Artykuł metodologiczny

Podwójne rejestracje metodą patch-clamp z neuronów ruchowych i docelowych mięśni szkieletowych u danio pręgowanego

21.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2351

⸱

20 listopada 2010

 , 
1Vollum Institute, Oregon Health and Sciences University

W tym artykule

Podsumowanie

Larwy danio pręgowanego stanowią pierwszy kręgowcowy system modelowy umożliwiający jednoczesną rejestrację metodą patch-clamp z motoneuronu rdzeniowego i docelowego mięśnia szkieletowego. Niniejszy film prezentuje metody mikroskopowe stosowane do identyfikacji segmentowego motoneuronu CaP oraz docelowych komórek mięśniowych, a także metodologię rejestracji z każdego z tych typów komórek.

Streszczenie

Larwy danio pręgowanego stanowią pierwszy kręgowcowy system modelowy umożliwiający jednoczesną rejestrację metodą patch-clamp z rdzeniowego neuronu ruchowego i mięśnia docelowego. Jest to bezpośredni skutek dostępności obu typów komórek oraz możliwości wizualnego odróżnienia pojedynczego segmentowego neuronu ruchowego CaP na podstawie morfologii i lokalizacji. Niniejszy film prezentuje metody mikroskopowe stosowane do identyfikacji neuronu ruchowego CaP i komórek mięśni docelowych, a także metodologię rejestracji z każdego z tych typów komórek. Identyfikacja typu neuronu ruchowego CaP jest potwierdzana poprzez wypełnianie barwnikiem lub na podstawie cech biofizycznych, takich jak kształt potencjału czynnościowego i oporność wejściowa komórki. Rejestracje z neuronów ruchowych trwają rutynowo jedną godzinę, co pozwala na długoterminowe pomiary z wielu różnych komórek mięśni docelowych. Kontrola nad wzorcem wyładowań neuronu ruchowego umożliwia pomiary zależności częstotliwościowej przewodnictwa synaptycznego w złączu nerwowo-mięśniowym. Dzięki dużej wielkości kwantowej i niskiemu poziomowi szumów zapewnianemu przez metodę voltage clamp w konfiguracji whole-cell, wszystkie zdarzenia jednostkowe w mięśniu mogą zostać rozdzielone. Cecha ta pozwala na badanie podstawowych właściwości synaptycznych, takich jak właściwości uwalniania, recykling pęcherzyków, a także depresja i facylitacja synaptyczna. Zalety oferowane przez tę preparację in vivo przewyższają poprzednie badane systemy modelowe złącza nerwowo-mięśniowego, w których neurony ruchowe są zazwyczaj stymulowane elektrodami zewnątrzkomórkowymi, a mięśnie są zbyt duże dla metody patch-clamp w konfiguracji whole-cell. Preparat z danio pręgowanego umożliwia łączenie analizy elektrofizjologicznej z szerokim zakresem podejść, w tym z wykorzystaniem linii transgenicznych, wyciszaniem za pomocą morfolino, interwencją farmakologiczną oraz obrazowaniem in vivo. Podejścia te, w połączeniu z rosnącą liczbą modeli chorób nerwowo-mięśniowych dostarczanych przez mutantowe linie danio pręgowanego, otwierają drogę do nowego zrozumienia ludzkich zaburzeń nerwowo-mięśniowych.

Protokół

1. Przygotowanie ryb do rejestracji sparowanych

  1. Przed rozpoczęciem procedury należy przygotować pięć kluczowych roztworów: roztwór kąpielowy (Bath Solution), roztwór kąpielowy z trikainą (MS222), roztwór kąpielowy z formamidem, wewnętrzny roztwór neuronów oraz wewnętrzny roztwór mięśni.
  2. Następnie należy pobrać pojedynczą larwę danio pręgowanego w wieku od 72 do 96 godzin i umieścić ją w roztworze kąpielowym z trikainą. W ciągu jednej minuty od kontaktu z anestetykiem ryba przestanie reagować na dotyk.
  3. Rybę należy położyć na plastikowym spodku i, korzystając ze stereomikroskopu, odciąć głowę za pomocą dwustronnej żyletki.
  4. Przenieść rybę do szklanej komory rejestracyjnej powleczonej sylgardem i wypełnionej roztworem kąpielowym. Przymocować ją na obu końcach, wbijając elektrochemicznie zaostrzone piny wolframowe przez notochord.
  5. Za pomocą pinu należy stworzyć płat skóry w pobliżu końca rostralnego ryby, co zapewni odpowiedni uchwyt dla pęsety precyzyjnej. Usunąć pokrywającą skórę, chwytając ją pęsetą precyzyjną w pobliżu pinu rostralnego. Powoli odklejać skórę w kierunku kaudalnym, aby ją usunąć.
  6. Potraktować rybę 3 ml roztworu kąpielowego z formamidem przez 3-5 minut, aby zablokować skurcze mięśni, które mogłyby zakłócić pomiary. Przepłukać 5 razy zwykłym roztworem kąpielowym. Usunąć część powierzchownej warstwy mięśni nad 5 do 6 segmentami, delikatnie zeskrobując ją bokiem pinu wolframowego.
  7. Przenieść rybę pod mikroskop pionowy umieszczony w klatce Faradaya w celu ekranowania szumów elektrycznych. Mikroskop jest wyposażony w stały stolik, obiektyw 40x o dużej odległości roboczej oraz zoom od 0,5 do 4x. Mikroskop jest zamontowany na zmotoryzowanym stoliku translacyjnym X-Y, aby umożliwić przesuwanie preparatu między nerwem a mięśniem przy dużym powiększeniu. Zastosowanie optyki kontrastu różnicowego (DIC) pomaga w wizualizacji neuronów.
  8. Przy powiększeniu 0,5x, użyć pipety o szerokim świetle (15 µm), aby usunąć nadleżące mięśnie i odsłonić rdzeń kręgowy. Podciśnienie wytwarza się za pomocą jednorazowej strzykawki 3 cc, a komórki mięśniowe usuwa się pojedynczo. Procedurę tę powtarza się dla 5 do 6 grzbietowych segmentów mięśni szkieletowych. Tą samą pipetą o szerokim świetle usuwa się również dwie górne warstwy mięśni brzusznych, aby uzyskać docelowe szybkie mięśnie szkieletowe.
  9. Tym kończy się przygotowanie do pomiarów sparowanych, a powiększenie mikroskopu zwiększa się do około 1,6x.

2. Rejestracje sparowane motoneuronu CaP i komórek mięśnia docelowego

  1. Oczyszczone segmenty są skanowane w celu zlokalizowania neuronów CaP. Każdy półsegment rdzenia kręgowego zawiera jeden duży motoneuron CaP o średnicy 10 µm. To łezkowate soma znajduje się powierzchownie pod twardą oponą rdzenia, w pobliżu najbardziej ogonowej strony granicy segmentu. Wybierany jest neuron CaP do rejestracji, a następnie skanowany jest brzuszny mięsień docelowy w sąsiednim segmencie ogonowym w celu sprawdzenia jego integralności.
  2. Do rejestracji pozycjonowane są dwie elektrody patch-clamp: jedna dla neuronu, a druga dla mięśnia. Górna elektroda ma niewielki skos, umożliwiający penetrację twardej oponą rdzenia, oraz otwór końcowy o średnicy około 2 µm. Dolna elektroda ma większy skos, co pozwala na rejestrację metodą clampowania napięcia (voltage clamp) o niskiej rezystancji w mięśniach szkieletowych.
  3. Elektrodę neuronową ustawia się pod kątem około 30 stopni, aby przebić twardą oponę rdzenia, około półsegmenta w kierunku rostralnym względem wybranego neuronu CaP. Elektrodę posuwa się za pomocą manipulatora z napędem osiowym, przykładając delikatne, ciągłe nadciśnienie o wartości około 60 mmHg. W momencie przebicia opony rdzenia, neuron CaP może zostać przesunięty przez perfuzję z elektrody, co wymaga ponownego ustawienia ostrości.
  4. Gdy elektroda dotknie somy neuronu CaP, nadciśnienie jest zwalniane, co zazwyczaj prowadzi do natychmiastowego utworzenia uszczelnienia gigaomowego (gigaohm seal). Jednak w niektórych przypadkach, gdy uszczelnienie nie powstaje, konieczne jest zastosowanie delikatnego podciśnienia. Po utworzeniu uszczelnienia potencjał elektrody jest ustawiany na -80mV, a zastosowanie podciśnienia powoduje przerwanie błony komórkowej. Neuron CaP charakteryzuje się rezystancją wejściową od 140 do 180 MΩ oraz potencjałem czynnościowym, który przekracza +40 mV. Jest to sprawdzane poprzez wstrzykiwanie stopniowo zwiększających się skoków depolaryzujących w trybie clampowania prądu (current clamp), aż do wywołania potencjału czynnościowego.
  5. Następnie, przy użyciu silnikowego translatora X-Y i dużym powiększeniu, mikroskop jest przenoszony na brzuszny mięsień. Z pola docelowego wybierana jest komórka mięśnia szybkokurczliwego.
  6. Elektrodę mięśniową posuwa się w kierunku docelowej komórki mięśniowej przy nadciśnieniu, które po zwolnieniu tworzy uszczelnienie gigaomowe. Potencjał elektrody ustawia się na -50 mV w celu inaktywacji kanałów sodowych, a następnie pod wpływem delikatnego ssania następuje przerwanie błony komórkowej. Spadek rezystancji do 100–200 MΩ oraz nagłe pojawienie się dużych przejściowych prądów pojemnościowych sygnalizują wejście do komórki.
  7. Aby przetestować rejestrację sparowaną, motoneuron jest depolaryzowany poprzez stopniowo większe wstrzyknięcia prądu, aż do wywołania potencjału czynnościowego. W tym momencie w mięśniu powinien pojawić się prąd płytki końcowej. Dalsza stymulacja motoneuronu z częstotliwością 1 Hz skutkuje występowaniem prądów płytki końcowej bez przerw. Po zwiększeniu częstotliwości stymulacji do 100 Hz amplitudy prądów płytki końcowej ulegają wahaniom i dochodzi do ich funkcjonalnego wyczerpania w ciągu 10 sekund stymulacji.

3. Reprezentatywne wyniki

Zazwyczaj rejestracja z neuronu jest stabilna do godziny, jednak komórki mięśniowe ulegają degradacji, co objawia się wzrostem rezystancji szeregowej. W takim przypadku eksperyment zostaje przerwany lub do badania patch-clamp zostaje wybrana kolejna komórka mięśniowa. Wszystkie pomiary powinny zostać zakończone w ciągu jednej godziny.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Rejestracje potencjału czynnościowego motoneuronu (AP, góra) oraz powiązanego z nim prądu blaszki końcowej mięśnia (EPC, dół). Potencjał czynnościowy neuronu CaP powinien przekroczyć +40 mV, a EPC powinien wzrosnąć w ciągu 300 μsec i zanikać zgodnie z przebiegiem wykładniczym ze stałą czasową poniżej 1 msec.

Nazwa Receptura
Roztwór kąpielowy (w mM)134 NaCl, 2,9 KCl, 2,1 CaCl2, 1,2 MgCl22, 10 glukozy, 10 Na-HEPES, pH 7,8
Roztwór kąpielowy z trikainąroztwór kąpielowy zawierający 0,02% trikainy
Roztwór do kąpieli z formamidemRoztwór do kąpieli zawierający 2M formamid
Roztwór wewnętrzny neuronu (w mM)115 K-glukonianu, 15 KCl, 2 MgCl22, 10 mM HEPES, 5 mM EGTA, 4 mM Mg-ATP, pH 7,2
Wewnętrzny roztwór mięśniowy (w mM)120 KCl, 10 K-HEPES, 5 BAPTA, pH 7,4

Tabela 1. Roztwory.

Dyskusja

Stosujemy podwójne rejestracje u rybek zebrafish (Wen i Brehm, 2005) głównie w celu badania procesów uwalniania i recyklingu pęcherzyków podczas stymulacji o wysokiej częstotliwości. Proces ten jest zaburzony u mutantów ruchowych, u których prawidłowa transmisja synaptyczna jest upośledzona z powodu mutacji punktowych w kluczowych komponentach synaptycznych. Na przykład mutacje zakłócające agregaty receptorów postsynaptycznych (Ono et al., 2001, 2002, 2004) oraz syntezę przekaźnika presynaptycznego (Wang et al., 2008) skutkują nieskoordynowanym pływaniem. Podwójne rejestracje dostarczają informacji, które pozwalają precyzyjnie określić źródło defektu funkcjonalnego, łącząc w ten sposób zachowanie, genetykę i fizjologię. Obecnie możliwe powinno być dalsze analizowanie procesów leżących u podstaw transmisji synaptycznej za pomocą przejściowej ekspresji w neuronach ruchowych CaP przy użyciu odpowiednio dobranych promotorów. W ten sposób geny dominująco negatywne lub zmutowane mogą być specyficznie wyrażane w tych neuronach, co pozwala na określenie skutków zarówno behawioralnych, jak i elektrofizjologicznych. Dodatkową zaletą oferowaną przez konfigurację whole-cell jest możliwość dializy somy CaP za pomocą czynników, które mogą potencjalnie zmieniać recykling pęcherzyków, takich jak toksyny klostrydialne i bufory wapnia. Ze względu na krótką odległość między somą a mięśniem, dyfuzja powinna zachodzić w czasie mniejszym niż czas trwania rejestracji. Potencjał tej preparatyki został dopiero zaczęty być wykorzystany. Przezroczystość ryby w tym wieku oraz powierzchowne rozmieszczenie synaps ułatwiają również stosowanie narzędzi optycznych (Fetcho i O'Malley, 1997; Fetcho i Higashijima, 2004). Odnieśliśmy sukcesy w pomiarach endocytozy i egzocytozy u żywych ryb przy użyciu barwników FM i wskaźników genetycznych, takich jak Synaptophluorin (Li et al., 2003). Dodatkowo, toksyny sprzężone z fluorescencją mogą być używane do znakowania białek synaptycznych w celu obrazowania żywych ryb (Ibanez-Tallon et al., 2004). Biorąc pod uwagę prostotę tej preparatyki, daje ona duże nadzieje na przyszłe badania.

Oświadczenia

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Podziękowania

Finansowane przez NIH (NS-18205).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tester przetwornika pneumatycznegoFluke BiomedicalDPM1B
Pręt wolframowy 0.002 x 3 inchA-M Systems715000
Elastomer Sylgard 184Dow CorningGrubość aplikacji wpłynie na optykę DIC

Bibliografia

  1. Fetcho, J. R., O'Malley, D. Imaging neuronal networks in behaving animals. Current Opinion in Neurobiology. 7, 832-838 (1997).
  2. Fetcho, J. R., S, H. igashijima Optical and genetic approaches toward understanding neuronal circuits in zebrafish. Integr Comp Biol. 44, 57-70 (2004).
  3. Ibañez-Tallon, I., Wen, H., Miwa, J., Xing, J., Aslantas-Tekinay, A., Ono, F., Brehm, P., Heintz, N. Tethering naturally occurring peptide toxins for cell autonomous modulation of ion channels and receptors in vivo. Neuron. 43, 305-311 (2004).
  4. Li, W., Ono, F., Brehm, P. Optical measurements of presynaptic release in mutant zebrafish lacking postsynaptic receptors. J. Neuroscience. , 23-10467 (2003).
  5. Ono, F., Mandel, G., Brehm, P. Acetylcholine receptors direct rapsyn clusters to the neuromuscular synapse in zebrafish. J. Neuroscience. 24, 475-5481 (2004).
  6. Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Fetcho, J., Mandel, G., Brehm, P. Paralytic zebrafish lacking ACh receptors fail to localize rapsyn clusters to the synapse. J. Neuroscience. 21, 5439-5448 (2001).
  7. Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Mandel, G., Brehm, P. The zebrafish motility mutant twitch once reveals new roles for rapsyn in synaptic function. J. Neuroscience. 22, 6491-6498 (2002).
  8. Wang, M., Wen, H., Brehm, P. Function of neuromuscular synapses in the zebrafish choline-acetyltransferase mutant bajan. J Neurophysiol. , 100-104 (2008).
  9. Wen, H., Brehm, P. Paired motor-neuron muscle recordings in zebrafish test the receptor blockade model for shaping synaptic current. J. Neuroscience. 25, 8104-8111 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rejestracja neuron w ruchowychrejestracja mi ni szkieletowychp ytka nerwowo mi niowa u danio pr gowanegoidentyfikacja neuron w ruchowych CaPelektrofizjologiczna metoda clampowania napi cia ca ej kom rkianaliza transmisji synaptycznejkontrast interferencyjny r nicowyzmotoryzowany stolik przesuwny XYpreparaty larw danio pr gowanego

Powiązane artykuły