Peptydy z biblioteki wyświetlania fagów modulują ekspresję genów w komórkach mezenchymalnych i nasilają osteogenezę w jednokorowych ubytkach kości

Summary

Biblioteka wyświetlania fagów została użyta do identyfikacji sekwencji peptydowych, które celują w kość. Celem było zbadanie wpływu tych peptydów na różnicowanie komórek mezenchymalnych oraz określenie ich wpływu na regenerację kości.

Abstract

Dwa nowe syntetyczne peptydy przyspieszają tworzenie kości i mogą być dostarczane za pomocą matrycy kolagenowej. Celem pracy było zbadanie wpływu na naprawę kości w modelu ubytku kory mózgowej. Leczenie komórek mezenchymalnych spowodowało wzrost aktywności fosfatazy alkalicznej, wykazało tworzenie się guzków przez komórki i zwiększyło ekspresję genów runx2, osterix, sialoproteiny kostnej i osteokalcyny. Gąbka kolagenowa nasączona peptydem wspomagała naprawę ubytków kostnych, podczas gdy kontrola była mniej skuteczna. Wyniki tego badania wykazały, że komórki mezenchymalne traktowane peptydem in vitro różnicują się w kierunku osteogenezy, a peptydy dostarczane in vivo za pomocą gąbki kolagenowej sprzyjają naprawie ubytków kory mózgowej.

Protocol

1. Biopanowanie in vivo w celu wyizolowania fagów, które atakują kości długie

DNA faga zostało zsekwencjonowane i zsyntetyzowane zostały peptydy o odpowiedniej sekwencji. Peptydy zsyntetyzowano z łącznikiem gly-gly-gly-ser-lizyny (łącznik jest potrzebny do sprzężenia fluorescencyjnych chromoforów, które pomagają śledzić/śledzić peptydy).

1. 10-tygodniową mysz Balb/c znieczulono się, odsłonięto serce.
2. Zestaw biblioteki peptydów Ph.D-12 Ph.D-12 Ph.D-12 (New England Biolabs, Beverly, MA) został użyty do biopanningu in vivo, 10 x 1010 pfu i wstrzyknięty do serca.
3. Po około 5 minutach mysz została poddana eutanazji. Kości udowe zostały odsłonięte i wypreparowane, końce kości udowych zostały odcięte, a szpik kostny usunięty.
4. Wewnętrzną i zewnętrzną stronę lewej kości udowej przepłukano 10 razy PBS, a kość udową dodano do bakterii ER2537 (określanych jako nieeluowany, przejdź do kroku 6).
5. Kanał śródszpikowy prawej kości udowej przepłukano dziesięciokrotnie 2% schmielonym mlekiem odtłuszczonym w strzykawce z igłą o rozmiarze 21 w celu usunięcia niezwiązanego faga. Związany eluowano z kanału śródszpikowego buforem HCl-glicyny o pH 2,2, neutralizowano 1M Tris, dodawano do bakterii ER2537 i hodowano przez 4,5 godziny w celu amplifikacji faga (określanego jako eluowany).
6. Bakterie usunięto przez sedymentację odśrodkową przez 10 minut w temperaturze 4°C, a fagi wytrącono przez noc w temperaturze 4°C przez dodanie roztworu PEG/NaCl. zebrano przez odwirowanie, a następnie zawieszono i dwukrotnie wytrącono przez dodanie 1/6 objętości PEG/NaCl. Ostatni granulat został ponownie zawieszony w TBS z 0,02% NaN3.
7. Amplifikowane eluaty zarówno z eluowanego, jak i nieeluowanego faga wstrzyknięto oddzielnym myszom, a izolowano jak powyżej. Tylko lewa kość udowa została usunięta z myszy, której wstrzyknięto nieeluowany, a kość udową umieszczono bezpośrednio w bakterii (patrz krok 4 powyżej). Zdeluzowaną mysz fagową wyizolowano tylko z prawej kości udowej, a uwolniono przez bufor HCl-glicyny przed dodaniem do bakterii (patrz krok 5 powyżej).
8. Ta procedura biopanowania in vivo została powtórzona trzy razy przed sekwencjonowaniem DNA przy użyciu startera-98 (dostarczonego z zestawem do wyświetlania fagów).
9. Połączone fagi amplifikowano w kulturach bakteryjnych, oczyszczono, oznaczono ilościowo, a następnie wstrzyknięto czwartej myszy. Sekwencjonowanie powtórzono.
10. Aby wykazać specyficzność peptydową dla kości i szpiku, przeanalizowano fagi eluowane z nerki i wątroby, jak opisano powyżej. We wszystkich czterech rundach stwierdzono niewielką ilość faga zlokalizowanego w tych narządach (mniej niż 10%).
11. Peptydy zsyntetyzowano z sekwencją gly-gly-gly-ser-lys, z biotyną i bez biotyny, która miała być stosowana do barwienia komórek i tkanek, a także do pracy in vivo.

2. Mezenchymalna hodowla komórek do eksperymentów z różnicowaniem komórek osteogennych

1. Sklonowana mysia linia komórkowa pluripotencjalnego zrębu szpiku kostnego (D1) wyizolowana w naszym laboratorium¹ została wykorzystana do eksperymentów in vitro. Komórki hodowano w zmodyfikowanym pożywce eterycznej Dulbecco, DMEM, o niskiej zawartości glukozy (Gibco cat#11885-084) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (Gibco cat# 16000-044), pięćdziesięcioma miligramami askorbinianu sodu na mililitr (Sigma cat # A7631) oraz 100 U / ml penicyliny G i 100 mg / ml streptomycyny (Gibco cat # 15140-122).
2. Hodowle utrzymywano w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze inkubatorów z płaszczem wodnym o stężeniu 5% CO_{2 i} hodowano do momentu, gdy komórki były zlewane w około 90%.
3. Komórki trypsynowano, odwirowano do granulek, policzono i wysiano w stężeniu 5x10³ komórki/^cm2 w tworzywach sztucznych poddanych działaniu kultur tkankowych.

3. Barwienie peptydów w hodowanych komórkach i tkankach

1. Komórki D1 lub szpiku kostnego posiewano na szkiełkach komorowych pokrytych fibronektyną lub żelatyną, zawierających DMEM i 10% płodową surowicę bydlęcą przez 24 godziny.
2. Komórki przemyto PBS. Komórki/tkanki utrwalano 4% paraformaldehydem przez 30 minut
3. Nadmiar aldehydu zablokowano za pomocą 0,5 M glicyny (pH 7,5) przez 10 minut.
4. Endogenne receptory awidyny i biotyny na powierzchni komórki blokowano przez dodanie 5% roztworu blokującego BSA + Awidyna przez 1 godzinę, płukano raz PBS przez 5 minut, a następnie blokowano 5% roztworem blokującym BSA + biotynę przez 1 godzinę.
5. Następnie 100 μM biotynylowane peptydy L7 i R1 dodawano do studzienek na 30 minut.
6. Komórki przemywano trzykrotnie PBS przez 5 minut każda, a następnie dodano streptawidynę w rozcieńczeniu 1:1000 z mąki Alexa i inkubowano w ciemności przez 30 minut.
7. Komórki przemyto, a szkiełka nakrywkowe osadzono za pomocą podłoża montażowego vectashield i zbadano pod mikroskopem fluorescencyjnym.

4. Test aktywności fosfatazy alkalicznej

1. Test kolorymetryczny fosfatazy alkalicznej przeprowadzono na monowarstwach przy użyciu zestawu fosfatazy alkalicznej (BioRad) zgodnie z zaleceniami producenta.
2. Komórki D1 posiano z gęstością 5 x 10³ komórki/^cm2 na 6-dołkowych płytkach hodowlanych i potraktowano peptydem R1, aktywność ALP określono ilościowo w dniach 4, 8, 12, 16 i 20.
3. Aby przygotować lizaty komórkowe, warstwy komórek przemyto trzykrotnie buforem PBS, a następnie zeskrobano do PBS, a następnie poddano sonikacji i odwirowaniu w celu usunięcia resztek komórkowych.
4. Równe objętości lizatu (100 μl) zmieszano następnie ze 100 μl świeżo przygotowanego substratu kolorymetrycznego fosforanu para-nitrofenylowego i inkubowano w temperaturze 37°C przez 30 minut.
5. Reakcję enzymatyczną zatrzymano przez dodanie 100 μL 0,2 N roztworów NaOH. Aktywność ALP mierzono przy długości fali 405 nm za pomocą czytnika ELISA (Bio-Rad).
6. Stężenie białek w lizatach komórkowych mierzono za pomocą zestawu do oznaczania białek BioRad, a następnie aktywność AP wyrażono jako para-nitrofenol wytwarzany w nmol/min/mg białka.
7. Aktywność ALP została obliczona zgodnie ze specyfikacją producenta (Sigma, Inc.).
8. Jednostki aktywności ALP znormalizowano do miligram całkowitej zawartości białka za pomocą testu BCA (Pierce, Rockford, IL) lizatu komórkowego.

5. Różnicowanie komórek mezenchymalnych za pomocą L7 i R1

1. Subkonfluentne komórki mezenchymalne (D1) wyhodowano do około 90% konfluencji i potraktowano peptydem 5nM L7 i R1.
2. Komórki zebrano po 0,5, 2, 6, 24 i 48 godzinach, a RNA przygotowano przy użyciu zestawu Qiagen RNeasy zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Reakcje odwrotnej transkryptazy (RT) wyżarzano (37°C, 10 minut), a następnie następowała synteza pierwszej nici cDNA (42°C, 30 minut) i inaktywacja termiczna (95°C przez 5 minut). Otrzymany cDNA przechowywano w stanie zamrożonym (-70°C) do czasu oznaczenia metodą PCR w czasie rzeczywistym.
4. Test Real Time PCR przeprowadzono przy użyciu zestawu QuantiTect SYBR Green PCR (Qiagen). Reakcje przeprowadzono z użyciem 25 μl mieszanki głównej SYBR Green kit oraz starterów do przodu i do tyłu (300 nmol/L) genów specyficznych dla kości, np. Runx2, Osterix, Osteokalcyna, sialoproteina kostna i geny szlaku wnt, takie jak b-katenina, LRP6, Wnt 5a, 7b, 10b, DKK1 oraz OPG i RANKL (patrz tabela 1).
5. 3 μl próbki cDNA dodano do końcowej mieszaniny reakcyjnej nierozcieńczonej z reakcji RT. 96-dołkowy format PCR w czasie rzeczywistym zawierał sześć 10-krotnych rozcieńczeń w duplikatach wzorców plazmidowego DNA. Studzienki płytki uszczelniono optycznymi osłonami z kleju (BioRad) i odwirowano z niską prędkością (300 g, 5 minut), aby zapewnić całkowite wymieszanie.
6. Każda próbka została przeanalizowana co najmniej dwukrotnie za pomocą urządzenia iCycler (BioRad Laboratories, Hercules, CA).
7. Zastosowane protokoły PCR obejmowały aktywację polimerazy DNA AmpliTaq Gold, a następnie 40 cykli denaturacji w temperaturze 94°C przez 30 sekund, odpowiednią temperaturę wyżarzania przez 30 sekund i przedłużenie w temperaturze 72°C przez 30 sekund. Numer progowy cyklu PCR (CT) dla każdej próbki obliczono w punkcie, w którym fluorescencja przekroczyła limit progowy. Granicę progową ustalono wzdłuż liniowej fazy logarytmicznej krzywych fluorescencji na poziomie od 10 do 20 odchyleń standardowych (SD) powyżej średniej fluorescencji tła. Równania krzywej standardowej obliczono za pomocą analizy regresji średniej CT w funkcji log10 cDNA w stosunku do całkowitego obecnego RNA. Względna ekspresja genów docelowych została znormalizowana do 18S dla genów specyficznych dla kości, a b-aktyna została użyta dla genu szlaku Wnt.

6. Przygotowanie in vivo kompozytu z pianki żelowej

1. Stosując procedury aseptyki, stworzono cylindry z pianki żelowej (Pharmacia & Upjohn cat# 09-0353-01) o średnicy 3 mm i długości 8 mm przy użyciu samodzielnie zaprojektowanego instrumentu.
2. Dwadzieścia cztery godziny przed operacją cylindry z pianki żelowej zostały nasączone peptydem L7 lub R1 (20 μM w PBS) lub buforem PBS bez peptydu. Butle z pianki żelowej przeniesiono do sterylnych 12-dołkowych naczyń do hodowli i przechowywano przez noc w temperaturze -4°C.
3. W czasie operacji kompozyt żelpiankowy w naczyniach hodowlanych wyjmowano z lodówki i umieszczano na lodzie do czasu operacji.

7. Wady kości

1. Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Systemu Opieki Zdrowotnej na Uniwersytecie Wirginii przed ich wykonaniem. Dziesięć dziewięciomiesięcznych dorosłych syngenicznych samców szczurów Fischer 344 (350-400 g) znieczulono dootrzewnowo mieszaniną ketaminy (50 g na gram masy ciała) i ksylazyny (5 g na gram masy ciała).
2. Wykonano obustronne podejście chirurgiczne do przednio-przyśrodkowego aspektu kości piszczelowej. Szczury w tym wieku lub starsze wykazują nieznaczny wzrost pola przekroju poprzecznego, obszaru kości korowej, masy kostnej, gęstości kości i długości osiowej przednio-przyśrodkowej części kości piszczelowej. Powstała duża, podłużna wada kory mózgowej o wymiarach 3 mm szerokości i 8 mm długości przy użyciu pneumatycznego zadzioru (wiertarka szybkoobrotowa Halla; Zimmer) pod nawadnianiem solankowym.
3. Ubytek kości leczono pianką żelową z peptydami lub bez. Wszystkie wszczepione rusztowania o wymiarach 3 mm szerokości i 8 mm długości i 1,5 mm głębokości zostały wstawione poprzez delikatne stukanie. Po operacji nie stosowano żadnych zewnętrznych ani wewnętrznych urządzeń do stabilizacji kończyn, a zwierzętom pozwolono poruszać się bez ograniczeń bezpośrednio po operacji.

8. Histologia i morfometria

Regeneracja kości została oceniona na podstawie morfologii ogólnej i wykonanych zdjęć cyfrowych.

1. Szczury poddano eutanazji, a piszczele pobrano w wieku 3, 5 i 12 tygodni, aby określić ilościowo ilość nowej kości powstałej w odpowiedzi na uraz.
2. Po dokładnym sprawdzeniu ubytku kostnego, pobrane kości piszczelowe utrwalono w 10% neutralnej buforowanej formalinie, odwapniono w szybkim odkamieniaczu RDO przez 72 godziny, a następnie rutynowo przetworzono i zatopiono w parafinie, a następnie pocięto wzdłużnie.
3. Regenerację kości oceniano za pomocą dużego i lekkiego badania mikroskopowego.
4. Do każdego stanu użyto dziesięciu zwierząt (tj. pusta wada, sama pianka żelowa i pianka żelowa plus peptyd R1). Ubytek korytyczny o średnicy 8 mm był reprezentowany w ~40 skrawkach tkanki, z których każdy miał grubość 8 μm. Z tych 40 sekcji użyliśmy co najmniej 6 sekcji, aby określić ilościowo ilość nowej kości.
5. Wszystkie skrawki tkanki zostały wybarwione hematoksyliną/eozyną (H&E), która oznacza macierz kostną.
6. Wszystkie preparaty oceniano za pomocą mikroskopii.

9. Naprawa kości

Przegląd

Naprawa kości jest zdecydowanie bardzo ważnym obszarem rozważań w dziedzinie regeneracji tkanki mięśniowo-szkieletowej. Peptydy, które celują w kość, mogą mieć znaczące zastosowanie w praktyce chirurgii ortopedycznej, szczególnie w stosowaniu protez, które mogą zamieszkiwać przez lata, jeśli nie dziesięciolecia. Właściwości biomimetyczne czynników tropikalnych kości mogą stanowić technologiczny krok naprzód w dziedzinie inżynierii tkankowej, a także w chirurgii protetycznej kości. Włączenie czynników ukierunkowanych na kości do polimerów syntetycznych lub naturalnych może pomóc w specyficznym przyleganiu komórek, a tym samym wymiataniu komórek endogennych w tkankach, które przechodzą naprawę i regenerację. Dodatkowym celem było ustalenie, czy nasze unikalne peptydy ukierunkowane na kości, zidentyfikowane w wyniku biopanowania in vivo biblioteki wyświetlania fagów, będą wiązać się z komórkami wyizolowanymi z kości i szpiku kostnego oraz będą miały potencjał do modulowania osteogenezy in vitro i regeneracji kości in vivo.

W naszych eksperymentach dostarczyliśmy peptydy do ubytków udowych u szczurów za pomocą naturalnych i syntetycznych matryc polimerowych oraz regeneracji kości badanej przez histologię, biochemię, ekspresję genów, mikro-CT i biomechanikę, aby wyjaśnić szczegóły aktywności peptydów w regeneracji kości. Dalszy rozwój tego podejścia może prowadzić do odkrycia i rozwoju biologicznie aktywnych związków, które są ukierunkowane na kości i nasilają naprawę poprzez mechanizmy, które są dobrze scharakteryzowane biologicznie na poziomie komórkowym i molekularnym.

Barwienie

Peptydy zostały zsyntetyzowane z etykietami biotyny w celu określenia wiązania i lokalizacji komórek mezenchymalnych. Awidyna znakowana izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) została użyta do mikroskopowego zlokalizowania wiązania peptydów na komórkach wyhodowanych in vitro. Peptydy wiążą się z komórkami mezenchymalnymi w hodowli, a także z kośćmi i szpikiem w skrawkach tkanki żeberkowej myszy in vitro (ryc. 1).

Von Kossa Staining

Komórka mezenchymalna (D1) została sklonowana ze szpiku kostnego i wykorzystana do określenia osteogennego wpływu peptydów na komórki in vitro. Komórki potraktowano peptydami L7 i R1 w celu określenia zmian w morfologii komórek i ekspresji genów. W 4 dniu komórki zaczęły się agregować, a agregaty powiększały się z czasem, tworząc guzki, wzorzec zachowania komórek podobny do komórek kostnych w hodowli (ryc. 2).

Dodanie peptydu L7 lub R1 do komórek zwiększyło barwienie kultur za pomocą von Kossy. Komórki były następnie traktowane różnymi stężeniami peptydu L7 lub R1 przez okres do 16 dni w hodowli. Stwierdzono, że peptyd 5 nM jest najskuteczniejszy in vitro. Aktywność fosfatazy alkalicznej w kulturach, które traktowano peptydem, wzrosła od 2 do 3,5 razy. Wzrost krotności zależał od stężenia peptydu i czasu leczenia w hodowli.

PCR w czasie rzeczywistym

Komórki leczone peptydami L7 i R1 były analizowane za pomocą Real-Time PCR pod kątem ekspresji genów dla dwóch znanych czynników transkrypcyjnych komórek kostnych (Osterix i Runx2) oraz trzech białek macierzy kostnej (sialoproteiny kostnej, osteokalcyny i kolagenu typu I). Leczenie R1 wykazało wzrost ekspresji genów Osterix i Runx2. Ekspresja genu kolagenu typu 1 pozostała niezmieniona. Leczenie L7 wykazało wzrost ekspresji genu BSP i osteokalcyny, a także ekspresję genu kolagenu typu I. Pokazuje to, że oba peptydy mają wpływ na geny, które są związane z początkiem i progresją osteogenezy w hodowlach komórek mezenchymalnych.

Leczenie in vitro hodowli komórkowych peptydami R1 i L7 ujawniło efekt anaboliczny związany z tworzeniem kości za pomocą komórek mezenchymalnych. Wzrost stosunku osteoprotegeryny do RANKL wskazuje na zmniejszenie rekrutacji komórek resorpcyjnych kości, które są znane jako osteoklasty. Leczenie komórek peptydami prowadzi również do zwiększenia ekspresji genów związanych z tworzeniem kości i zmniejsza czynniki hamujące osteogenezę.

Histologia

Aby określić ilość kości, wystawiliśmy plastry kości na działanie światła μLtraviolet, co spowodowało autofluorescencję. Zapewnia to większy kontrast między tkankami kostnymi i niekostnymi w celu ilościowego określenia ². Przekroje zostały sfotografowane zarówno w jasnym polu, jak i w świetle UV (Rysunek 3), a także w świetle Nikona i UV za pomocą cyfrowego systemu obrazowania firmy Nikon przy tym samym powiększeniu (obiektyw x10). Uzyskane obrazy cyfrowe analizowano za pomocą oprogramowania do obrazowania Metavue (Molecular Devices). Wybraliśmy stały, prostokątny obszar zainteresowania (ROI), w którym znajdował się ubytek korytyczny o średnicy 8 mm. Miejsce urazu było zawsze reprezentowane w tym ROI poprzez ręczne umieszczenie pola we właściwej pozycji na każdym obrazie. Piksele H&E-positive zostały częściowo zautomatyzowane za pomocą narzędzia magicznej różdżki ustawionego na tolerancję kolorów. To ustawienie tolerancji skutkowało podświetlonymi pikselami z zakresem zieleni, który dokładnie odpowiadał histologicznemu wyglądowi tkanki kostnej w skrawkach wybarwionych H&E. Zarejestrowano całkowitą liczbę pikseli H&E dodatnich dla każdej sekcji. Liczbę pikseli z poszczególnych sekcji uśredniono dla każdej próbki piszczelowej, a różnice w obrębie i między grupami leczonymi obliczono na podstawie tych średnich. Obszary dla wszystkich próbek zostały następnie porównane w oparciu o ilość nowej kości korowej (ryc. 4).

Obecność kości w przekrojach została określona ilościowo w celu określenia naprawy kości w defektach leczonych pianką żelową + peptydem w porównaniu do samej pianki żelowej. Ubytki, które zostały wypełnione peptydem gelfoam + R1, wykazały największą ilość naprawy kory mózgowej z 10, 7 i 2-krotnym wzrostem odpowiednio po 3, 5, 12 tygodniach. Różnice w naprawie kości korowej w żelpiance + peptydzie w porównaniu z samą pianką żelową były najbardziej zauważalne po 3 i 5 tygodniach, co pokazuje, że peptyd wspomaga regenerację kości korowej (ryc. 5).

10. Anaboliczne działanie peptydów osteogennych

Stosunek OPG/RANKL jest większy niż stosunek RANKL/OPG, co sugeruje, że peptydy mogą mieć bezpośredni wpływ na osteoblasty i regulować resorpcję kości.

Syntetyczne peptydy mogą mieć przewagę nad większymi cząsteczkami, takie jak szybkość przygotowania, stabilność molekularna, długi okres trwałości i potencjalnie terapeutyczne zastosowania. Poczyniono znaczne postępy w próbach modulowania utraty i regeneracji masy kostnej poprzez kontrolowanie cytokin i czynników wzrostu. Te peptydy osteotropowe mogą stanowić atrakcyjną alternatywę dla istniejących terapii, które stymulują anabolizm kości i regenerację kości.

Rysunek 1. Wiązanie peptydów ze szpikiem i kością w przekroju tkanki żebrowej myszy in vitro.

Rysunek 2. Komórki mezenchymalne (D1) tworzą guzki po leczeniu peptydami.

Rysunek 3. Histologia naprawy kości z wykorzystaniem peptydów osteogennych, L7 i R1.

Rysunek 4. Wycinki kości barwione H i E pod wpływem promieniowania UV, które powoduje autofluorescencję. Zapewnia to większy kontrast między tkankami kostnymi i niekostnymi do celów ilościowych.

Rysunek 5. Ilościowe badanie kości w sekcjach histologicznych wykazało, że największa naprawa kory nastąpiła po 5 tygodniach z 10-krotną zmianą, 7- i 2-krotną po 3 i 5 tygodniach, co pokazuje, że peptyd wspomaga regenerację kory kostnej.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zestaw biblioteki peptydów do wyświetlania fagów-Ph.D-12	New England Biolabs	E8110S