Ukierunkowane dostarczanie wirusa do neuronów korowo-rdzeniowych u nowonarodzonego szczura w celu zbadania urazu rdzenia kręgowego

Streszczenie

Źródło: Smit, R. D., et al. Celowanie w przewód korowo-rdzeniowy u noworodków szczurów za pomocą podwójnego wektora wirusowego przy użyciu połączonej chirurgii mózgu i kręgosłupa. J. Vis. Exp. (2021)

Ten film pokazuje ukierunkowane dostarczanie wektorów wirusowych do neuronów korowo-rdzeniowych u nowonarodzonego szczura. Protokół umożliwia precyzyjną ekspresję genów za pomocą następczych i wstecznych iniekcji wirusowych, ułatwiając badania nad regeneracją i plastycznością neuronów po urazie rdzenia kręgowego.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Bezpośrednie wstrzyknięcia do rdzenia kręgowego ukierunkowane na zakończenia aksonów

1. Za pomocą końcówki szklanej igły do wstrzykiwań przybliż linię środkową rdzenia kręgowego, identyfikując tętnicę kręgową. Jeśli jednak tętnica kręgowa jest zauważalnie przesunięta lub odchyla się w jakikolwiek sposób, należy przybliżyć linię środkową, wykorzystując położenie wyrostka kolczystego C2 i ekstrapolując to w dół długości kręgosłupa.
   UWAGA: Załaduj wirusa do wstrzykiwacza, pipetując ~5 μl na kawałek parafilmu i ustaw igłę tak, aby końcówka spoczywała na kropelce wirusa.
2. Po zidentyfikowaniu umieść igłę tuż za blaszką C5 na przybliżonej linii środkowej i użyj jej jako punktu odniesienia. Następnie za pomocą mikromanipulatora przesunąć igłę w bok w prawo o 0,3 mm. Opuść igłę, aż dotknie powierzchni rdzenia kręgowego; Z tej głębokości zanurz igłę 0,6 mm w rdzeniu kręgowym. W razie potrzeby kontynuuj zanurzanie igły, aż przebije rdzeń kręgowy; Następnie wycofaj lub opuść igłę na odpowiednią głębokość.
3. Wstrzyknąć 1 μl retro adenowirusa związanego z adenowirusem2-scCre w stężeniu 250 nL/min. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy odczekać 2 minuty, aż wirus rozprzestrzeni się do rdzenia kręgowego, a następnie powoli wycofać igłę. Powtórz wstrzyknięcia, używając tych samych współrzędnych bocznych i głębokości w dwóch kolejnych miejscach w oknie kręgosłupa, jednym w punkcie środkowym i ostatnim tuż przed blaszką T1.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Flexible Needle Attachment	World Precision Instruments	MF34G-5	Do czyszczenia szklanych igieł i ładowania czerwonego oleju do szklanych igieł.
Szklane rurki kapilarne	World Precision Instruments	4878	Do ciągniętych szklanych igieł - powinny być przeznaczone do wtryskiwaczy nanolitrowych.
Mikromanipulator ze skalą noniuszową	Kanetec	N/A	Do precyzyjnego celowania podczas operacji.
Lab Standard Stereotaxic Instrument	Stoelting	51600	Aby utrzymać uchwyt sterotaksyjny noworodka na miejscu
Lab Standard z adapterem myszy i noworodków	51615	Do stabilizacji czaszki noworodka podczas operacji czaszki i zastrzyków rdzeniowych
Mikroskop ze skalą światła i noniusza Ocular	Leitz Wetzlar	N/A	Służy do wizualizacji i pomiaru ukosowania ciągniętych szklanych rurek kapilarnych w funkcjonalne szklane igły.
Sterownik pompy mikrostrzykawkowej	World Precision Instruments	62403	Do kontrolowania szybkości wtrysku.
Nanolitr 2000 Pompa Head Injector	World Precision Instruments	500150	Do ładowania i wstrzykiwania wirusa w kontrolowany sposób.
pAAV-CMV-scCre	Wu lab		Cre plazmid
pAAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry (plazmid #44361)	Laboratorium Bryana Rotha za pośrednictwem	plazmidu
PrecisionGlide Needles (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	Do użytku ze strzykawkami 1 ml i 10 ml, aby umożliwić wstrzyknięcie modelu zwierzęcego.
Kleszczyki do zębów szczurów	Roboz	RS-5152	Do chwytania wyrostków kolczystych.
Sterylna sól fizjologiczna	Baxter Healthcare Corporation	281324	Do stosowania w oczyszczaniu krwi i do uzupełniania płynów po operacji.
Rękawice chirurgiczne	N/A	N/A	Do użytku przez chirurga w celu utrzymania sterylnego pola podczas operacji.
Chirurgiczna poduszka grzewcza	N/A	N/A	Do utrzymywania temperatury ciała modelu zwierzęcego podczas operacji.
Mikroskop chirurgiczny	N/A	N/A	Dla lepszej wizualizacji rany pooperacyjnej.

Addgene DREADD