Protokół otrzymywania krzyżówki genetycznej pasożytów malarii gryzoni

Podsumowanie

Krzyżowanie genetyczne pasożytów malarii gryzoni przeprowadza się poprzez podanie dwóch genetycznie odmiennych pasożytów komarom. Potomstwo rekombinacyjne jest klonowane z krwi mysiej po tym, jak komary ukąsiły zainfekowane myszy. Niniejszy film pokazuje, jak przeprowadzić krzyżowanie genetyczne Plasmodium yoelii; metoda ta ma zastosowanie również do innych pasożytów malarii gryzoni.

Streszczenie

Zmienność w odpowiedzi na leki przeciwmalaryczne oraz w patogenności pasożytów malarii ma istotne znaczenie biologiczne i medyczne. Mapowanie sprzężeń doprowadziło do pomyślnej identyfikacji genów lub loci leżących u podstaw różnych cech u pasożytów malarii gryzoni^1-3 i ludzi^4-6. Pasożyt malarii Plasmodium yoelii jest jednym z wielu gatunków malarii wyizolowanych z dzikich afrykańskich gryzoni i został przystosowany do hodowli laboratoryjnej. Gatunek ten odwzorowuje wiele cech biologicznych pasożytów malarii ludzkiej; dla tego pasożyta opracowano również markery genetyczne, takie jak markery mikrosatelitarne oraz markery polimorfizmu długości fragmentów amplifikowanych (AFLP)^7-9. W związku z tym badania genetyczne nad pasożytami malarii gryzoni mogą być prowadzone jako uzupełnienie badań nad Plasmodium falciparum. W niniejszej pracy prezentujemy techniki przeprowadzania krzyżowania genetycznego u P. yoelii, które zostały po raz pierwszy opracowane przez dr. Davida Wallikera, dr. Richarda Cartera i współpracowników z Uniwersytetu w Edynburgu¹⁰.

Krzyżowania genetyczne u P. yoelii oraz innych pasożytów malarii gryzoni przeprowadza się poprzez zakażanie myszy Mus musculus inokulum zawierającym gametocyty dwóch genetycznie odrębnych klonów, różniących się badanymi fenotypami, a następnie umożliwienie komarom żerowania na zakażonych myszach 4 dni po infekcji. Przed karmieniem obecność męskich i żeńskich gametocytów we krwi myszy potwierdza się mikroskopowo. W ciągu 48 h po żerowaniu, w jelicie środkowym komara, haploidalne gametocyty różnicują się w gamety męskie i żeńskie, dochodzi do zapłodnienia i powstaje diploidalny zygota (Rys. 1). Podczas rozwoju zygoty w ookinetę prawdopodobnie zachodzi mejoza¹¹. Jeśli zygota powstaje w wyniku zapłodnienia krzyżowego gamet dwóch genetycznie odrębnych pasożytów, mogą wystąpić wymiany genetyczne (reasortyment chromosomalny i crossing-over między niesiostrzanymi chromatydami pary chromosomów homologicznych; Rys. 2), co prowadzi do rekombinacji materiału genetycznego w loci homologicznych. Każda zygota przechodzi dwa kolejne podziały jądrowe, co prowadzi do powstania czterech jąder haploidalnych. Ookineta rozwija się następnie w oocystę. Po dojrzewaniu oocysty powstają tysiące sporozoitów (potomstwa krzyżówki), które zostają uwolnione do hemocelu komara. Sporozoity są pobierane z gruczołów ślinowych i wstrzykiwane nowemu gospodarzowi mysiemu, gdzie zachodzi rozwój w stadium przederytrocytarnym i erytrocytarnym. Formy erytrocytarne są klonowane i klasyfikowane pod kątem cech różniących linie rodzicielskie przed przeprowadzeniem mapowania sprzężeń genetycznych. Zakażenia kontrolne poszczególnymi klonami rodzicielskimi wykonuje się w ten sam sposób, co produkcję krzyżówki genetycznej.

Protokół

W przypadku wszystkich materiałów podawanych zwierzętom należy stosować techniki aseptyczne, aby uniknąć niezamierzonego wprowadzenia egzogennych czynników zakaźnych do organizmów myszy, co mogłoby zakłócić wyniki eksperymentu.

1. Zakażanie myszy laboratoryjnych pasożytami malarii w stadium krwi

1. W temperaturze pokojowej rozmrozić dwie fiolki zawierające zamrożone pasożyty malarii w stadium krwi, które mają zostać skrzyżowane. W tym przykładzie wykorzystane szczepy pasożytów malarii gryzoni to Plasmodium yoelii yoelii oraz Plasmodium yoelii nigeriensis.
2. Wyposażyć strzykawkę w igłę o rozmiarze 22-30 G i pobrać 40 μL sterylnego PBS klasy farmaceutycznej (pH 7.4).
3. Za pomocą tej samej strzykawki pobrać 10 μL rozmrożonej zakażonej krwi; odwracać strzykawkę do góry i dołu, aż zawartość zostanie homogenicznie wymieszana. (Opcjonalnie: do przeniesienia PBS i zakażonej krwi do probówki przed wprowadzeniem ich do strzykawki w celu iniekcji można użyć pipety).
4. Wstrzyknąć 20 μL roztworu zawierającego pasożyty bezpośrednio do otrzewnej myszy. Po zakończeniu wyrzucić strzykawkę do pojemnika na odpady ostre. (Patrz również Materiały uzupełniające w zakresie utrzymania myszy laboratoryjnych). Generalnie standardowa objętość inokulatu wynosi od 100 do 500 μL, w zależności od poziomu zakażenia pasożytami w oryginalnych zamrożonych materiałach.
5. Wstrzyknąć dwa szczepy pasożytów przeznaczonych do krzyżowania do dwóch myszy dla każdego szczepu. Myszy staną się pozytywne w badaniu mikroskopowym od 3 do 5 dni po iniekcjach. Gdy poziom parasitemii osiągnie wartość od 1% do 5%, przejść do następnego kroku.

2. Infekcja myszy mieszanką klonów

1. Przed zakażeniem mieszanym klonów pobrać krew z ogona od dwóch myszy dawców zakażonych różnymi szczepami pasożytów w celu przeprowadzenia badania mikroskopowego cienkich rozmazów krwi barwionych metodą Giemsy (Rys. 3) oraz pomiaru gęstości erytrocytów (szczegółowe procedury znajdują się w Materiałach uzupełniających).
2. Obliczyć objętość soli fizjologicznej (1,5% w/v cytrynianu trysodu dwuwodnego, 0,85% w/v chlorku sodu) oraz krwi mysiej niezbędnej do przygotowania mieszaniny inokulum, wykorzystując wcześniej uzyskane pomiary parasitemii i gęstości erytrocytów.
3. Dostosować roztwór pasożytów do końcowego stężenia jednego miliona zakażonych erytrocytów na 100μl.
4. Połączyć zakażoną krew od dwóch dawców w stosunku 1:1, aby uzyskać inokulum z mieszanych klonów. W przypadku różnic w tempie wzrostu dwóch klonów rodzicielskich, dostosować proporcje klonu szybciej rosnącego do wolniej rosnącego w stosunku 1:2 lub 1:5.
5. Wstrzyknąć 10 μL mieszanej próbki do otrzewnej każdej myszy przeznaczonej do zakażenia (patrz również krok 3.9 w celu określenia liczby myszy do zakażenia).
6. Stosując tę metodę, zakażyć dwie myszy pojedynczymi szczepami rodzicielskimi. Zakażenia pojedynczymi klonami pozwolą na potwierdzenie skutecznej transmisji obu szczepów rodzicielskich.

3. Karmienie komarów

1. Przygotuj trzy klatki zawierające każda po 300-50 dorosłych (samców i samic) komarów Anopheles stephensi w wieku 5-7 dni po wyjściu z poczwarek. Pojemniki są przykryte siatką zabezpieczoną plastikową lub metalową pokrywą. Dwie klatki służą do karmienia klonów rodzicielskich, a trzecia klatka do przygotowania krzyżówki genetycznej.
2. Cztery dni po zakażeniu mieszanym klonami przygotuj cienkie rozmazy krwi z ogonów zakażonych myszy, barwione metodą Giemsy.
3. Zbadaj rozmazy pod mikroskopem, skanując co najmniej 50 pól widzenia przy powiększeniu 10x i określ, czy obecne są gametocyty męskie i żeńskie.
4. Gametocyty męskie i żeńskie są rozpoznawalne dzięki obecności dużej wakuoli i dużych ziarnistości (Ryc. 3). Gametocyty męskie i żeńskie mają odpowiednio różową i niebieską cytoplazmę. Jeśli gametocyty są obecne, przejdź do kroku 3.6.
5. Jeśli gametocyty nie są obecne, kontynuuj codzienne monitorowanie aż do ich pojawienia się. Jeśli gametocyty są obecne, przejdź do następnego kroku.
6. Wstrzyknij 50 μL koktajlu leków znieczulających zawierającego 3 mg/mL ketaminy i 3 mg/mL ksylazyny do otrzewnej każdej zakażonej myszy w celu znieczulenia (na 20 g masy ciała myszy). Końcowa dawka ketaminy i ksylazyny wynosi odpowiednio 82,5 i 7,5 mg/Kg.
7. Umieść myszy brzuchem do góry na górze klatki zawierającej dorosłe komary Anopheles stephensi, które były pozbawione dostępu do cukru przez 24 h, i pozwól komarom żerować przez 30 minut bez przerwy.
8. Utrzymuj komary w insektarium w standardowych warunkach (temperatura utrzymywana w zakresie 24-26°C; zapoznaj się również z Materiałami Uzupełniającymi dotyczącymi utrzymania komarów laboratoryjnych).
9. Wykorzystaj jedną zakażoną mysz na każde 50-10 samic komarów. Eutanizuj myszy natychmiast po karmieniu poprzez zwichnięcie karku, gdy myszy wciąż znajdują się pod wpływem znieczulenia.

4. Disekcja jelit środkowych komarów i liczenie oocyst

1. Dziewięć dni po karmieniu sprawdzono obecność oocyst w jelicie środkowym komarów. Obecność oocyst u komarów, które żywiły się myszami zainfekowanymi pojedynczym klonem, wskazuje, że gametocyty dwóch szczepów rodzicielskich są zakaźne.
2. Aby wypreparować jelito środkowe komara, należy użyć aspiratora podłączonego do małego pojemnika, aby zebrać z klatki od 5 do 10 zainfekowanych komarów.
3. Za pomocą gazu CO₂ znieczulono komary i przeniesiono je do szklanej szalki Petriego umieszczonej na lodzie. Oddzielono i odrzucono samce. Czułki samców są wyraźnie bardziej pierzaste w porównaniu do samic.
4. Dwie strzykawki napełniono PBS i wyposażono w igły o rozmiarze 26 gauge pół cala (G^½). Na szkiełko przedmiotowe naniesiono około 10 μL PBS ze strzykawki.
5. Przeniesiono od 5 do 10 znieczulonych samic komarów na kroplę PBS i umieszczono szkiełko pod mikroskopem stereoskopowym.
6. Za pomocą tych samych igieł usunięto skrzydła i odnóża każdego komara, a następnie, trzymając owada za przedplecze i tylną część odwłoka, rozdzielono ciało, aż do momentu uwolnienia jelita środkowego, które ma postać białego workowatego narządu. Odizolowano jelito środkowe i odrzucono resztę ciała.
7. Jeśli szkiełka wyschły, dodano więcej PBS na jelito środkowe. Jelito środkowe ulegnie degradacji, jeśli zostanie doprowadzone do wyschnięcia. Na jelita środkowe nałożono szkiełko nakrywkę.
8. Jelita środkowe badano pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 10x. Policzono liczbę oocyst w każdym jelicie środkowym (Fig 3). Oocysty są rozpoznawalne jako okrągłe struktury z grubą ścianą, znajdujące się na zewnętrznej powierzchni jelit środkowych.
9. Po zakończeniu pracy strzykawki, igły i szkiełka zutylizowano w pojemniku na odpady ostre.
10. W przypadku braku oocyst w jelitach środkowych, należy karmić komary myszami zakażonymi większą liczbą gametocytów i wydłużyć czas karmienia. Temperatura jest kluczowa w tym kroku. Należy upewnić się, że temperatura jest ustawiona w zakresie od 24 do 26° C.

5. Pozyskiwanie sporozoitów z komarów metodą wirowania

1. Przygotuj probówki do zbierania sporozoitów w następujący sposób: odetnij zakrętkę czystej probówki do odwirowywania o pojemności 0,5 mL i wykonaj otwór (o średnicy 0,1-0,2 mm) w dnie probówki za pomocą wypalonej igły 19 G.
2. Wypełnij 1/3 probówki wełną szklaną. Włóż probówkę filtrującą do probówki zbiorczej o pojemności 1,5 mL (jedna probówka wystarcza do zebrania sporozoitów z ok. 10 komarów).
3. W 17. dniu po karmieniu zbierz komary (Krok 4) z klatek do małego pojemnika za pomocą aspiratora.
4. Użyj gazu CO₂ do znieczulenia komarów.
5. Oddziel samice od samców. Przenieś znieczulone samice komarów z pojemnika na szklaną płytkę Petri znajdującą się na lodzie.
6. Przygotuj dwie strzykawki z igłami 26 G^½ wypełnione PBS. Nanieś około 10 μL PBS ze strzykawki na szkiełko przedmiotowe.
7. Przenieś komary na szkiełko mikroskopowe. Pod mikroskopem stereoskopowym usuń głowy, skrzydła, odnóża i odwłoki komarów.
8. Za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami przenieś tułowia do 0,5 mL PBS w homogenizatorze o pojemności 1,5 mL (moździerz z tłuczkiem). Przechowuj tułowia na lodzie (sporozoity pozostają zakaźne przez 2-3 h).
9. Zhomogenizuj tułowia na lodzie, aby uwolnić sporozoity z gruczołów ślinowych (patrz Rysunek 3), a następnie przenieś lizaty (homogenaty) do probówki wypełnionej wełną szklaną (Krok 5.1-5.2) za pomocą pipety szklanej.
10. Wirować przez 10 do 20 s przy 10 rpm w temperaturze pokojowej.
11. Zbierz przelew (oczyszczoną zawiesinę sporozoitów) za pomocą strzykawki z igłą 2-30 G. (Opcjonalnie: nanieś 10-50 μL przelewu na szkiełko mikroskopowe, nałóż szkiełko nakrywkowe i zwizualizuj żywe sporozoity pod standardowym mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 40X, patrz również Rys. 3).
12. Wstrzyknij d.o. 0,1-0,5 mL zawiesiny sporozoitów myszom (z jednego komara można zebrać do 20 0 pasożytów; patrz ref 12). W przypadku sukcesu zwierzę zostanie zainfekowane 72 h po iniekcji.

6. Klonowanie potomstwa za pomocą ograniczonego rozcieńczenia

1. Siedemdziesiąt dwie godziny po wstrzyknięciu sporozoitów pobierz krew z ogonów dwóch myszy dawców zainfekowanych różnymi szczepami pasożytów w celu badania mikroskopowego po barwieniu Giemsy cienkich rozmazów krwi oraz do pomiaru gęstości czerwonych krwinek (szczegółowe procedury znajdują się w Materiałach Uzupełniających).
2. Wybierz mysz wykazującą parasitemię na poziomie 0,1–1%, w której zainfekowane czerwone krwinki zawierają głównie pojedyncze pasożyty, jako dawcę do procedury klonowania. Jeśli myszy są mikroskopowo negatywne, powtórz krok 6.1 w kolejnych dniach. Jeśli zwierzęta nie zostaną zainfekowane w ciągu 14 dni, powtórz kroki od 2 do 5 i ustal obecność sporozoitów w kroku 5.1).
3. Rozcieńcz pobraną krew z ogona w zimnym roztworze surowicy cielęcej i roztworu Ringera dla ssaków (2,7 mM chlorku potasu, 1,8 mM chlorku wapnia, 154 mM chlorku sodu) w stosunku 1:1, aby uzyskać stężenie od 0,6 do 1 zainfekowanej czerwonej krwinki na 100 μL, a następnie przechowuj inokulum w lodzie. W ten sposób większość pojedynczych myszy powinna otrzymać albo jeden, albo zero pasożytów.
4. Wstrzyknij dożylnie 10 μL rozcieńczonej zainfekowanej krwi każdej z 50 do 10 myszy.
5. Pięć do siedmiu dni później sprawdź myszy pod kątem obecności pasożytów w stadium krwi poprzez badanie cienkich rozmazów krwi barwionych metodą Giemsy. W przypadku udanego eksperymentu 20–50% myszy zostanie zainfekowanych i wykaże parasitemię na poziomie 0,1–5,0% w 8. dniu po infekcji.

7. Charakterystyka potomstwa z wykorzystaniem markerów genetycznych

1. Pobrać od 20 do 40 μL krwi z ogona myszy do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL zawierającej 0,2 mL schłodzonego fizjologicznego roztworu cytrynianu sodu, krótko wymieszać na wortexie, a następnie wirować przez 3 min przy 300 rpm w temperaturze pokojowej, aby wytrącić komórki krwi w osad. Wyizolować DNA natychmiast lub przechowywać osad w temperaturze -80°C.
2. Przygotować DNA pasożyta, stosując dowolną standardową metodę ekstrakcji DNA. W celu szybkiej izolacji DNA należy użyć zestawu do przygotowania matrycy PCR High Pure (Roche Applied Bioscience).
3. Rekombinowane potomstwo identyfikuje się po genotypowaniu z wykorzystaniem mikrosatelitów (MS) lub polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) na różnych chromosomach, które pozwalają na rozróżnienie dwóch szczepów rodzicielskich w krzyżówce genetycznej. Można zastosować uproszczoną metodę wykorzystującą pojedyncze startery znakowane fluorescencyjnie do genotypowania MS dla P. yoelii (patrz ref 8,9).

8. Kriokonserwacja pasożytów malarii w stadium krwi

1. Pobrać 0,5-1 mL zakażonej krwi poprzez nakłucie serca znieczulonej myszy z parasitemią na poziomie 5-20% do 5-10 mL schłodzonego roztworu soli fizjologicznej.
2. Wirować przez 5 min przy 20 obr./min w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.
3. Do osadu krwi dodać kroplami dwukrotność objętości roztworu Glycerolyte 57 (Fenwal Laboratories) i dokładnie wymieszać.
4. Przenieść zawiesinę do krioprobówek (0,2-0,5 mL na probówkę).
5. Przechowywać krio-konserwowaną krew w temperaturze -80 °C (do 1 miesiąca) lub w ciekłym azocie.

9. Reprezentatywne wyniki:

W udanym eksperymencie od 5-10% sklonowanych linii będzie stanowiło niezależne potomstwo rekombinowane.

Rysunek 1. Schematyczny przebieg cyklu życiowego oraz zdarzeń rekombinacji genetycznej podczas krzyżówki genetycznej. Rekombinacja genetyczna zachodzi we wczesnej fazie rozwoju w organizmie komara. W wyniku zapłodnienia „haploidalnych” gamet męskich i żeńskich o różnych podłożach genetycznych w jelicie środkowym komara powstają „diploidalne” zygoty. Zygota stanowi jedyny diploidalny etap cyklu życiowego pasożyta; mejoza następuje w ciągu 12 godzin od zapłodnienia, a wszystkie kolejne stadia w organizmie komara i ssaków pozostają haploidalne. Powstałe zygoty rozwijają się w ookinety i oocysty. Wzrost i podziały mitotyczne każdej oocysty prowadzą do powstania tysięcy sporozoitów, które zostają uwolnione do hemocelu komara. Sporozoity migrujące do ślinianek są w pozycji umożliwiającej ich przeniesienie na gospodarza ssaka, gdzie odbywa się rozwój stadiów wątrobowych oraz czerwonokrwinkowych. W przebiegu cykli czerwonokrwinkowych niektóre pasożyty mogą różnicować się w dojrzałe gametocyty męskie i żeńskie. Cykl życiowy pasożyta dopełnia się, gdy gametocyty te zostaną pobrane przez kolejnego komara, co prowadzi do kontynuacji transmisji.

Rysunek 2. Dziedziczenie genów jądrowych u pasożytów malarii i powstawanie potomstwa rekombinacyjnego. Rekombinacja genetyczna może zachodzić poprzez reasortację chromosomową lub zdarzenia crossing-over. A) Potomstwo homozygotyczne powstające w wyniku samozapłodnienia gamet tego samego klonu rodzicielskiego 1 lub 2 (A i D), odpowiednio. B) Potomstwo heterozygotyczne powstające w wyniku zapłodnienia krzyżowego gamet dwóch różnych klonów rodzicielskich, w którym jądra rekombinacyjne (niebieskie owale) powstają wyłącznie w wyniku reasortacji chromosomowej. C) Potomstwo heterozygotyczne powstające w wyniku zapłodnienia krzyżowego gamet dwóch różnych klonów rodzicielskich, w którym jądra rekombinacyjne (czerwone owale) powstają w wyniku crossing-over między niesiostrzanymi chromatydami chromosomów homologicznych.

Rysunek 3. Morfologia pasożyta malarii gryzoni Plasmodium yoeliiA) stadium pierścienia, B) trofozoit, C) schizont, D) merozoity, E) niedojrzały gametocyt męski, F) dojrzały gametocyt męski, G) niedojrzały gametocyt żeński, H) dojrzały gametocyt żeński, I) jelito środkowe z oocystami w 10. dniu po karmieniu (dojrzałe oocysty wskazane strzałkami; powiększenie 20x), J) ślinianki komara (powiększenie 100x), K) sporozoity (powiększenie 400x).

Dyskusja

Prezentujemy techniki przeprowadzania krzyżówki genetycznej u zarodźca gryzoni Plasmodium yoelii, które mają zastosowanie również do tworzenia krzyżówek genetycznych u innych gatunków zarodźców gryzoni. Zakażenia myszy pojedynczymi klonami rodzicielskimi są zazwyczaj przeprowadzane w celu potwierdzenia skutecznej transmisji pasożytów rodzicielskich, aby upewnić się, że osobniki rodzicielskie są zdolne do wytwarzania funkcjonalnych gamet przed przystąpieniem do krzyżowania.

Pomyślna t...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
roztwór Glyerolyte 57	Cenmed	4A7833
Mysz Mus musculus	Charles River Laboratories		Samice inbredowej linii Balb/C
Surowica cielęca inaktywowana termicznie	Invitrogen	26010-066
Roztwór soli fosforanowo-buforowanej (PBS)	Invitrogen	10010-072	pH 7,4; stopień czystości do hodowli komórkowych
pasożyt malarii Plasmodium y–lii y–lii 17XNL(1.1)	MR4	MRA-593	zgłoszone przez DJ Carucci
pasożyt malarii Plasmodium y–lii nigeriensis N67	MR4	MRA-427	zdeponowane przez W Peters, BL Robinson, R Killick Kendrick
Komar Anopheles stephensi	MR4	MRA-128	złożone przez MQ Benedict
Automatyczny licznik komórek Cellometer	Nexcelom Bioscience	Cellometer Auto T4
Jednorazowa komora hemocytometryczna Cellometer CP2	Nexcelom Bioscience	Cellometer CP2
Zestaw do przygotowania matrycy PCR High Pure	Grupa Roche	11 796 828 001
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	C5670	Przebadane hodowle komórkowe; przebadane hodowle komórek owadzie
Barwienie Giemsą, zmodyfikowane	Sigma-Aldrich	GS500
Chlorowodorek ketaminy	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-2013-01	Klasa farmaceutyczna; stężenie do 100 mg/ml
Chlorek potasu	Sigma-Aldrich	P5405	Przetestowano w hodowli komórkowej; przetestowano w hodowli komórek owadów
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S5886	Przetestowano w hodowli komórkowej; przetestowano w hodowli komórek owadziej
Cytrynian trisodu dwuwodny	Sigma-Aldrich	S4641
Ksylazyna	Akorn Inc	4811-20ml	Klasy farmaceutycznej; stężenie do 20 mg/ml
Wełna szklana	VWR international	32848-003
Kapilara szklana (1 μL)	VWR international	53440-001
Komora licznikowa (hemocytometr)	VWR international	15170-168	Kompletny zestaw komór
Homogenizator	VWR International	KT749520-0090	Tłuczek z dopasowaną probówką, 1,5 ml
MATERIAŁY UZUPEŁNIAJĄCE: Utrzymanie myszy laboratoryjnych Utrzymanie laboratoryjnych populacji komarów–Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. Badanie mikroskopowe cienkich rozmazów krwi barwionych barwnikiem Giemsy Pomiar gęstości erytrocytów Utrzymanie myszy laboratoryjnych W badaniu wykorzystano samice inbredowego szczepu myszy laboratoryjnych BALB/c w wieku od 5 do 8 tygodni. Myszy kwaterowano w standardowych poliwęglanowych klatkach z pełnym dnem i drutową pokrywą, wyposażonych w karmidło i butelkę z wodą. Myszy utrzymywano w stałej temperaturze (25 ± 1°C) w 12:12-godzinnym cyklu światło:ciemność. Myszy mają dostęp do ekstrudowanej diety dla gryzoni 2018S Harlan Teklad Global z 19% zawartością białka (sterylizowalna; od Harlan-Teklad) oraz zakwaszonej wody pitnej ad libitum. Eksperymenty na zwierzętach są przeprowadzane zgodnie z wytycznymi i przepisami określonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w National Institute of Allergy and Infectious Disease zgodnie z protokołem LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland). Utrzymanie komarów laboratoryjnych–S Komar–Owady pochodzą z hodowanej laboratoryjnie kolonii Anopheles stephensi. Postacie dorosłe są utrzymywane w nylonowych klatkach w pomieszczeniu z kontrolowaną temperaturą i wilgotnością (23 do 25°C dla Plasmodium y–lii i Plasmodium chabaudioraz od 19 do 21°C dla *Plasmodium berghei*; wilgotność od 80 do 95%; w cyklu światło:ciemność 12:12 godzin). Dorosłe komary–karmi się roztworem wodnym z dodatkiem 10% glukozy i 2,00% kwasu para-aminobenzoesowego (PABA). Aby uzyskać wysokiej jakości osobniki dorosłe, 500 larw hoduje się w warunkach niskiej gęstości w 1 l wody destylowanej w naczyniu o objętości 1000 cm3 otwartą szalkę zawierającą około 1 mg wodorowęglanu sodu. Po wykluciu larwy są karmione proszkiem tetramin (PETCO) aż do osiągnięcia stadium poczwarki, a następnie przeniesione do klatek dla dorosłych komarów w celu przeobrażenia. Badanie mikroskopowe cienkich rozmazów krwi barwionych barwnikiem Giemsy Za pomocą czystych nożyczek odetnij koniuszek (1,0 mm) ogona zakażonej myszy’ogona. Nanieść jedną kroplę (0,5-1,0 μL) krwi z ogona na czyste szkiełko przedmiotowe. Krwawienie u myszy ustanie w ciągu 1–2 min. Położyć czyste szkiełko rozcierające na kropli krwi, utrzymując je pod kątem 45° pod kątem względem preparatu i pozwolić krwi zaadsorbować się na całej szerokości szkiełka rozcierającego. Trzymając preparat, szybko i płynnie przesunąć szkiełko rozcierające do przodu, aby uzyskać cienki rozmaz. Pozostawić preparat krwi do wyschnięcia, a następnie zanurzyć szkiełka w bezwodnym metanolu. Pozostawić szkiełko do ponownego wyschnięcia na powietrzu przed pokryciem go barwnikiem Giemsy (10% roztwór barwnika Giemsy w wodzie destylowanej). Po inkubacji cienkich rozmazów krwi przez 10–15 min w temperaturze pokojowej, ostrożnie opłukać szkiełka wodą z kranu i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Liczbę zakażonych erytrocytów (iRBC; morfologię zakażonych erytrocytów przedstawiono na rysunku 3) ocenić pod mikroskopem świetlnym z użyciem olejku imersyjnego przy powiększeniu 1000x (z obiektywem 100x) i obliczyć poziom pasożytemii (liczbę iRBC na 100 policzonych erytrocytów). Różne szczepy pasożytów malarii różnią się tempem wzrostu i patogennością. Monitorowanie pasożytemii we krwi można przeprowadzić 24 h po iniekcjach, w zależności od dawki pasożytów malarii w stadium krwi. Na przykład myszy będą dawać wynik dodatni w badaniu mikroskopowym po 24 h, jeżeli wstrzyknięto im 107 zakażone erytrocyty dojamieniowo lub 106 zakażone erytrocyty dożylnie. Pomiar gęstości erytrocytów Podobnie jak poziomy parasytemii, gęstość erytrocytów (RBC) u zakażonych myszy zmienia się w trakcie przebiegu infekcji. Gęstość erytrocytów należy zmierzyć w ciągu 1–2 godzin przed rozpoczęciem zakażeń pojedynczymi i mieszanymi klonami oraz przed eksperymentami z klonowaniem. Istnieją dwie metody pomiaru gęstości erytrocytów: ręczne liczenie z użyciem komory licznikowej Neubauera oraz automatyczne liczenie z użyciem analizatora Cellometer (Nexcelom Bioscience). W obu metodach pobierz 1 μL krwi z ogona myszy za pomocą szklanej kapilary (VWR), a następnie rozcieńczyć w 10 mL PBS i dobrze wymieszać. Aby użyć komory licznikowej Neubauera, nanieść 20 μL zawiesiny na komorę countingową (hemacytometr). Umieść hemacytometr na mikroskopie świetlnym z obiektywem 10x. Hemacytometr zawiera siatkę podzieloną na 9 dużych kwadratów, z czego 4 duże kwadraty narożne są dalej podzielone na 16 małych kwadratów. Policz całkowitą liczbę komórek w każdym z 16 małych kwadratów w czterech kwadratach narożnych. Aby uniknąć błędu systematycznego lub liczenia komórek nachodzących na linię siatki, komórkę uznaje się za "w" jeśli nakłada się na górną lub prawą linię i "na zewnątrz" jeśli nakłada się na linie dolną lub lewą. Oszacuj liczbę komórek w jednym małym kwadracie i podziel ją przez 0,00625 (objętość jednego małego kwadratu wynosi 6,25 nL). Pozwala to uzyskać liczbę komórek na mikrolitr (μL). Na podstawie tych danych oblicz końcową gęstość erytrocytów, mnożąc wynik przez 10 000 (czynnik rozcieńczenia). Przepłucz szkiełko nakrywkowe i komorę licznikową wodą destylowaną oraz 70% etanolem, a następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Alternatywnie, nanieś 20 μL zawiesiny na slajd z komorą zliczającą Cellometer. Wsuń slajd do komory na slajdy w urządzeniu Cellometer (czytniku). Uruchom oprogramowanie Cellometer, wybierz "erytrocyt" wybrać opcję i wprowadzić współczynnik rozcieńczenia 10 000. Zapisać gęstość RBC.