Peptydy z biblioteki phage display modulują ekspresję genów w komórkach mezenchymalnych i potęgują osteogenezę w jedokortykalnych defektach kostnych

Podsumowanie

W celu zidentyfikowania sekwencji peptydowych celujących w kość wykorzystano bibliotekę displayu fagowego. Celem badania było sprawdzenie wpływu tych peptydów na różnicowanie komórek mezenchymalnych oraz określenie ich oddziaływania na regenerację kości.

Streszczenie

Dwa nowe syntetyczne peptydy przyspieszają tworzenie kości i mogą być dostarczane przy użyciu macierzy kolagenowej. Celem niniejszego badania było zbadanie efektów naprawy kości w modelu defektu jednokortykalnego. Leczenie komórek mezenchymalnych spowodowało wzrost aktywności fosfatazy alkalicznej, wywołało tworzenie guzków przez komórki oraz zwiększyło ekspresję genów runx2, osterix, sialoproteiny kostnej i osteokalcyny. Gąbka kolagenowa nasączona peptydem promowała naprawę defektów kostnych, podczas gdy grupa kontrolna była mniej skuteczna. Wyniki tego badania wykazały, że komórki mezenchymalne traktowane peptydem in vitro różnicują się w kierunku osteogenezy, a peptydy dostarczone in vivo przy użyciu gąbki kolagenowej promują naprawę defektów jednokortykalnych.

Protokół

1. Biopanning in vivo w celu izolacji fagów celujących w kości długie

Przeprowadzono sekwencjonowanie DNA faga, a następnie zsyntetyzowano peptydy o odpowiadającej mu sekwencji. Peptydy zsyntetyzowano z linkerem gly-gly-gly-ser-lizyna (linker jest niezbędny do sprzężenia fluorescencyjnych chromoforów, które pomagają w śledzeniu/wykrywaniu peptydów).

1. 10-tygodniową mysz szczepu Balb/c zanieczulono i odsłonięto serce.
2. Do biopanningu in vivo wykorzystano zestaw biblioteki peptydów do ekspozycji fagowej Ph.D-12 (New England Biolabs, Beverly, MA), w stężeniu 10 x 1010 pfu, który wstrzyknięto do serca.
3. Po około 5 minutach mysz uśmiercono. Odsłonięto i wypreparowano kości udowe, odcięto końce kości udowych i usunięto szpik kostny.
4. Wnętrze i zewnętrzną stronę lewej kości udowej przemyto 10 razy PBS, a następnie kość udową dodano do bakterii ER2537 (określone jako fagi nieeluowane, przejść do kroku 6).
5. Kanał szpikowy prawej kości udowej przemyto dziesięciokrotnie strzykawką z igłą 21G roztworem 2% odtłuszczonego mleka w proszku, aby usunąć fagi niezwiązane. Fagi związane eluowano z kanału szpikowego buforem HCl-glicyna o pH 2.2, zneutralizowano 1M Tris, dodano do bakterii ER2537 i inkubowano przez 4,5 godziny w celu amplifikacji fagów (określone jako eluowane).
6. Bakterie usunięto poprzez sedymentację w wirówce przez 10 min w 4°C, a fagi wytrącono przez noc w 4°C po dodaniu roztworu PEG/NaCl. Fagi zebrano przez wirowanie, zawieszono i wytrącono dwukrotnie poprzez dodanie 1/6 objętości PEG/NaCl. Końcowy osad zawieszono ponownie w TBS z 0,02% NaN3.
7. Amplifikowane eluaty pochodzące zarówno z fagów eluowanych, jak i nieeluwanych, wstrzyknięto oddzielnym myszom, a fagi wyizolowano w opisany wyżej sposób. Z myszy, której wstrzyknięto fagi nieeluwane, usunięto tylko lewą kość udową i umieszczono ją bezpośrednio w bakteriach (patrz krok 4 powyżej). Z myszy z fagami eluowanymi fagi izolowano tylko z prawej kości udowej, a następnie uwalniano je za pomocą buforu HCl-glicyna przed dodaniem do bakterii (patrz krok 5 powyżej).
8. Tę procedurę biopanningu in vivo powtórzono trzy razy przed sekwencjonowaniem DNA z użyciem primera -98 (dołączonego do zestawu do ekspozycji fagowej).
9. Zupołowone fagi namnożono w kulturach bakteryjnych, oczyszczono, oznaczono ilościowo, a następnie wstrzyknięto czwartej myszy. Powtórzono sekwencjonowanie.
10. Aby wykazać swoistość peptydów względem kości i szpiku, przeanalizowano fagi eluowane z nerek i wątroby zgodnie z powyższym opisem. We wszystkich czterech rundach w organach tych znajdowała się niewielka ilość fagów (mniej niż 10%).
11. Peptydy o sekwencji gly-gly-gly-ser-lys zsyntetyzowano z biotyną oraz bez niej, aby wykorzystać je do barwienia komórek i tkanek, a także do prac in vivo.

2. Hodowla komórek mezenchymalnych do eksperymentów nad różnicowaniem osteogennym komórek

1. Do eksperymentów in vitro wykorzystano sklonowaną linię pluripotencjalnych komórek szpiku kostnego myszy (D1) wyizolowaną w naszym laboratorium¹. Komórki hodowano w modyfikowanej przez Dulbecco podłożu DMEM o niskiej zawartości glukozy (Gibco kat#11885-084) uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej (Gibco kat# 16000-044), 50 mg askorbinianu sodu na ml (Sigma kat# A7631) oraz 100 U/mL penicyliny G i 100 mg/mL streptomycyny (Gibco kat# 15140-122).
2. Hodowle utrzymywano w temperaturze 37°C w inkubatorach z płaszczem wodnym w nawilżonej atmosferze zawierającej 5% CO₂ i pasażowano, gdy komórki osiągnęły około 90% konfluencji.
3. Komórki poddano trypsynizacji, odwirowano w celu otrzymania osadu, policzono i wysiano w stężeniu 5x10³ komórek/cm² do naczyń plastikowych przeznaczonych do hodowli tkankowych.

3. Barwienie peptydowe hodowli komórkowych i tkanek

1. Komórki D1 lub komórki szpiku kostnego wysiano na szkiełka z komorami powleczonymi fibronektyną lub żelatyną, zawierające DMEM i 10% płodowej surowicy bydlęcej, na 24 godziny.
2. Komórki przemyto PBS. Komórki/tkanki utrwalono w 4% paraformaldehydzie przez 30 minut.
3. Nadmiar aldehydów zablokowano za pomocą 0,5 M glicyny (pH 7,5) przez 10 minut.
4. Endogenne receptory awidyny i biotyny na powierzchni komórek zablokowano poprzez dodanie 5% roztworu blokującego BSA+Awidyna na 1 godzinę, przepłukano raz PBS przez 5 minut, a następnie zablokowano 5% roztworem blokującym BSA+Biotyna na 1 godzinę.
5. Następnie do komór dodano 100 μM biotynilowanych peptydów L7 i R1 na 30 minut.
6. Komórki przemyto trzy razy PBS po 5 minut każde, a następnie dodano rozcieńczenie 1:1000 Alexa Flour Streptavidin i inkubowano w ciemności przez 30 minut.
7. Komórki przemyto, a szkiełka okrywowe zamontowano przy użyciu medium montażowego Vectashield i poddano analizie pod mikroskopem fluorescencyjnym.

4. Analiza aktywności fosfatazy alkalicznej

1. Kolorymetryczny pomiar aktywności fosfatazy alkalicznej przeprowadzono na monowarstwach z wykorzystaniem zestawu do oznaczania fosfatazy alkalicznej (BioRad) zgodnie z zaleceniami producenta.
2. Komórki D1 wysiano z gęstością 5 x 10³ komórek/cm² na 6-dołkowe płytki hodowlane i poddano działaniu peptydu R1; aktywność ALP oznaczano w dniach 4, 8, 12, 16 i 20.
3. W celu przygotowania lizatów komórkowych warstwy komórek przemyto trzykrotnie buforem PBS, a następnie zebrano do PBS poprzez zeskrobanie, po czym przeprowadzono sonikację i wirowanie w celu usunięcia resztek komórkowych.
4. Równe objętości lizatu (100 μL) wymieszano z 100 μL świeżo przygotowanego substratu kolorymetrycznego, fosforanu para-nitrofenylowego, i inkubowano w temperaturze 37°C przez 30 minut.
5. Reakcję enzymatyczną zatrzymano poprzez dodanie 100 μL 0,2 N roztworu NaOH. Aktywność ALP mierzono przy 405 nm za pomocą czytnika ELISA (Bio-Rad).
6. Stężenie białka w lizatach komórkowych oznaczono za pomocą zestawu BioRad Protein Assay Kit, a następnie aktywność AP wyrażono jako ilość wytworzonego para-nitrofenolu w nmol/min/mg białka.
7. Aktywność ALP obliczono zgodnie ze specyfikacją producenta (Sigma, Inc.).
8. Jednostki aktywności ALP znormalizowano do miligramów całkowitej zawartości białka w lizacie komórkowym przy użyciu metody BCA (Pierce, Rockford, IL).

5. Różnicowanie komórek mezenchymalnych z użyciem L7 i R1

1. Subkonfluente komórki mezenchymalne (D1) hodowano do osiągnięcia około 90% konfluencji, a następnie traktowano 5nM peptydem L7 i R1.
2. Komórki zbierano po 0,5, 2, 6, 24 i 48 h, a RNA wyizolowano za pomocą zestawu Qiagen RNeasy zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Reakcje odwrotnej transkrypcji (RT) przeprowadzano etap hybrydyzacji (37°C, 10 minut), po którym następowała synteza pierwszej nici cDNA (42°C, 30 minut) oraz inaktywacja termiczna (95°C przez 5 minut). Otrzymane cDNA przechowywano w zamrożeniu (-70°C) do czasu analizy metodą real-time PCR.
4. Reakcję Real Time PCR przeprowadzono z użyciem zestawu QuantiTect SYBR Green PCR (Qiagen). Reakcje przeprowadzano z użyciem 25 μL master mixu z zestawu SYBR Green oraz starterów forward i reverse (300 nmol/L) dla genów specyficznych dla kości, np. Runx2, Osterix, Osteocalcin, Bone sialoprotein, a także genów szlaku wnt, takich jak b-catenin, LRP6, Wnt 5a, 7b, 10b, DKK1 oraz OPG i RANKL (patrz Tabela 1).
5. Do końcowej mieszaniny reakcyjnej dodawano 3 μL nieusuwionego cDNA z reakcji RT. Format real-time PCR w płytce 96-dołkowej obejmował sześciostopniowe rozcieńczenia 10-krotne w dubletach standardów plazmidowego DNA. Dołki płytki uszczelniono optycznymi pokrywami adhezyjnymi (BioRad) i wirowano z niską prędkością (300 g, 5 minut), aby zapewnić całkowite wymieszanie.
6. Każdą próbkę analizowano co najmniej w dubletach przy użyciu instrumentu iCycler (BioRad Laboratories, Hercules, CA).
7. Zastosowane protokoły PCR obejmowały aktywację polimerazy DNA AmpliTaq Gold, a następnie 40 cykli denaturacji w 94°C przez 30 sekund, odpowiedniej temperatury hybrydyzacji przez 30 sekund oraz elongacji w 72°C przez 30 sekund. Liczbę cykli progowych (CT) PCR dla każdej próbki obliczano w punkcie, w którym fluorescencja przekroczyła limit progowy. Limit progowy ustalono wzdłuż liniowej fazy logarytmicznej krzywych fluorescencji na poziomie od 10 do 20 odchyleń standardowych (SDs) powyżej średniej fluorescencji tła. Równania krzywej standardowej obliczono za pomocą analizy regresji średniego CT względem log10 cDNA w stosunku do całkowitej ilości obecnego RNA. Względną ekspresję genów docelowych normalizowano względem 18S dla genów specyficznych dla kości, natomiast dla genów szlaku Wnt wykorzystano b-actin.

6. Przygotowanie kompozytu Gelfoam in vivo

1. Z zachowaniem zasad aseptyki, przy użyciu autorskiego narzędzia, przygotowano cylindry z gąbki żelatynowej (gelfoam, Pharmacia & Upjohn kat# 09-0353-01) o średnicy 3 mm i długości 8 mm.
2. Na dwadzieścia cztery godziny przed operacją cylindry z gąbki żelatynowej nasączono peptydem L7 lub R1 (20 μM w PBS) bądź samym buforem PBS bez peptydu. Cylindry z gąbki żelatynowej przeniesiono do sterylnych 12-dołkowych płytek hodowlanych i przechowywano przez noc w temperaturze -4°C.
3. W dniu operacji kompozyty z gąbki żelatynowej w płytkach hodowlanych wyjęto z lodówki i przechowywano w lodzie do momentu rozpoczęcia zabiegu.

7. Defekty kostne

1. Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Systemu Zdrowia Uniwersytetu Wirginijskiego przed ich przeprowadzeniem. Dziesięć dziewięciomiesięcznych dorosłych syngenicznych samców szczurów szczepu Fischer 344 (350-400 g) zanieściło się doglebowo mieszaniną ketaminy (50 g na gram masy ciała) i ksylazyny (5 g na gram masy ciała).
2. Zastosowano obustronne podejście chirurgiczne do przednio-przyśrodkowej części kości piszczelowej. Szczury w tym wieku lub starsze wykazują nieistotne wzrosty pola przekroju poprzecznego, powierzchni kości korowej, masy kostnej, gęstości kości oraz długości osiowej przednio-przyśrodkowej części kości piszczelowej. Za pomocą pneumatycznego wiertła (Hall High Speed Drill; Zimmer) przy irygacji solą fizjologiczną wykonano duży, podłużny defekt jednokortykalny o wymiarach 3 mm szerokości i 8 mm długości.
3. Defekt kostny leczono gąbką żelatynową (gelfoam) z dodatkiem peptydów lub bez nich. Wszystkie wszczepione rusztowania o wymiarach 3 mm szerokości, 8 mm długości i 1,5 mm głębokości wprowadzono poprzez delikatne wbijanie. Po operacji nie stosowano zewnętrznych ani wewnętrznych urządzeń do stabilizacji kończyny, a zwierzętom pozwolono na swobodne poruszanie się bezpośrednio po zabiegu.

8. Histologia i morfometria

Regenerację kości oceniono na podstawie morfologii makroskopowej oraz wykonanych obrazów cyfrowych.

1. Szczury zostały poddane eutanazji, a kości piszczelowe pobrano w 3., 5. i 12. tygodniu w celu określenia ilości nowo powstałej tkanki kostnej w odpowiedzi na uraz.
2. Po dokładnym sprawdzeniu defektu kostnego pobrane piszczele utrwalono w 10% neutralnym buforowanym formalinie, odwapniono w odwapniaczu RDO rapid decalcifier przez 72 godziny, a następnie poddano rutynowej obróbce, zatopiono w parafinie i wykonano przekroje podłużne.
3. Regenerację kości oceniano za pomocą badania makroskopowego oraz mikroskopii świetlnej.
4. W każdej grupie (tj. pusty defekt, sama gąbka żelatynowa oraz gąbka żelatynowa z peptydem R1) wykorzystano dziesięć zwierząt. Jednokortykalny defekt o szerokości 8 mm reprezentowano na ok. 40 przekrojach tkankowych o grubości 8 μm każdy. Z tych 40 przekrojów wykorzystano minimum 6 do ilościowej oceny nowo powstałej tkanki kostnej.
5. Wszystkie przekroje tkankowe zabarwiono hematoksyliną i eozyną (H&E), które barwią macierz osteoidową.
6. Wszystkie preparaty oceniono mikroskopowo.

9. Naprawa kości

Przegląd

Naprawa kości jest ewidentnie bardzo ważnym obszarem rozważań w dziedzinie regeneracji tkanek mięśniowo-szkieletowych. Peptydy celujące w kości mogą mieć istotne zastosowanie w praktyce chirurgii ortopedycznej, szczególnie w przypadku stosowania protez, które mogą pozostawać w organizmie przez lata, a nawet dziesięciolecia. Biomimetyczne właściwości czynników kostnotropowych mogłyby stanowić krok technologiczny naprzód w dziedzinie inżynierii tkankowej, a także w chirurgii protezowania kości. Włączenie czynników celujących w kości do polimerów syntetycznych lub naturalnych może wspomóc specyficzność adhezji komórek, co pozwoli na wychwytywanie endogennych komórek w tkankach podlegających naprawie i regeneracji. Dodatkowym celem było ustalenie, czy nasze unikalne peptydy celujące w kości, zidentyfikowane metodą biopanningu in vivo biblioteki fagowej, wiążą się z komórkami izolowanymi z kości i szpiku kostnego oraz mają potencjał do modulowania osteogenezy in vitro i regeneracji kości in vivo.

W naszych eksperymentach wprowadzaliśmy peptydy do ubytków kości udowej u szczurów z wykorzystaniem naturalnych i syntetycznych macierzy polimerowych, a regenerację kości badaliśmy za pomocą histologii, biochemii, ekspresji genów, mikro-CT oraz biomechaniki, aby wyjaśnić szczegóły aktywności peptydów w procesie regeneracji kości. Dalszy rozwój tego podejścia może prowadzić do odkrycia i opracowania biologicznie czynnych związków ukierunkowanych na tkankę kostną, które wzmacniają naprawę poprzez mechanizmy dobrze scharakteryzowane biologicznie na poziomie komórkowym i molekularnym.

Barwienie

Peptydy zsyntetyzowano z etykietami biotyny w celu określenia wiązania i lokalizacji w komórkach mezenchymalnych. Do mikroskopowej lokalizacji wiązania peptydów w komórkach hodowanych in vitro zastosowano awidynę znakowaną izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC). Peptydy wiążą się z komórkami mezenchymalnymi w kulturze, a także z kością i szpikiem w przekrojach tkanki żeber mysich in vitro (Rycina 1).

Barwienie metodą Von Kossa

Komórkę mezenchymalną (D1) wyizolowano z szpiku kostnego i wykorzystano do określenia osteogennego wpływu peptydów na komórki in vitro. Komórki poddano działaniu peptydów L7 i R1, aby zbadać zmiany w morfologii komórek i ekspresji genów. W 4. dniu komórki zaczęły tworzyć agregaty, które z czasem powiększały się, tworząc guzki, co jest wzorcem zachowania komórek podobnym do komórek kostnych w hodowli ( Rycina 2 ).

Dodanie peptydów L7 lub R1 do komórek nasiliło barwienie kultur metodą von Kossa. Następnie komórki traktowano różnymi stężeniami peptydów L7 lub R1 przez okres do 16 dni hodowli. Ustalono, że stężenie 5 nM peptydów było najskuteczniejsze in vitro. Aktywność fosfatazy alkalicznej w kulturach traktowanych peptydami wzrosła od 2 do 3,5 raza. Stopień wzrostu zależał od stężenia peptydów oraz czasu trwania inkubacji w kulturze.

PCR w czasie rzeczywistym

Komórki traktowane peptydami L7 i R1 analizowano za pomocą Real-Time PCR pod kątem ekspresji genów dwóch znanych czynników transkrypcyjnych komórek kostnych (Osterix i Runx2) oraz trzech białek macierzy kostnej (sjaloproteiny kostnej, osteokalcyny i kolagenu typu I). Traktowanie peptydem R1 spowodowało wzrost ekspresji genów Osterix i Runx2. Ekspresja genu kolagenu typu I pozostała bez zmian. Traktowanie peptydem L7 wykazało wzrost ekspresji genów BSP i osteokalcyny, a także ekspresję genu kolagenu typu I. Dowodzi to, że oba peptydy wpływają na geny związane z początkiem i przebiegiem osteogenezy w kulturach komórek mezenchymalnych.

Opracowanie metod traktowania kultur komórkowych in vitro peptydami R1 i L7 wykazało efekt anaboliczny związany z kostnieniem z wykorzystaniem komórek mezenchymalnych. Wzrost stosunku osteoprotegeryny do RANKL wskazuje na zmniejszenie rekrutacji komórek resorpcji kości, znanych jako osteoklasty. Traktowanie komórek peptydami prowadzi również do zwiększenia ekspresji genów związanych z tworzeniem kości oraz do zmniejszenia poziomu czynników hamujących osteogenezę.

Histologia

Aby określić ilość tkanki kostnej, poddano plasterki kości działaniu μLtraświatło fioletowym, co wywołuje autofluorescencję. Zapewnia to większy kontrast pomiędzy tkanką kostną a niekostną w celu przeprowadzenia analizy ilościowej ²Przekroje sfotografowano z wykorzystaniem światła w polu jasnym oraz światła UV (Rycina 3) za pomocą mikroskopu Nikon i światła UV przy użyciu systemu obrazowania cyfrowego Nikon przy tym samym powiększeniu (obiektyw x10). Uzyskane obrazy cyfrowe przeanalizowano za pomocą oprogramowania do obrazowania Metavue (Molecular Devices). Wybrano stały, prostokątny obszar zainteresowania (ROI), który obejmował 8 mm jednowarstwowy ubytek kory. Miejsce urazu było zawsze reprezentowane wewnątrz tego ROI poprzez ręczne umieszczenie ramki w odpowiedniej pozycji na każdym obrazie. H&Wykrywanie pikseli dodatnich pod kątem E zostało częściowo zautomatyzowane przy użyciu narzędzia magiczna różdżka z ustawioną tolerancją kolorów. To ustawienie tolerancji pozwoliło na zaznaczenie pikseli w zakresie zieleni, który odpowiadał dokładnie obrazowi histologicznemu tkanki kostnej w H&Przekroje barwione H&E. Całkowita liczba H&Zarejestrowano liczbę pikseli dodatnich pod względem ekspresji E dla każdego przekroju. Liczbę pikseli z poszczególnych przekrojów uśredniono dla każdej próbki kości piszczelowej, a następnie na podstawie tych średnich obliczono różnice w obrębie i pomiędzy grupami badawczymi. Następnie porównano powierzchnie wszystkich próbek w oparciu o ilość nowo powstałej kości korowej ( Rycina 4 ).

Ilość kości w przekrojach została zmierzona ilościowo, aby określić stopień naprawy kości w ubytkach leczonych gąbką gelfoam z dodatkiem peptydu w porównaniu do grupy leczonej samą gąbką gelfoam. Ubytki wypełnione gąbką gelfoam z peptydem R1 wykazały największy stopień naprawy kości korowej, z odpowiednio 10-, 7- i 2-krotnym wzrostem w 3., 5. i 12. tygodniu. Różnice w naprawie kości korowej w grupie gelfoam+peptyd w porównaniu do grupy gelfoam były najbardziej zauważalne w 3. i 5. tygodniu, co dowodzi, że peptyd wspomaga regenerację kości korowej ( Rysunek 5 ).

10. Efekt anaboliczny peptydów osteogennych

Stosunek OPG/RANKL jest większy niż stosunek RANKL/OPG, co sugeruje, że peptydy mogą mieć bezpośredni wpływ na osteoblasty i regulować resorpcję kości.

Peptydy syntetyczne mogą posiadać przewagi nad większymi cząsteczkami, takie jak szybkość przygotowania, stabilność molekularna, długi okres trwałości oraz potencjalne zastosowania terapeutyczne. Znaczne postępy poczyniono w próbach modulowania utraty i regeneracji kości poprzez kontrolowanie cytokin i czynników wzrostu. Peptydy osteotropowe te mogą stanowić atrakcyjną alternatywę dla istniejących terapii stymulujących anabolizm i regenerację kości.

Rysunek 1. Wiązanie peptydu do szpiku i kości w przekroju tkanki żebra myszy in vitro.

Rycina 2. Komórki mezenchymalne (D1) tworzą guzki po traktowaniu peptydami.

Rysunek 3. Histologia naprawy kości z wykorzystaniem peptydów osteogennych L7 i R1.

Rycina 4. Przekroje kostne barwione H & E w świetle UV, które powoduje autofluorescencję. Zapewnia to większy kontrast między tkanką kostną a niekostną na potrzeby analizy ilościowej.

Rycina 5. Ilościowa ocena tkanki kostnej w przekrojach histologicznych wykazała, że największy stopień regeneracji kory kostnej wystąpił w 5. tygodniu (zmiana 10-krotna), natomiast w 3. i 12. tygodniu zmiana wynosiła odpowiednio 7- i 2-krotnie, co dowodzi, że peptyd wspomaga regenerację kory kostnej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do tworzenia bibliotek peptydów metodą phage display-Ph.D-12	New England Biolabs	E8110S