Monitorowanie przemieszczania się komórek odpornościowych do fluorescencyjnych pręcików prionowych w godzinach po zakażeniu drogą dosytrychialną

Podsumowanie

W niniejszej pracy opisujemy nową metodę monitorowania pobierania i transportu prionów przez komórki odpornościowe bezpośrednio po inokulacji doprzewnowej, polegającą na oczyszczaniu i znakowaniu fluorescencyjnym zagregowanych prętów prionowych z zakażonego materiału mózgowego, a następnie śledzeniu ich pobierania i przemieszczania się z miejsca wstrzyknięcia oraz charakteryzacji komórek pośredniczących w tych zdarzeniach.

Streszczenie

Obecność nieprawidłowej formy białka prionowego kodowanego przez gospodarza (PrPC), która jest oporna na proteazy, patogenna i zakaźna, charakteryzuje choroby prionowe, takie jak chroniczna wyniszczająca choroba (CWD) kopytnych oraz scrapie u owiec. Hipoteza prionowa zakłada, że ten nieprawidłowy konformer stanowi większość lub całość zakaźnego prionu. Rola układu odpornościowego we wczesnych zdarzeniach w obwodowej patogenezie prionów została przekonująco wykazana w przypadku CWD i scrapie ^1-3. Badania transgeniczne i farmakologiczne u myszy ujawniły istotną rolę układu dopełniacza w zatrzymywaniu i replikacji prionów wczesnym etapie po zakażeniu ^4-6. W badaniach in vitro oraz in vivo zaobserwowano również zatrzymywanie prionów przez komórki dendrytyczne ^7-10, choć ich rola w transporcie pozostaje niejasna ^11-16. Makrofagi były w podobny sposób implikowane we wczesnej patogenezie prionów, jednak badania te koncentrowały się na zdarzeniach występujących tygodnie po zakażeniu ^3,11,17. Wcześniejsze badania obarczone były również problemem różnicowania między endogennym PrP^C a prionami zakaźnymi. W niniejszej pracy opisujemy półilościowe, nieobciążone metodologicznie podejście do oceny pobierania i transportu prionów z miejsca inokulacji przez zwerbowane tam komórki odpornościowe. Agregaty prętów prionowych zostały oczyszczone z homogenatu zakażonego mózgu poprzez solubilizację białek niezagregowanych detergentem i ultrawirówkę na poduszce sacharozowej. Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym, barwienie błękitem Coomassie oraz western blotting potwierdziły odzyskanie silnie wzbogaconych prętów prionowych w frakcji osadu. Pręty prionowe zostały znakowane fluorochromem, a następnie wstrzyknięte domięśniowo u myszy. Dwie godziny później komórki odpornościowe z płynu z płukania otrzewnej, śledziony oraz węzłów chłonnych śródpiersnych i krezkowych poddano analizie pod kątem zatrzymania prętów prionowych, a podgrupy komórek zidentyfikowano za pomocą wielokolorowej cytometrii przepływowej z użyciem markerów dla monocytów, neutrofili, komórek dendrytycznych, makrofagów oraz limfocytów B i T. Analiza ta pozwala po raz pierwszy na bezpośrednie monitorowanie przejmowania i transportu prionów przez komórki odpornościowe in vivo w ciągu kilku godzin po zakażeniu. Metoda ta wyraźnie odróżnia zakaźne, zagregowane priony od PrPC normalnie ekspresowanego na komórkach gospodarza, co w innych systemach analitycznych może być trudne i prowadzić do problemów z interpretacją danych. Protokół ten można zaadaptować do innych dróg inokulacji (np. doustnej, dożylnej, wewnątrznerwowej i podskórnej) oraz innych antygenów (sprzężonych koralików, patogenów bakteryjnych, wirusowych i pasożytniczych oraz białek, jaja).

Protokół

1. Oczyszczanie i znakowanie pręcików prionowych

Niniejszy protokół został opracowany na podstawie wcześniej opublikowanej metody ¹⁸

1. Zhomogenizować 100 g tkanki mózgowej zakażonej prionami w 900 mL lodowatego buforu do homogenizacji (HB, 1X PBS zawierający 320 mM sacharozy, 150 mM NaCl i 4mM EDTA) przez 1 min z maksymalną prędkością w blenderze komercyjnym, a następnie przez 2 min na lodzie. Powtórzyć czynność trzy razy.
2. Wirować homogenizat przez 10 min przy 3000 x g i 4°C. Zebrać i przechowywać nadsącz na lodzie. Zawiesić osad ponownie w 1L HB i powtórzyć kroki 1.1 oraz 1.2.
3. Połączyć nadsączy i wirować przez 60 min przy 100,000 x g, 0°C. Odrzucić nadsącz.
4. Zawiesić osad ponownie w 100 mL 1X soli buforowanej trisem (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM NaCl i 1 mM EDTA) zawierającej 2% Triton X-100 (TBST). Oznaczyć stężenie białka metodą Bradforda lub podobnym testem i dostosować je do 5 mg/ mL w TBST. Schłodzić na lodzie przez 30 min.
5. Wirować przez 30 min przy 100,000 x g, 0°C. Odrzucić nadsącz i przemyć osad 50 mL TBST, a następnie 100 mL TBS. Zawiesić osad ponownie w 100 mL 1X PBS zawierającego 1% sarkozylu i koktajl inhibitorów proteaz i mieszać przez 120 min w 37°C.
6. Nanieść próbkę na warstwę 900 mL 320 mM sacharozy i wirować przez 60 min przy 100,000 x g, 10°C. Odrzucić nadsącz i zawiesić osad ponownie w 10 mL 2.3M NaCl, 5% sarkozylu.
7. Sonicować próbkę 5 x 40 sekund przy 70% maksymalnej mocy w odstępach 1 min na lodzie.
8. Przenieść próbkę w aliquotach 1 mL do probówek typu Eppendorf i wirować przez piętnaście minut przy 13,000 x g, 4°C. Przemyć osady dwukrotnie TBS i przechowywać w -70°C lub sprzęgnąć z fluorochromem w kroku 1.9.
9. Przeprowadzić sprzęganie oczyszczonych pręcików prionowych z jednej probówki przy użyciu jednej fiolki fluorochromu DyLight 649 zgodnie z protokołem producenta.
10. Wymienić bufor do znakowania DyLight na PBS poprzez dializę lub wirowanie przez kolumny z filtrem. Przechowywać w aliquotach 20 μL w -70°C, w ciemności, do momentu użycia.

2. Inokulacja prionami i odzyskiwanie komórek

Niniejsza sekcja obejmuje dostrytonalne inokulowanie prionami oraz izolację komórek z otrzewnej, węzłów chłonnych śródpiersiowych i krezkowych oraz z śledziony.

1. Bezpośrednio przed użyciem rozcieńczyć fluorescencyjne priony w formie pręcików w PBS w stosunku 1:50. Chwycić mysz za skórę karku kciukiem i palcem wskazującym, delikatnie obrócić mysz przodem do siebie i unieruchomić ogon małym palcem. Położyć mysz na grzbiecie, unosząc tylną część tułowia ponad głowę i trzymając ją lekko do góry nogami.
2. Za pomocą strzykawki insulinowej 30G wstrzyknąć 100 μL fluorescencyjnych prionów w formie pręcików 1 cm bocznie od linii środkowej i 1-2 cm przed stawem krzyżowo-biodrowym. Wprowadzić igłę na 1 cm przez skórę, kierując ją pod kątem 45° przyśrodkowo. Jako kontrole zastosować rozcieńczenie 1:50 kuleczek fluorescencyjnych lub sam PBS. Inkubować myszy przez wyznaczony czas przed analizą.
3. Uśmiercić myszy zgodnie z zatwierdzonymi protokołami komisji ds. opieki i wykorzystania zwierząt. Wstrzyknąć 10 mL PBS do jamy otrzewnowej za pomocą strzykawki 12 mL i igły 25G. Delikatnie kołysać truchłem wzdłużnie przez jedną minutę. Odzyskać zawiesinę komórkową z otrzewnej za pomocą tej samej strzykawki i igły 16G do probówki stożkowej 15 mL i przechowywać na lodzie podczas dalszej sekcji truchła.
4. Dokładnie zwilżyć brzuszną stronę truchła 70% etanolem. Za pomocą pęsety unieść skórę na linii środkowej tuż poniżej klatki piersiowej i wykonać nożyczkami małe nacięcie skóry. Począwszy od tego miejsca, wykonać nacięcie skóry o długości 3-5 cm w obu kierunkach – w stronę głowy i ogona, a następnie dwa nacięcia o długości 2 cm od linii środkowej bocznie z każdego końca. Odsunąć i przypiąć skórę, aby odsłonić jamę otrzewną i klatkę piersiową. Ostrożnie przeciąć cienkie, półprzezroczyste błony otaczające otrzewną i odsunąć klatkę piersiową, aby odsłonić śródpiersie.
5. Zlokalizować i usunąć 2-4 węzły chłonne śródpiersia, położone nieco grzbietowo i bocznie w sąsiedztwie grasicy, przyśrodkowo w sąsiedztwie tętnicy szyjno-głowowej, blisko brzusznej strony tchawicy. Zlokalizować i usunąć do sześciu węzłów chłonnych krezkowych, zatopionych w miękkiej, białej tkance krezkowej, która mocuje jelita do tylnej ściany brzucha. Zlokalizować i usunąć śledzionę – długi, ciemnoczerwony organ znajdujący się tuż bocznie od linii środkowej i grzbietowo względem jelit po lewej stronie brzucha. Przechowywać węzły chłonne w 1 mL pożywki RPMI 1640 na lodzie do czasu zakończenia sekcji.
6. Rozetrzeć i przecisnąć węzły chłonne przez sito o oczkach 40 μm do 3 mL RPMI w plastikowej szalce Petriego, używając tłoka strzykawki 1 mL. Przepłukać sito dodatkowymi 2 mL RPMI i przenieść 5 mL zawiesiny komórkowej do probówki stożkowej 15 mL. Przepłukać szalkę Petriego dodatkowymi 5 mL RPMI i przenieść do tej samej probówki. Wirować przez 5 min przy 250 x g, odrzucić nadsącz, zawiesić osad komórkowy w 1 mL buforu FACS (1X PBS, 1% albuminy surowicy bydlęcej i 10 mM EDTA) i przenieść do probówki Eppendorf 1,5 mL.

3. Barwienie komórek i cytometria przepływowa

Poniżej przedstawiono typowy protokół barwienia służący do identyfikacji subpopulacji komórek odpornościowych z wykorzystaniem przeciwciał fluorescencyjnych przeciwko dobrze scharakteryzowanym markerom powierzchniowym komórek immunologicznych. Wszystkie przeciwciała rozcieńczono w buforze FACS bezpośrednio przed użyciem.

1. Należy policzyć komórki i przenieść 10⁶ komórek do probówek Eppendorf. Komórki należy odwirować (patrz 2.7) i dwukrotnie przemyć osad 1 mL buforu FACS.
2. Komórki należy inkubować przez 20 min na lodzie w 100 μL roztworu przeciwciał szczurzych anty-mysich CD16/32 w stężeniu 2 ng/mL w celu zablokowania endogennych receptorów Fc. Następnie należy odwirować i przemyć komórki buforem FACS.
3. Do każdej próbki należy dodać 100 μL odpowiednich fluorescencyjnych przeciwciał w stężeniu 1 ng/mL i inkubować na lodzie przez jedną godzinę. Do komórek kontrolnych należy dodać 100 μL samego buforu FACS. Następnie należy odwirować i dwukrotnie przemyć komórki buforem FACS.
4. Komórki należy zawiesić w 1 mL buforu ACK (150 mM NH₄Cl, 1 mM KHCO₃ i 0,1 mM EDTA). Inkubować na lodzie przez 1 min w celu lizy erytrocytów. Następnie należy odwirować i przemyć komórki buforem FACS, a potem ponownie zawiesić komórki w 1 mL buforu FACS.
5. Dane z komórek należy zebrać przy użyciu cytometru przepływowego z możliwością wielokolorowej detekcji i analizy, zazwyczaj wyposażonego w lasery wzbudzające o długościach fal 405, 488 i 633 nm oraz od pięciu do dziesięciu detektorów emisji fluorescencji.

4. Reprezentatywne wyniki:

Oczyszcziliśmy priony w formie prętów z surowego homogenatu mózgu zakażonego prionami (Rysunek 1). Solubilizacja detergentem i ultrawirówkowanie homogenatu mózgu łosia E2 (ścieżki 1 i 2) doprowadziły do znacznego wzbogacenia w pręty prionowe (porównaj ścieżki 1 i 3), które były również odporne na proteazę K (ścieżka 4). Co ciekawe, niepoddane trawieniu oczyszczone pręty prionowe wykazały profil glikoform uderzająco podobny do trawionego homogenatu mózgu E2, co wskazuje na gwałtowne wzbogacenie w priony. Identycznie traktowany normalny homogenat mózgu nie wytworzył odpornego na PK PrP^C (ścieżki 5 i 6).

Analiza cytometryczna przepływowa specyficznych populacji komórek wykazuje, że komórki prezentujące antygen migrują do otrzewnej w ciągu dwóch godzin i zatrzymują fluorescencyjne koraliki oraz priony w formie pręcików, o czym świadczy gwałtowny wzrost fluorescencji w porównaniu z grupami kontrolnymi wstrzykiwanymi PBS (Rycina 2). Żadne komórki pobrane z otrzewnej kontroli traktowanych PBS nie wykazały fluorescencji powyżej tła (Ryc. 2A-G), podczas gdy komórki z myszy inokulowanych koralikami (Ryc. 2H-N) i prionami (Ryc. 2O-U) wykazały znaczącą fluorescencję, szczególnie w przypadku monocytów (Ryc. 2I i P), komórek dendrytycznych (Ryc. 2K i R) i makrofagów (Ryc. 2L i S), a także niektórych neutrofili (Rycina 2J i Q) i niewielkiej liczby limfocytów B (Rycina 2T). Monocyty, komórki dendrytyczne i makrofagi zawierające koraliki i priony znaleziono również w węzłach chłonnych śródpiersia dwie godziny po inokulacji (Ryc. 2AD i AK, AF i AM oraz AG i AN, odpowiednio), podczas gdy znaleziono tam niewielką liczbę lub żadnych neutrofili, limfocytów B lub T zawierających PrP^CWD (Ryc. 2AE i AL, AH i AG oraz AI i AP, odpowiednio). W śledzionie oraz węzłach chłonnych krezkowych nie wykryto koralików ani prionów w formie pręcików (dane niepokazane). Podsumowując, dane te dowodzą, że komórki odpornościowe transportują priony w sposób bardzo podobny do innych antygenów cząsteczkowych.

ODCZNIK	FLUOROCHROM	LASER WZBUDZENIA (nm)	MAKSIMUM EMISJI (nm)
Pręciki prionowe	DyLight 649	633	674
Kuleczki 1 μm	AlexaFluor 660	633	685
Przeciwciała
CD11b	eFluor 450	405	450
	Fikoerytryna-Cy7	488	760
CD11c	R-Fikoerytryna	488	575
	Fikoerytryna-Cy7	488	760
Ly6C	Fluoroisotiocyjanian	488	518
Ly6G	R-Fikoerytryna	488	575
CD21	DyLight 488	488	518
B220	Allofikocyjanina-Cy7	633	785
CD3	R-Fikoerytryna	488	575

Tabela 1. Właściwości spektralne odczynników fluorescencyjnych

Rysunek 1. Oczyszczanie prętów prionowych z zakażonego homogenatu mózgu. Jako materiał wyjściowy wykorzystano 10% surowy homogenat mózgu jelenia zakażonego CWD (E2, ścieżki 1 i 2), z którego oczyszczono zagregowane pręty prionowe (ścieżki 3 i 4). Zarówno materiał surowy, jak i oczyszczony wykazały charakterystyczną odporność na działanie proteazy K (ścieżki 1–4), podczas gdy normalny homogenat mózgu nie wykazał takiej odporności (ścieżki 5 i 6). Markery masy cząsteczkowej podano w Kd po lewej stronie blotu. BH, homogenat mózgu.

Rysunek 2. Analiza cytometryczna przepływowa komórek odpornościowych transportujących priony z otrzewnej do węzłów chłonnych śródpiersia dwie godziny po inokulacji. PBS (panele A-G i V-AB), koraliki fluorescencyjne (H-N i AC-AI) lub pręciki prionowe (O-U i AJ-AP) wstrzyknięto do jamy otrzewnej myszy, a komórki pobrano z płynu z przemywania otrzewnej (A-U) lub węzłów chłonnych śródpiersia (V-AP) dwie godziny później. Wykresy w pierwszej kolumnie przedstawiają komórki od myszy traktowanych PBS (panele A i V), koralikami fluorescencyjnymi (panel H i AC) oraz pręcikami prionowymi (panele O i AJ). Komórki fluorescencyjne (czerwone lub zielone kropki) oraz całkowita liczba komórek (szare kropki) zostały naniesione na wykresy w celu pokazania względnej wielkości (forward scatter), ziarnistości (side scatter) i proporcji całkowitej liczby żywych komórek wykazujących fluorescencję. Znacząca liczba komórek charakterystycznych dla granulocytów zatrzymała koraliki fluorescencyjne i pręciki. Komórki zabarwiono również przeciwciałami przeciwko markerom powierzchniowym komórek odpornościowych i wyodrębniono za pomocą bramkowania monocyty LyG- Ly6C+ (panele B, I, P, W, AD i AK), neutrofile Ly6c- CD11c- CD11b+ Ly6G+ (C, J, Q, X, AE i AL), komórki dendrytyczne Ly6G- Ly6C- CD11b+ CD11c+ (D, K, R, Y, AF i AM), makrofagi Ly6G- Ly6C- CD11c- CD11b+ (E, L, S, Z, AG i AN), limfocyty B CD3-B220+CD21+ (F, M, T, AA, AH i AO) oraz limfocyty T CD21-B220- CD3+ (G, N, U, AB, AI i AP). Monocyty, komórki dendrytyczne i makrofagi zatrzymały koraliki fluorescencyjne i pręciki prionowe w jamie otrzewnej (odpowiednio panele I i P, K i R oraz L i S) i przetransportowały je do węzłów chłonnych śródpiersia (odpowiednio panele AD i AK, AF i AM oraz AG i AN), co świadczy o podobnym pobieraniu i transporcie tych dwóch rodzajów cząstek. Neutrofile zatrzymały znaczną ilość koralików (J) i mniej pręcików (Q), ale nie dostarczyły ich do węzłów chłonnych (AE i AL). Limfocyty B zatrzymały i przetransportowały niektóre pręciki (T i AO), ale praktycznie żadnych koralików (M i AH). Limfocyty T nie transportowały ani koralików, ani pręcików (N, U, AI i AP).

Dyskusja

W niniejszej pracy prezentujemy protokół znakowania i śledzenia prionów in vivo, który znacznie ułatwia monitorowanie wczesnych zdarzeń podczas obwodowej infekcji prionowej. Protokół ten stanowi znaczną poprawę w stosunku do wcześniejszych prób monitorowania wychwytu prionów in vitro ⁹ oraz in vivo ^3,12 poprzez wstępne znakowanie silnie wzbogaconego inokulum prionowego, co pozwala na jednoznaczne odróżnienie go od endogennego PrP^C. Ponieważ zakaźne priony i PrP<...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
mózg łosia zainfekowany CWD	Prywatna farma łosi w Kolorado		Można użyć dowolnego mózgu zainfekowanego prionami pochodzenia nie-ludzkiego
Blender	Oster Professional Products	6694-015	Można użyć dowolnego blendera komercyjnego
Wirówka	Sorvall, Thermo Scientific	rotor SS34	Można użyć dowolnej wirówki/rotora osiągającego 3000 x g i mieszczącego objętości ≥ 500 ml
Ultrawirówka	Beckman Coulter Inc.	rotor 50.2 Ti	Można użyć dowolnej ultrawirówki/rotora osiągającego 100 000 x g i mieszczącego objętości ≥ 500 ml
Odczyn Bradforda	Sigma-Aldrich	B6916
Kompletny mini koktajl inhibitorów proteaz	Roche Group	11 836 170 001
Sonikator	Misonix	MP4000X	Można użyć dowolnego sonikatora z tubą lub sondą ustawionego na ~70% maksymalnej mocy
Zestaw do znakowania przeciwciał DyLight	Thermo Fisher Scientific, Inc.	53050
mikrowirówka	Eppendorf	55430R	Można użyć dowolnej chłodzonej mikrowirówki, która może osiągnąć 13 000x g
wirnikowe kolumny filtrujące	EMD Millipore	Microcon YM-100	Można użyć dowolnego filtra lub membrany dializacyjnej z progiem odcięcia masy cząsteczkowej 100 Kd
myszy FVB w wieku 8-40 tygodni	Charles River Laboratories	207	Można użyć dowolnej inbredowej linii myszy
czerwone fluorescencyjne kuleczki 1 μm	Phosphorex	2307	Można użyć dowolnych fluorescencyjnych kuleczek ≤ 10 μm
pożywka RPMI 1640	Invitrogen	11875-093
sito do komórek 40 μm	Falcon BD	352340
przeciwciała fluorescencyjne	BD Biosciences	Różne	Można użyć dowolnego przeciwciała fluorescencyjnego odpowiedniego dla danej aplikacji.
cytometr przepływowy	Dako	CyanADP	Można użyć dowolnego cytometru przepływowego zdolnego do wielobarwnej detekcji fluorescencji