Larwy danio pręgowanego stanowią pierwszy kręgowcowy system modelowy umożliwiający jednoczesną rejestrację metodą patch-clamp z motoneuronu rdzeniowego i docelowego mięśnia szkieletowego. Niniejszy film prezentuje metody mikroskopowe stosowane do identyfikacji segmentowego motoneuronu CaP oraz docelowych komórek mięśniowych, a także metodologię rejestracji z każdego z tych typów komórek.
Artykuł metodologiczny
Podwójne rejestracje metodą patch-clamp z neuronów ruchowych i docelowych mięśni szkieletowych u danio pręgowanego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Larwy danio pręgowanego stanowią pierwszy kręgowcowy system modelowy umożliwiający jednoczesną rejestrację metodą patch-clamp z rdzeniowego neuronu ruchowego i mięśnia docelowego. Jest to bezpośredni skutek dostępności obu typów komórek oraz możliwości wizualnego odróżnienia pojedynczego segmentowego neuronu ruchowego CaP na podstawie morfologii i lokalizacji. Niniejszy film prezentuje metody mikroskopowe stosowane do identyfikacji neuronu ruchowego CaP i komórek mięśni docelowych, a także metodologię rejestracji z każdego z tych typów komórek. Identyfikacja typu neuronu ruchowego CaP jest potwierdzana poprzez wypełnianie barwnikiem lub na podstawie cech biofizycznych, takich jak kształt potencjału czynnościowego i oporność wejściowa komórki. Rejestracje z neuronów ruchowych trwają rutynowo jedną godzinę, co pozwala na długoterminowe pomiary z wielu różnych komórek mięśni docelowych. Kontrola nad wzorcem wyładowań neuronu ruchowego umożliwia pomiary zależności częstotliwościowej przewodnictwa synaptycznego w złączu nerwowo-mięśniowym. Dzięki dużej wielkości kwantowej i niskiemu poziomowi szumów zapewnianemu przez metodę voltage clamp w konfiguracji whole-cell, wszystkie zdarzenia jednostkowe w mięśniu mogą zostać rozdzielone. Cecha ta pozwala na badanie podstawowych właściwości synaptycznych, takich jak właściwości uwalniania, recykling pęcherzyków, a także depresja i facylitacja synaptyczna. Zalety oferowane przez tę preparację in vivo przewyższają poprzednie badane systemy modelowe złącza nerwowo-mięśniowego, w których neurony ruchowe są zazwyczaj stymulowane elektrodami zewnątrzkomórkowymi, a mięśnie są zbyt duże dla metody patch-clamp w konfiguracji whole-cell. Preparat z danio pręgowanego umożliwia łączenie analizy elektrofizjologicznej z szerokim zakresem podejść, w tym z wykorzystaniem linii transgenicznych, wyciszaniem za pomocą morfolino, interwencją farmakologiczną oraz obrazowaniem in vivo. Podejścia te, w połączeniu z rosnącą liczbą modeli chorób nerwowo-mięśniowych dostarczanych przez mutantowe linie danio pręgowanego, otwierają drogę do nowego zrozumienia ludzkich zaburzeń nerwowo-mięśniowych.
Protokół
1. Przygotowanie ryb do rejestracji parowych
- Przed rozpoczęciem procedury należy przygotować pięć kluczowych roztworów: roztwór kąpielowy (Bath Solution), roztwór kąpielowy z trikainą (MS222), roztwór kąpielowy z formamidem, wewnętrzny roztwór neuronów oraz wewnętrzny roztwór mięśni.
- Następnie należy pobrać jedną larwę danio pręgowanego w wieku od 72 do 96 godzin i umieścić ją w roztworze kąpielowym z trikainą. W ciągu jednej minuty od kontaktu z anestetykiem ryba przestanie reagować na dotyk.
- Umieść rybę na plastikowym spodku i, korzystając ze stereomikroskopu, oddziel głowę za pomocą dwustronnej żyletki.
- Przenieś rybę do szklanej komory rejestracyjnej pokrytej sylgardem i wypełnionej roztworem kąpielowym. Przymocuj ją na obu końcach, wbijając elektrochemicznie zaostrzone piny wolframowe przez strunę grzbietową.
- Za pomocą pinu stwórz płatek skóry w pobliżu końca rostralnego ryby, który zapewni odpowiedni uchwyt dla precyzyjnej pęsety. Usuń znajdującą się powyżej skórę, chwytając ją w pobliżu pinu rostralnego precyzyjną pęsetą. Powoli odrywaj skórę w kierunku caudalnym, aby ją usunąć.
- Potraktuj rybę 3 ml roztworu kąpielowego z formamidem przez 3-5 minut, aby zablokować skurcze mięśni, które mogłyby zakłócić pomiary. Przepłucz 5 razy zwykłym roztworem kąpielowym. Usuń część powierzchownej warstwy mięśni nad 5 do 6 segmentami, delikatnie zeskrobując ją bokiem pinu wolframowego.
- Przenieś rybę pod mikroskop pionowy umieszczony w klatce Faradaya w celu ekranowania zakłóceń elektrycznych. Mikroskop jest wyposażony w stały stolik, obiektyw 40x o dużej odległości roboczej oraz zoom od 0,5 do 4x. Mikroskop jest zamontowany na zmotoryzowanym stoliku translacyjnym X-Y, aby umożliwić przemieszczanie preparatu między nerwem a mięśniem przy dużym powiększeniu. Zastosowanie optyki kontrastu interferencyjnego (DIC) pomaga w wizualizacji neuronów.
- Przy powiększeniu 0,5x użyj pipety o szerokim otworze (15 µm), aby usunąć nadległy mięsień i odsłonić rdzeń kręgowy. Podciśnienie jest wytwarzane za pomocą jednorazowej strzykawki 3 cc, a komórki mięśniowe są usuwane pojedynczo. Procedurę tę powtarza się dla 5 do 6 grzbietowych segmentów mięśni szkieletowych. Tą samą pipetą o szerokim otworze usuwa się również dwie górne warstwy mięśni brzusznych, aby uzyskać docelowe szybkie mięśnie szkieletowe.
- To kończy przygotowanie do rejestracji sparowanej; powiększenie mikroskopu zwiększa się do około 1,6x.
2. Rejestracje sparowane neuronów ruchowych CaP i komórek mięśni docelowych
- Oczyszczone segmenty są skanowane w celu zlokalizowania neuronów CaP. Każdy półsegment rdzenia kręgowego zawiera jeden duży neuron ruchowy CaP o średnicy 10 µm. To łezkowate ciało komórki znajduje się powierzchownie pod oponą twardą rdzenia, w pobliżu najbardziej kaudalnego końca granicy segmentu. Wybierany jest neuron CaP do rejestracji, a następnie skanowany jest docelowy mięsień brzuszny w sąsiednim segmencie kaudalnym w celu sprawdzenia jego integralności.
- Do rejestracji ustawiane są dwie elektrody typu patch, jedna dla neuronu i druga dla mięśnia. Górna elektroda ma łagodny stożek, umożliwiający penetrację twardej opony rdzenia, oraz otwór końcowy o średnicy około 2 µm. Dolna elektroda ma bardziej stromy stożek, przeznaczony do rejestracji w konfiguracji voltage clamp o niskiej rezystancji w mięśniach szkieletowych.
- Elektrodę do neuronu ustawia się pod kątem około 30 stopni, aby spenetrować oponę twardą rdzenia, około półsegmenta rostralnie względem wybranego neuronu CaP. Elektrodę posuwa się za pomocą manipulatora z napędem osiowym, przykładając delikatne, ciągłe nadciśnienie o wartości około 60 mmHg. W momencie przebicia opony twardej neuron CaP może zostać przesunięty przez perfuzję z elektrody, co wymaga ponownego ustawienia ostrości.
- Gdy elektroda dotknie ciała komórki neuronu CaP, nadciśnienie jest zwalniane, co zazwyczaj prowadzi do natychmiastowego utworzenia uszczelnienia gigaohmostowego (gigaohm seal). Jednak w niektórych przypadkach, gdy uszczelnienie nie powstaje, konieczne jest zastosowanie delikatnego podciśnienia. Po utworzeniu uszczelnienia potencjał elektrody jest ustawiany na -80 mV, a zastosowanie podciśnienia powoduje przerwanie błony komórkowej. Neuron CaP charakteryzuje się rezystancją wejściową od 140 do 180 MΩ oraz potencjałem czynnościowym, który przekracza +40 mV. Jest to sprawdzane poprzez wstrzykiwanie inkrementalnie zwiększających się skoków depolaryzacyjnych w konfiguracji current clamp, aż do wywołania potencjału czynnościowego.
- Następnie, przy użyciu zmotoryzowanego translatora X-Y i dużym powiększeniu, mikroskop zostaje przesunięty na mięsień brzuszny. Z wyznaczonego pola wybierana jest szybka komórka mięśniowa.
- Elektroda do mięśnia jest posuwana w kierunku docelowej komórki mięśniowej pod nadciśnieniem, które po zwolnieniu tworzy uszczelnienie gigaohmostowe. Potencjał elektrody jest ustawiany na -50 mV w celu inaktywacji kanałów sodowych, a następnie pod wpływem delikatnego ssania błona komórkowa zostaje przerwana. Spadek rezystancji do 100–200 MΩ oraz nagłe pojawienie się dużych przejściowych prądów pojemnościowych sygnalizują wejście do komórki.
- Aby przetestować rejestrację sparowaną, neuron ruchowy jest depolaryzowany poprzez inkrementalnie większe wstrzyknięcia prądu, aż do wywołania potencjału czynnościowego. W tym momencie w mięśniu powinien zostać wywołany prąd blaszki końcowej. Dalsza stymulacja neuronu ruchowego z częstotliwością 1 Hz skutkuje powtarzalnym występowaniem prądów blaszki końcowej. Po zwiększeniu częstotliwości stymulacji do 100 Hz amplituda prądów blaszki końcowej ulega wahaniom i dochodzi do ich funkcjonalnego wyczerpania w ciągu 10 sekund stymulacji.
3. Reprezentatywne wyniki
Zazwyczaj rejestracja z neuronu jest stabilna przez maksymalnie jedną godzinę, natomiast komórki mięśniowe ulegają degradacji, co objawia się wzrostem oporności szeregowej. W takim przypadku eksperyment zostaje przerwany lub poddaje się patch-clampowi inną komórkę mięśniową. Wszystkie pomiary powinny zostać zakończone w ciągu jednej godziny.
Rycina 1. Rejestracje potencjału czynnościowego neuronu ruchowego (AP, góra) oraz powiązanego z nim prądu blaszki końcowej mięśnia (EPC, dół). Potencjał czynnościowy neuronu CaP powinien przekroczyć +40 mV, a EPC powinien wzrosnąć w ciągu 300 μsec i zanikać zgodnie z przebiegiem wykładniczym ze stałą czasową poniżej 1 msec.
| Nazwa | Procedura przygotowania |
| Roztwór kąpieli (w mM) | 134 NaCl, 2,9 KCl, 2,1 CaCl2, 1,2 MgCl22, 10 glukozy, 10 Na-HEPES, pH 7,8 |
| Roztwór kąpielowy z trikainą | Roztwór kąpielowy zawierający 0,02% tricainy |
| Roztwór kąpieli z formamidem | Roztwór do kąpieli zawierający 2M formamid |
| Roztwór wewnętrzny neuronu (w mM) | 115 K-glukonianu, 15 KCl, 2 MgCl22, 10 mM HEPES-K, 5 mM EGTA-K, 4 mM Mg-ATP, pH 7,2 |
| Roztwór wewnętrzny mięśnia (w mM) | 120 KCl, 10 K-HEPES, 5 BAPTA, pH 7,4 |
Tabela 1. Roztwory.
Dyskusja
Stosujemy podwójne rejestracje u rybek zebrafish (Wen i Brehm, 2005) głównie w celu badania procesów uwalniania i recyklingu pęcherzyków podczas stymulacji o wysokiej częstotliwości. Proces ten jest zaburzony u mutantów ruchowych, u których prawidłowa transmisja synaptyczna jest upośledzona z powodu mutacji punktowych w kluczowych komponentach synaptycznych. Na przykład mutacje zakłócające agregaty receptorów postsynaptycznych (Ono et al., 2001, 2002, 2004) oraz syntezę przekaźnika presynaptycznego (Wang et al., 2008) skutkują nieskoordynowanym pływaniem. Podwójne rejestracje dostarczają informacji, które pozwalają precyzyjnie określić źródło defektu funkcjonalnego, łącząc w ten sposób zachowanie, genetykę i fizjologię. Obecnie możliwe powinno być dalsze analizowanie procesów leżących u podstaw transmisji synaptycznej za pomocą przejściowej ekspresji w neuronach ruchowych CaP przy użyciu odpowiednio dobranych promotorów. W ten sposób geny dominująco negatywne lub zmutowane mogą być specyficznie wyrażane w tych neuronach, co pozwala na określenie skutków zarówno behawioralnych, jak i elektrofizjologicznych. Dodatkową zaletą oferowaną przez konfigurację whole-cell jest możliwość dializy somy CaP za pomocą czynników, które mogą potencjalnie zmieniać recykling pęcherzyków, takich jak toksyny klostrydialne i bufory wapnia. Ze względu na krótką odległość między somą a mięśniem, dyfuzja powinna zachodzić w czasie mniejszym niż czas trwania rejestracji. Potencjał tej preparatyki został dopiero zaczęty być wykorzystany. Przezroczystość ryby w tym wieku oraz powierzchowne rozmieszczenie synaps ułatwiają również stosowanie narzędzi optycznych (Fetcho i O'Malley, 1997; Fetcho i Higashijima, 2004). Odnieśliśmy sukcesy w pomiarach endocytozy i egzocytozy u żywych ryb przy użyciu barwników FM i wskaźników genetycznych, takich jak Synaptophluorin (Li et al., 2003). Dodatkowo, toksyny sprzężone z fluorescencją mogą być używane do znakowania białek synaptycznych w celu obrazowania żywych ryb (Ibanez-Tallon et al., 2004). Biorąc pod uwagę prostotę tej preparatyki, daje ona duże nadzieje na przyszłe badania.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Finansowane przez NIH (NS-18205).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Tester przetwornika pneumatycznego | Fluke Biomedical | DPM1B | |
| Pręt wolframowy 0.002 x 3 inch | A-M Systems | 715000 | |
| Elastomer Sylgard 184 | Dow Corning | Grubość aplikacji wpłynie na optykę DIC |
Bibliografia
- Fetcho, J. R., O'Malley, D. Imaging neuronal networks in behaving animals. Current Opinion in Neurobiology. 7, 832-838 (1997).
- Fetcho, J. R., S, H. igashijima Optical and genetic approaches toward understanding neuronal circuits in zebrafish. Integr Comp Biol. 44, 57-70 (2004).
- Ibañez-Tallon, I., Wen, H., Miwa, J., Xing, J., Aslantas-Tekinay, A., Ono, F., Brehm, P., Heintz, N. Tethering naturally occurring peptide toxins for cell autonomous modulation of ion channels and receptors in vivo. Neuron. 43, 305-311 (2004).
- Li, W., Ono, F., Brehm, P. Optical measurements of presynaptic release in mutant zebrafish lacking postsynaptic receptors. J. Neuroscience. , 23-10467 (2003).
- Ono, F., Mandel, G., Brehm, P. Acetylcholine receptors direct rapsyn clusters to the neuromuscular synapse in zebrafish. J. Neuroscience. 24, 475-5481 (2004).
- Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Fetcho, J., Mandel, G., Brehm, P. Paralytic zebrafish lacking ACh receptors fail to localize rapsyn clusters to the synapse. J. Neuroscience. 21, 5439-5448 (2001).
- Ono, F., Shcherbatko, A., Higashijima, S., Mandel, G., Brehm, P. The zebrafish motility mutant twitch once reveals new roles for rapsyn in synaptic function. J. Neuroscience. 22, 6491-6498 (2002).
- Wang, M., Wen, H., Brehm, P. Function of neuromuscular synapses in the zebrafish choline-acetyltransferase mutant bajan. J Neurophysiol. , 100-104 (2008).
- Wen, H., Brehm, P. Paired motor-neuron muscle recordings in zebrafish test the receptor blockade model for shaping synaptic current. J. Neuroscience. 25, 8104-8111 (2005).
Przedruki i uprawnienia
Tagi
Rejestracja neuronów ruchowychrejestracja mięśni szkieletowychpłytka nerwowo-mięśniowa u danio pręgowanegoidentyfikacja neuronów ruchowych CaPelektrofizjologiczna metoda clampowania napięcia całej komórkianaliza transmisji synaptycznejkontrast interferencyjny różnicowyzmotoryzowany stolik przesuwny XYpreparaty larw danio pręgowanego
