Artykuł metodologiczny

Peptydy z biblioteki phage display modulują ekspresję genów w komórkach mezenchymalnych i potęgują osteogenezę w jedokortykalnych defektach kostnych

21.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2362

⸱

10 grudnia 2010

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Orthopaedics Research, University of Virginia, 2Biological Sciences, University of Delaware, 3Orthopaedic Surgery, University of Virginia

W tym artykule

Podsumowanie

W celu zidentyfikowania sekwencji peptydowych celujących w kość wykorzystano bibliotekę displayu fagowego. Celem badania było sprawdzenie wpływu tych peptydów na różnicowanie komórek mezenchymalnych oraz określenie ich oddziaływania na regenerację kości.

Streszczenie

Dwa nowe syntetyczne peptydy przyspieszają tworzenie kości i mogą być dostarczane przy użyciu macierzy kolagenowej. Celem niniejszego badania było zbadanie efektów naprawy kości w modelu defektu jednokortykalnego. Leczenie komórek mezenchymalnych spowodowało wzrost aktywności fosfatazy alkalicznej, wywołało tworzenie guzków przez komórki oraz zwiększyło ekspresję genów runx2, osterix, sialoproteiny kostnej i osteokalcyny. Gąbka kolagenowa nasączona peptydem promowała naprawę defektów kostnych, podczas gdy grupa kontrolna była mniej skuteczna. Wyniki tego badania wykazały, że komórki mezenchymalne traktowane peptydem in vitro różnicują się w kierunku osteogenezy, a peptydy dostarczone in vivo przy użyciu gąbki kolagenowej promują naprawę defektów jednokortykalnych.

Protokół

1. Biopanning in vivo w celu wyizolowania fagów celujących w kości długie

Przeprowadzono sekwencjonowanie DNA faga, a następnie zsyntetyzowano peptydy o odpowiadającej mu sekwencji. Peptydy zsyntetyzowano z łącznikiem gly-gly-gly-ser-lizyna (łącznik jest niezbędny do sprzężenia fluorescencyjnych chromoforów, które pomagają w śledzeniu/wykrywaniu peptydów).

  1. 10-tygodniową mysz szczepu Balb/c poddano znieczuleniu, a następnie odsłonięto serce.
  2. Do biopanningu in vivo wykorzystano zestaw biblioteki peptydów prezentowanych przez fagofagi Ph.D-12 (New England Biolabs, Beverly, MA), w ilości 10 x 1010 pfu, które wstrzyknięto do serca.
  3. Po około 5 minutach mysz uśmiercono. Odsłonięto i wypreparowano kości udowe, odcięto ich końce i usunięto szpik kostny.
  4. Wnętrze i zewnętrzną powierzchnię lewej kości udowej płukano 10 razy roztworem PBS, a następnie kość dodano do bakterii ER2537 (określono jako fagi nieeluowane, przejście do kroku 6).
  5. Kanał szpikowy prawej kości udowej płukano dziesięć razy strzykawką z igłą 21G roztworem 2% odtłuszczonego mleka w proszku w celu usunięcia fagi niewiążących. Fagi związane eluowano z kanału szpikowego buforem HCl-glicynowym o pH 2.2, neutralizowano 1M Trisem, dodano do bakterii ER2537 i inkubowano przez 4,5 godziny w celu amplifikacji fagów (określono jako eluat).
  6. Bakterie usunięto poprzez wirowanie w celu sedymentacji przez 10 min w 4°C, a fagi wytrącono przez noc w 4°C po dodaniu roztworu PEG/NaCl. Fagi zebrano przez wirowanie, zawieszono i wytrącono dwukrotnie poprzez dodanie 1/6 objętości PEG/NaCl. Końcowy osad zawieszono w TBS z 0,02% NaN3.
  7. Amplifikowane eluaty z obu grup (fagi eluowane i nieeluowane) wstrzyknięto osobno kolejnym myszom, a fagi izolowano w opisany wyżej sposób. W przypadku myszy, której wstrzyknięto fagi nieeluowane, pobrano tylko lewą kość udową i umieszczono ją bezpośrednio w bakteriach (patrz krok 4 powyżej). W przypadku myszy z fagami eluowanymi izolację przeprowadzano tylko z prawej kości udowej, a fagi uwalniano buforem HCl-glicynowym przed dodaniem do bakterii (patrz krok 5 powyżej).
  8. Tę procedurę biopanningu in vivo powtórzono trzykrotnie przed sekwencjonowaniem DNA przy użyciu primera-98 (załączonego do zestawu do prezentacji fagowej).
  9. Zwarte fagi amplifikowano w kulturach bakteryjnych, oczyszczono, określono ich ilość, a następnie wstrzyknięto czwartej myszy. Powtórzono sekwencjonowanie.
  10. Aby wykazać swoistość peptydów wobec kości i szpiku, przeanalizowano fagi eluowane z nerek i wątroby zgodnie z powyższym opisem. We wszystkich czterech rundach w narządach tych znajdowała się niewielka ilość fagów (mniej niż 10%).
  11. Peptydy o sekwencji gly-gly-gly-ser-lys zsyntetyzowano w wariantach z biotyną i bez niej, do wykorzystania w barwieniu komórek i tkanek oraz w badaniach in vivo.

2. Hodowla komórek mezenchymalnych do eksperymentów różnicowania komórek w kierunku osteogenicznym

  1. Do eksperymentów in vitro wykorzystano sklonowaną linię pluripotencjalnych komórek zما szpiku kostnego myszy (D1) wyizolowaną w naszym laboratorium1. Komórki hodowano w zmodyfikowanej przez Dulbecco podłożu podstawowym, DMEM, o niskiej zawartości glukozy (Gibco kat#11885-084) uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej (Gibco kat# 16000-044), 50 mg askorbinianu sodu na ml (Sigma kat# A7631) oraz 100 U/mL penicyliny G i 100mg/mL streptomycyny (Gibco kat# 15140-122).
  2. Hodowle utrzymywano w temperaturze 37°C w nawilżonej atmosferze z 5% CO2 w inkubatorach z płaszczem wodnym; pasażowano je, gdy komórki osiągały około 90% konfluencji.
  3. Komórki poddano trypsynizacji, odwirowano w celu uzyskania osadu, przeliczono i wysiano w stężeniu 5x103 komórek/cm2 na plastikowych naczyniach do hodowli tkankowych.

3. Barwienie peptydowe hodowli komórkowych i tkanek

  1. Komórki D1 lub komórki szpiku kostnego wysiano na szkiełka z dołkami powlekone fibronektyną lub żelatyną, zawierające DMEM i 10% płodowej surowicy bydlęcej, na 24 godziny.
  2. Komórki przemyto PBS. Komórki/tkankę utrwalono w 4% paraformaldehydzie przez 30 minut.
  3. Nadmiar grup aldehydowych zablokowano za pomocą 0,5 M glicyny (pH 7,5) przez 10 minut.
  4. Endogenne receptory awidyny i biotyny na powierzchni komórek zablokowano poprzez dodanie 5% roztworu blokującego BSA+Awidyna na 1 godzinę, przepłukano raz w PBS przez 5 minut, a następnie zablokowano 5% roztworem blokującym BSA+Biotyna przez 1 godzinę.
  5. Następnie do dołków dodano 100 μM biotynylowanych peptydów L7 i R1 na 30 minut.
  6. Komórki przemyto trzykrotnie w PBS po 5 minut każdorazowo, po czym dodano rozcieńczenie 1:1000 streptawidyny Alexa Flour i inkubowano w ciemności przez 30 minut.
  7. Komórki przemyto, a szkiełka przykrywowe zamontowano przy użyciu medium montażowego vectashield i zbadano pod mikroskopem fluorescencyjnym.

4. Analiza aktywności fosfatazy alkalicznej

  1. Kolorymetryczny test fosfatazy alkalicznej przeprowadzono na monowarstwach z wykorzystaniem zestawu do oznaczania fosfatazy alkalicznej (BioRad) zgodnie z zaleceniami producenta.
  2. Komórki D1 wysiano z gęstością 5 x 103 komórek/cm2 na 6-dołkowe płytki hodowlane i poddano działaniu peptydy R1; aktywność ALP oznaczono w dniach 4, 8, 12, 16 i 20.
  3. W celu przygotowania lizatów komórkowych warstwy komórek przemyto trzykrotnie buforem PBS, a następnie zebrano za pomocą skrobaczki do buforu PBS, po czym zastosowano sonikację i wirowanie w celu usunięcia resztek komórkowych.
  4. Równe objętości lizatu (100 μL) zmieszano z 100 μL świeżo przygotowanego substratu kolorymetrycznego, fosforanu para-nitrofenylu, i inkubowano w temperaturze 37°C przez 30 minut.
  5. Reakcję enzymatyczną zatrzymano poprzez dodanie 100 μL 0.2 N roztworu NaOH. Aktywność ALP zmierzono przy 405 nm przy użyciu czytnika ELISA (Bio-Rad).
  6. Stężenie białka w lizatach komórkowych zmierzono za pomocą zestawu BioRad Protein Assay Kit, a aktywność AP wyrażono następnie jako ilość powstałego para-nitrofenolu w nmol/min/mg białka.
  7. Aktywność ALP obliczono zgodnie ze specyfikacją producenta (Sigma, Inc.).
  8. Jednostki aktywności ALP znormalizowano do miligramów całkowitej zawartości białka w lizacie komórkowym, korzystając z testu BCA (Pierce, Rockford, IL).

5. Różnicowanie komórek mezenchymalnych z użyciem L7 i R1

  1. Subkonfluentne komórki mezenchymalne (D1) hodowano do osiągnięcia około 90% konfluencji, a następnie poddano działaniu 5nM peptydu L7 i R1.
  2. Komórki zbierano po 0,5, 2, 6, 24 i 48 h, a RNA izolowano za pomocą zestawu Qiagen RNeasy zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Reakcje odwrotnej transkrypcji (RT) rozpoczynano od etapu hybrydyzacji (37°C, 10 minut), po którym następowała synteza pierwszej nici cDNA (42°C, 30 minut) oraz inaktywacja termiczna (95°C przez 5 minut). Otrzymane cDNA przechowywano w zamrażarce (-70°C) do czasu analizy metodą real-time PCR.
  4. Analizę Real Time PCR przeprowadzano z użyciem zestawu QuantiTect SYBR Green PCR (Qiagen). Reakcje realizowano z wykorzystaniem 25 μL master mixu z zestawu SYBR Green oraz starterów forward i reverse (300 nmol/L) dla genów specyficznych dla kości, np. Runx2, Osterix, Osteocalcin, Bone sialoprotein, a także genów szlaku wnt, takich jak b-catenin, LRP6, Wnt 5a, 7b, 10b, DKK1 oraz OPG i RANKL (patrz Tabela 1).
  5. Do końcowej mieszaniny reakcyjnej dodawano 3 μL nierozcieńczonej próbki cDNA z reakcji RT. Format real-time PCR na płytce 96-dołkowej obejmował sześć 10-krotnych rozcieńczeń standardów plazmidowego DNA w dwóch powtórzeniach. Dołki płytki uszczelniano optycznymi pokrywami samoprzylepnymi (BioRad) i wirowano z niską prędkością (300 g, 5 minut), aby zapewnić całkowite wymieszanie.
  6. Każdą próbkę analizowano co najmniej w dwóch powtórzeniach przy użyciu instrumentu iCycler (BioRad Laboratories, Hercules, CA).
  7. Zastosowane protokoły PCR obejmowały aktywację polimerazy DNA AmpliTaq Gold, a następnie 40 cykli denaturacji w 94°C przez 30 sekund, hybrydyzacji w odpowiedniej temperaturze przez 30 sekund oraz elongacji w 72°C przez 30 sekund. Liczbę cykli progowych (CT) PCR dla każdej próbki obliczano w punkcie, w którym fluorescencja przekroczyła limit progowy. Limit progowy ustalano wzdłuż liniowej fazy logarytmicznej krzywych fluorescencji na poziomie od 10 do 20 odchyleń standardowych (SDs) powyżej średniej fluorescencji tła. Równania krzywych wzorcowych obliczano za pomocą analizy regresji średniego CT względem log10 cDNA w stosunku do całkowitej ilości obecnego RNA. Względną ekspresję genów docelowych normalizowano do 18S w przypadku genów specyficznych dla kości, natomiast dla genów szlaku Wnt wykorzystano b-actin.

6. Przygotowanie kompozytu Gelfoam in vivo

  1. Stosując zasady aseptyki, przy użyciu autorskiego narzędzia przygotowano cylindry z gąbki żelatynowej (gelfoam, Pharmacia & Upjohn kat# 09-0353-01) o średnicy 3 mm i długości 8 mm.
  2. Na dwadzieścia cztery godziny przed operacją cylindry z gąbki żelatynowej nasączono peptydem L7 lub R1 (20 μM w PBS) bądź samym buforem PBS bez peptydu. Cylindry przeniesiono do sterylnych 12-dołkowych płytek hodowlanych i przechowywano przez noc w temperaturze -4°C.
  3. W dniu operacji kompozyty z gąbki żelatynowej w płytkach hodowlanych wyjęto z lodówki i przechowywano w lodzie do momentu rozpoczęcia zabiegu.

7. Defekty kostne

  1. Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Systemu Zdrowia Uniwersytetu Wirginijskiego przed ich przeprowadzeniem. Dziesięciu dorosłych, dziewięciomiesięcznych, syngeneicznych samców szczurów szczepu Fischer 344 (350-400 g) zanieczulonot doprzewnowłocznie mieszanką ketaminy (50 g na gram masy ciała) i ksylazyny (5 g na gram masy ciała).
  2. Zastosowano obustronne dojście chirurgiczne do przednio-przyśrodkowej części kości piszczelowej. Szczury w tym wieku lub starsze wykazują nieistotne wzrosty pola przekroju poprzecznego, pola kości korowej, masy kostnej, gęstości kości oraz długości osiowej przednio-przyśrodkowej części kości piszczelowej. Za pomocą pneumatycznego wiertła (Hall High Speed Drill; Zimmer) pod nawadnianiem solą fizjologiczną utworzono duży, wydłużony ubytek jednokortykalny o wymiarach 3 mm szerokości i 8 mm długości.
  3. Ubytek kostny leczono gąbką żelatynową (gelfoam) z dodatkiem peptydów lub bez nich. Wszystkie wszczepione rusztowania o wymiarach 3 mm szerokości, 8 mm długości i 1,5 mm głębokości wprowadzono poprzez delikatne wbijanie. Po operacji nie stosowano zewnętrznych ani wewnętrznych urządzeń do stabilizacji kończyn, a zwierzętom pozwolono na nieograniczone poruszanie się bezpośrednio po zabiegu.

8. Histologia i morfometria

Regenerację kości oceniano na podstawie morfologii makroskopowej oraz wykonanych obrazów cyfrowych.

  1. Szczury zostały uśmiercone, a kości piszczelowe pobrano w 3., 5. i 12. tygodniu w celu ilościowego oznaczenia ilości nowej kości powstałej w odpowiedzi na uraz.
  2. Po dokładnym sprawdzeniu defektu kostnego, pobrane piszczele utrwalono w 10% neutralnym buforowanym formalinie, dekalcyfikowano w szybkim dekalcyfikatorze RDO przez 72 godziny, a następnie poddano rutynowej obróbce, zatopiono w parafinie i wykonano przekroje podłużne.
  3. Regenerację kości oceniano za pomocą badania makroskopowego i mikroskopii świetlnej.
  4. W każdym wariancie (tj. pusty defekt, sam gelfoam oraz gelfoam z peptydem R1) wykorzystano dziesięć zwierząt. Jednokortykalny defekt o szerokości 8 mm przedstawiono na około 40 przekrojach tkankowych, z których każdy miał grubość 8 μm. Z tych 40 przekrojów wykorzystano minimum 6 do ilościowego oznaczenia ilości nowej kości.
  5. Wszystkie przekroje tkankowe barwiono hematoksyliną i eozyną (H&E), która barwi macierz osteoidową.
  6. Wszystkie preparaty oceniano mikroskopowo.

9. Regeneracja kości

Przegląd

Naprawa kości jest ewidentnie bardzo istotnym obszarem rozważań w dziedzinie regeneracji tkanek mięśniowo-szkieletowych. Peptydy celujące w kość mogłyby mieć znaczną użyteczność w praktyce chirurgii ortopedycznej, szczególnie w zastosowaniu protez, które mogą być wszczepione na lata, a nawet dziesięciolecia. Biomimetyczne właściwości czynników tropowych do kości mogłyby stanowić technologiczny krok naprzód w dziedzinie inżynierii tkankowej, a także w chirurgii protetycznej kości. Włączenie czynników celujących w kość do polimerów syntetycznych lub naturalnych może wspomóc specyficzność adhezji komórkowej, pozwalając tym samym na rekrutację endogennych komórek w tkankach podlegających naprawie i regeneracji. Dodatkowym celem było ustalenie, czy nasze unikalne peptydy celujące w kość, zidentyfikowane za pomocą biopanningu in vivo biblioteki phagingu, wiążą się z komórkami izolowanymi z kości i szpiku kostnego oraz mają potencjał do modulowania osteogenezy in vitro i regeneracji kości in vivo.

W naszych eksperymentach wprowadzaliśmy peptydy w ubytki uda u szczurów, wykorzystując naturalne i syntetyczne macierze polimerowe, a regenerację kości badaliśmy za pomocą histologii, biochemiki, ekspresji genów, mikro-CT oraz biomechaniki, aby wyjaśnić szczegóły aktywności peptydów w procesie regeneracji kości. Dalszy rozwój tego podejścia może prowadzić do odkrycia i opracowania biologicznie czynnych związków ukierunkowanych na kości, które wzmacniają naprawę poprzez mechanizmy dobrze scharakteryzowane biologicznie na poziomie komórkowym i molekularnym.

Barwienie

Peptydy zsyntetyzowano z etykietami biotyny w celu określenia wiązania i lokalizacji w komórkach mezenchymalnych. Do mikroskopowej lokalizacji wiązania peptydów w komórkach hodowanych in vitro wykorzystano awidynę znakowaną izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC). Peptydy wiążą się z komórkami mezenchymalnymi w hodowli, jak również z kością i szpikiem w preparatach tkanek żeber myszy in vitro (Rycina 1).

Barwienie metodą von Kossa

Klonowano komórkę mezenchymalną (D1) ze szpiku kostnego i wykorzystano ją do określenia efektu osteogennego peptydów na komórki in vitro. Komórki poddano działaniu peptydów L7 i R1, aby określić zmiany w morfologii komórek i ekspresji genów. W 4. dniu komórki zaczęły tworzyć agregaty, które z czasem powiększały się, tworząc guzki; jest to wzorzec zachowania komórek podobny do komórek kostnych w hodowli ( Rysunek 2 ).

Dodanie peptydu L7 lub R1 do komórek nasiliło barwienie kultur metodą von Kossa. Następnie komórki poddano działaniu różnych stężeń peptydu L7 lub R1 przez okres do 16 dni hodowli. Ustalono, że stężenie 5 nM peptydu było najskuteczniejsze in vitro. Aktywność fosfatazy alkalicznej w kulturach traktowanych peptydem wzrosła od 2 do 3,5 raza. Stopień wzrostu zależał od stężenia peptydu oraz czasu trwania inkubacji w kulturze.

PCR w czasie rzeczywistym

Komórki traktowane peptydami L7 i R1 poddano analizie ekspresji genów za pomocą metody Real-Time PCR w odniesieniu do dwóch znanych czynników transkrypcyjnych komórek kostnych (Osterix i Runx2) oraz trzech białek macierzy kostnej (sjaloproteiny kostnej, osteokalcyny i kolagenu typu I). Kuracja peptydem R1 wykazała wzrost ekspresji genów Osterix i Runx2. Ekspresja genu kolagenu typu 1 pozostała bez zmian. Kuracja peptydem L7 spowodowała wzrost ekspresji genów BSP i osteokalcyny, a także ekspresji genu kolagenu typu I. Dowodzi to, że oba peptydy wpływają na geny związane z zapoczątkowaniem i przebiegiem osteogenezy w kulturach komórek mezenchymalnych.

Kultury komórkowe in vitro traktowane peptydami R1 i L7 wykazały efekt anaboliczny związany z kostnieniem z wykorzystaniem komórek mezenchymalnych. Wzrost stosunku osteoprotegeryny do RANKL wskazuje na zmniejszenie rekrutacji komórek resorbujących kość, znanych jako osteoklasty. Traktowanie komórek peptydami prowadzi również do zwiększenia ekspresji genów związanych z kostnieniem oraz zmniejszenia poziomu czynników hamujących osteogenezę.

Histologia

Aby określić ilość tkanki kostnej, poddano skrawki kości działaniu μŚwiatło ultrafioletowe, wywołując w ten sposób autofluorescencję, zapewnia większy kontrast pomiędzy tkanką kostną a tkankami pozakostnymi w celu przeprowadzenia analizy ilościowej. 2Przekroje sfotografowano przy użyciu światła w polu jasnym oraz światła UV (Rycina 3) Nikon i światło UV za pomocą systemu obrazowania cyfrowego Nikon przy tym samym powiększeniu (obiektyw x10). Uzyskane obrazy cyfrowe przeanalizowano przy użyciu oprogramowania do obrazowania Metavue (Molecular Devices). Wybrano stały, prostokątny obszar zainteresowania (ROI), który obejmował 8-milimetrowy ubytek jednokortykalny. Miejsce urazu zawsze znajdowało się wewnątrz tego ROI, co osiągnięto poprzez ręczne ustawienie ramki w odpowiedniej pozycji na każdym obrazie. H&piksele dodatnie pod kątem obecności E zostały częściowo zautomatyzowane przy użyciu narzędzia magiczna różdżka z ustawioną tolerancją koloru. Ustawienie tej tolerancji pozwoliło na zaznaczenie pikseli o odcieniach zieleni, które precyzyjnie odpowiadały obrazowi histologicznemu tkanki kostnej w H&Przekroje barwione H&E. Całkowita liczba H&Zarejestrowano liczbę pikseli dodatnich pod kątem E dla każdego przekroju. Liczbę pikseli z poszczególnych przekrojów uśredniono dla każdej próbki kości piszczelowej, a następnie na podstawie tych średnich obliczono różnice w obrębie i pomiędzy grupami badawczymi. Następnie porównano powierzchnie wszystkich próbek pod kątem ilości nowej kości korowej ( Rysunek 4 ).

Ilość kości w przekrojach została zmierzona ilościowo, aby określić stopień naprawy kości w ubytkach leczonych gąbką gelfoam z dodatkiem peptydów w porównaniu do grupy z samą gąbką gelfoam. Ubytki wypełnione gąbką gelfoam i peptydem R1 wykazały największy stopień naprawy kości korowej, z odpowiednio 10-, 7- i 2-krotnym wzrostem w 3., 5. i 12. tygodniu. Różnice w naprawie kości korowej w grupie gelfoam+peptyd w porównaniu do samej gąbki gelfoam były najbardziej zauważalne w 3. i 5. tygodniu, co dowodzi, że peptyd wspomaga regenerację kości korowej ( Rysunek 5 ).

10. Efekt anaboliczny peptydów osteogennych

Stosunek OPG/RANKL jest większy niż stosunek RANKL/OPG, co sugeruje, że peptydy mogą mieć bezpośredni wpływ na osteoblasty i regulować resorpcję kości.

Peptydy syntetyczne mogą wykazywać zalety w stosunku do większych cząsteczek, takie jak szybkość przygotowania, stabilność molekularna, długi okres przydatności do użycia oraz potencjalne zastosowania terapeutyczne. Znaczący postęp dokonano w próbach modulowania utraty i regeneracji kości poprzez kontrolowanie cytokin i czynników wzrostu. Te peptydy osteotropowe mogą stanowić atrakcyjną alternatywę dla istniejących terapii stymulujących anabolizm i regenerację kości.

figure-protocol-1
Rycina 1. Wiązanie peptydu do szpiku i kości w przekroju tkanki żebra mysiego in vitro.

figure-protocol-2
Rycina 2. Komórki mezenchymalne (D1) tworzą guzki po traktowaniu peptydem.

figure-protocol-3
Rycina 3. Histologia naprawy kości z wykorzystaniem peptydów osteogennych L7 i R1.

figure-protocol-4
Rycina 4. Przekroje kości barwione H & E pod światłem UV, które powoduje autofluorescencję. Pozwala to na uzyskanie większego kontrastu między tkanką kostną a pozakostną w celach ilościowych.

figure-protocol-5
Rycina 5. Ilościowe oznaczenie kości w przekrojach histologicznych wykazało, że największy stopień regeneracji kory kostnej wystąpił w 5. tygodniu (zmiana 10-krotna), natomiast w 3. i 5. tygodniu zmiana była odpowiednio 7- i 2-krotna, co dowodzi, że peptyd wspomaga regenerację kory kostnej.

Oświadczenia

Produkcja tego filmu była sponsorowana przez New England Biolabs, Inc, firmę produkującą część odczynników wykorzystanych w niniejszym artykule.

Podziękowania

National Institutes of Health, AR53579, Osteogeneza: Potencjowanie za pomocą peptydów tropowych kości
National Institutes of Health, AR056422, Efekt anaboliczny peptydów osteogennych
National Institutes of Health, T32 AR050960, Naprawa i regeneracja tkanek mięśniowo-szkieletowych
DOD, PC051219 Nukleolina: Nowy mediator adhezji komórek raka prostaty i komórek śródbłonka szpiku kostnego
Department of Defense, PC061508, Mediatory adhezji komórek przerzutowych raka prostaty do szpiku kostnego

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do tworzenia bibliotek peptydów metodą phage display-Ph.D-12New England BiolabsE8110S

Bibliografia

  1. Diduch, D. R., Coe, M. R., Joyner, C., Owen, M. E., Balian, G. Two cell lines from bone marrow that differ in terms of collagen synthesis, osteogenic characteristics, and matrix mineralization. J. Bone Joint Surg. Am. 75, 92-105 (1993).
  2. Stoddart, M. J., Furlong, P. I., Simpson, A. E., Davies, C. M., Richards, R. G. Viability in ex vivo cultured cancellous. Eur. Cells. Mater. 13, 69-70 (2007).
  3. Lehr, J. E., Pienta, K. J. Preferential adhesion of prostate cancer cells to a human bone marrow endothelial cell line. J. Natl. Cancer Inst. 90, 118-123 (1998).
  4. Schuster, N., Götz, C., Faust, M., Schneider, E., Prowald, A., Jungbluth, A., Montenarh, M. Wild-type p53 inhibits protein kinase CK2 activity. J. Cell Biochem. 81, 172-183 (2001).
  5. Cwirla, S. E., Peters, E. A., Barrett, R. W., Dower, W. J. Peptides on phage: a vast library of peptides for identifying ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 6378-6382 (1990).
  6. Doorbar, J., Winter, G. Isolation of a peptide antagonist to the thrombin receptor using phage display. J. Mol. Biol. 244, 361-369 (1994).
  7. Ellerby, H. M., Arap, W., Ellerby, L. M., Kain, R., Andrusiak, R., Rio, G. D., Krajewski, S., Lombardo, C. R., Rao, R., Ruoslahti, E., Bredesen, D. E., Pasqualini, R. Anti-cancer activity of targeted pro-apoptotic peptides. Nat. Med. 5, 1032-1038 (1999).
  8. Goodson, R. J., Doyle, M. V., Kaufman, S. E., Rosenberg, S. High-affinity urokinase receptor antagonists identified with bacteriophage peptide display. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 7129-7133 (1994).
  9. Pasqualini, R., Koivunen, E., Ruoslahti, E. A peptide isolated from phage display libraries is a structural and functional mimic of an RGD-binding site on integrins. J. Cell Biol. 130, 1189-1196 (1995).
  10. Pasqualini, R., Koivunen, E., Ruoslahti, E. Alpha v integrins as receptors for tumor targeting by circulating ligands. Nat. Biotechnol. 15, 542-546 (1997).
  11. Pasqualini, R., Koivunen, E., Kain, R., Lahdenranta, J., Sakamoto, M., Stryhn, A., Ashmun, R. A., Shapiro, L. H., Arap, W., Ruoslahti, E. Aminopeptidase N is a receptor for tumor-homing peptides and a target for inhibiting angiogenesis. Cancer Res. 60, 722-727 (2000).
  12. Rajotte, D., Arap, W., Hagedorn, M., Koivunen, E., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Molecular heterogeneity of the vascular endothelium revealed by in vivo phage display. J. Clin. Invest. 102, 430-437 (1998).
  13. Rajotte, D., Ruoslahti, E. Membrane dipeptidase is the receptor for a lung-targeting peptide identified by in vivo phage display. J. Biol. Chem. 274, 11593-11598 (1999).
  14. Wang, B. Isolation of high-affinity peptide antagonists of 14-3-3 proteins by phage display. Biochemistry. 38, 12499-12504 (1999).
  15. Sugahara, K. N., Teesalu, T., Karmali, P. P., Kotamraju, V. R., Agemy, L., Greenwald, D. R., Ruoslahti, E. Coadministration of a tumor-penetrating peptide enhances the efficacy of cancer drugs. Science. 328, 1031-1035 (2010).
  16. Sikes, R. A., Cooper, C. R., Beck, G. L., Pruitt, F., Brown, M. L., Balian, G. Bone Stromal Cells as Therapeutics Targets in Osseous Metastasis. Cancer Growth and Progression. "Integration/Interaction of Oncologic Growth". Meadows, G., Kluwer, K. H. , Academic Publishers. Boston, MA. 369-386 (2005).
  17. Santos, J. L., Pandita, D., Rodrigues, J., Pêgo, A. P., Granja, P. L., Tomás, H., Balian, G. Receptor-Mediated Gene Delivery in Mesenchymal Stem Cells using PAMAM Dendrimers conjugated with Osteotropic Peptides. Molecular Pharmaceutics. , Forthcoming (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sekwencje peptydower nicowanie osteogenneregeneracja ko cidefekt jednokortykalnybiopanningg bka kolagenowafosfataza alkalicznaekspresja Runx2

Powiązane artykuły