vitro plemników C. elegans.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Oprócz analizy mutantów Spe, protokół ten znajduje inne istotne zastosowania, takie jak analiza morfologii plemników w procesie starzenia. Spermatydy i spermatozoya wyizolowane zgodnie z tym protokołem mogą być wykorzystane w innych badaniach, takich jak immunobarwienie plemników typu dzikiego i mutantów8, 9, ocena ruchliwości plemników na preparatach10, pomiary fizjologiczne9, 11, a nawet sztuczne zapłodnienie12.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Samuelowi Wardowi, Diane C. Shakes i Gregory'emu Nelsonowi za opracowanie tej techniki. Dziękujemy Pavanowi Kadandale i Brianowi Geldzilerowi za materiały wideo przedstawiające aktywowane spermatozoa; członkom laboratorium Singsona za pomocne dyskusje; CGC za udostępnienie szczepów oraz NIH za wsparcie poprzez grant (R01HD054681).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Strzykawka tuberkulinowa | BD Biosciences | 309623 | Strzykawka: 1 ml, igła: 27G X ½ in |
| Pisak do histologii (Pap pen) | Zymed Laboratories, Inc. | 00-8888 | |
| Szkiełka mikroskopowe VWR VistaVision HistoBond | VWR international | 16004-406 | Wymiary: 75X25X1mm |
| Szkiłko nakrywne | VWR international | 48366045 | |
| Proteaza | Sigma-Aldrich | P-6911 |
Bibliografia
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the Sperm/Oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 405-433 (2007).
- Lhernault, S. W., Roberts, T. M. Methods in Cell Biology. , Vol. 48 273-301 (1995).
- Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 91, 67-94 (1979).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to male C. elegans anatomy. WormAtlas. , ColdSpring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2008).
- Shakes, D., Ward, S. Initiation of spermiogenesis in C. elegans: a pharmacological and genetic analysis. Dev Biol. 134, 189-200 (1989).
- Nelson, G. A., Ward, S. Vesicle fusion, pseudopod extension and amoeboid motility are induced in nematode spermatids by the ionophore monensin. Cell. 19, 457-464 (1980).
- L'Hernault, S. W. The genetics and cell biology of spermatogenesis in the nematode C. elegans. Molecular and Cellular Endocrinology. 306, 59-65 (2009).
- Chatterjee, I., Richmond, A., Putiri, E., Shakes, D., Singson, A. The Caenorhabditis elegans spe-38 gene encodes a novel four-pass integral membrane protein required for sperm function at fertilization. Development. 132, 2795-2808 (2005).
- Xu, X., Sternberg, P. A C. elegans sperm TRP protein required for sperm-egg interactions during fertilization. Cell. 114, 285-297 (2003).
- Nelson, G., Roberts, T., Ward, S. Caenorhabditis elegans spermatozoan locomotion: amoeboid movement with almost no actin. J Cell Biol. 92, 121-131 (1982).
- Machaca, K., DeFelice, L. J., L'Hernault, S. W. A novel chloride channel localizes to Caenorhabditis elegans spermatids and chloride channel blockers induce spermatid differentiation. Dev Biol. 176, 1-16 (1996).
- LaMunyon, C., Ward, S. Assessing the viability of mutant and manipulated sperm by artificial insemination of Caenorhabditis elegans. Genetics. 138, 689-692 (1994).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
