Oparte na mikroiniekcjach dostarczanie środka terapeutycznego do obudzonego mózgu gryzonia

Streszczenie

Źródło: Poland, R. i wsp. Mikroiniekcja mózgu gryzoni w celu zbadania molekularnych substratów umotywowanego zachowania. J. Vis. Exp. (2015)

W tym filmie zestaw do mikroiniekcji wypełniony wodą, składający się ze strzykawki i rurki do mikrowstrzykiwaczy, służy do precyzyjnego dostarczania leku. Szczur z wszczepioną kaniulą prowadzącą jest poddawany celowanej mikroiniekcji mózgu, umożliwiającej dokładne podawanie środków terapeutycznych obudzonym zwierzętom przy minimalnym uszkodzeniu tkanek.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie strzykawki do mikroiniekcji i mikroiniektora do wstrzykiwania:
   1. Zablokuj każdą gazoszczelną strzykawkę do mikroiniekcji w stojaku pompy do mikroiniekcji.
   2. Umieść końcówkę gazoszczelnej strzykawki w sterylnej wodzie znajdującej się w małej łódce do ważenia i delikatnie potrząśnij tłokiem, aby nasmarować drut wewnętrzny. Równomiernie pociągnij tłok do ogranicznika na pompie, aby napełnić ją wodą.
   3. Wsuń rurkę PE20 podłączoną do mikrowstrzykiwacza na igłę 26 G (brązowa piasta) przymocowaną do strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej sterylną wodą. Rozpyl sterylną wodę przez mikrowtryskiwacz i sprawdź wzór i odległość rozpylania.
      UWAGA: Woda powinna tryskać bardzo daleko i prosto z końcówki mikrowtryskiwacza. Jeśli strumień nie jest prosty, miejsce wstrzyknięcia nie będzie prawidłowe.
   4. Umieść wysterylizowany mikrowstrzykiwacz na sterylnym polu.
   5. Zsuń rurkę z igły, trzymając rurkę mikrowtryskiwacza w pozycji pionowej, aby zapobiec kapaniu wody, jednocześnie przecinając rurkę poniżej obszaru uszkodzonego przez igłę.
   6. Popchnij tłok strzykawki do mikroiniekcji lekko do przodu, aby utworzyć kroplę na końcu igły i wsuń rurkę PE20 wypełnioną wodą (która jest podłączona do mikrowtryskiwacza) na igłę.
      UWAGA: Spowoduje to utworzenie połączenia ciecz-ciecz, które umożliwi odpowiednie przeciwciśnienie, które może usunąć zator, który może powstać na końcówce mikrowtryskiwacza.
   7. Popchnij tłok całkowicie do przodu, aby przygotować się do załadowania próbki i upewnić się, że w mikrowtryskiwaczu nie pozostał śladowy ilość etanolu.
   8. Sprawdź konfigurację pod kątem wycieków, kilkakrotnie dotykając kropli wody, która utworzyła się na końcówce mikrowtryskiwacza, czystą chusteczką laboratoryjną.
2. UWAGA: Po dotknięciu chusteczki laboratoryjnej powinna powstać tylko jedna mokra plama. Jeśli kropli jest więcej, oznacza to nieszczelność systemu.
3. Unikaj wycieków, kontrolując nakładanie super kleju i przycinając rurkę PE20 ostrymi nożyczkami lub żyletką za każdym razem, gdy rurka PE20 jest wyjmowana z dowolnego połączenia.
4. Odciągnąć tłok strzykawki o 0,2 μl, tworząc pęcherzyk między sterylną wodą w wężyku/mikrowstrzykiwaczu PE20 a roztworem, który ma być wstrzykiwany.
5. UWAGA: Ten pęcherzyk zapobiega rozcieńczeniu iniekcji, zanieczyszczeniu wody i pozwala na monitorowanie procesu wstrzykiwania, ponieważ będzie się poruszał podczas wstrzykiwania. Należy wytworzyć pojedynczy, stały pęcherzyk.
6. Umieścić mikrowstrzykiwacz w odczynniku, który ma być wstrzykiwany, i powoli pociągnąć tłok strzykawki do blokady.
7. Przygotowanie zwierzęcia do wstrzyknięcia:
8. Przyłóż klatkę piersiową szczura do klatki piersiowej eksperymentatora. Oczyść obszar wokół kaniul bawełnianym aplikatorem nasączonym 70% etanolem (v/v).
9. UWAGA: Przy prawidłowym obchodzeniu się z myszami można delikatnie przytrzymać w złożonej dłoni. W przeciwnym razie może być wymagane scruffing.
10. Usuń zasłony za pomocą małych kleszczy i umieść je w łodzi wagowej z 70% etanolem (v/v).
11. Wykonywanie iniekcji:
12. Umieść napełniony mikrowstrzykiwacz w kaniuli. Nacisnąć przycisk start na pompie do mikroiniekcji i monitorować ruch pęcherzyków.
13. UWAGA: Może być konieczne lekkie dociśnięcie, aby upewnić się, że mikrowtryskiwacze nie unoszą się. Bańka powinna równomiernie przesuwać się do przodu i całkowicie wchodzić do mikrowtryskiwacza.
14. Wyjmij mikrowstrzykiwacze z kaniuli i wymień obturatory, po zakończeniu wstrzyknięcia i upływie okresu dyfuzji po wstrzyknięciu.
15. UWAGA: Typowy czas dyfuzji po wstrzyknięciu wynosi 2 – 4 minuty dla odczynników farmakologicznych i 2 – 10 minut dla wirusów. Pozostawienie mikrowstrzykiwacza w okresie po infuzji zapobiega cofaniu się iniekcji z powrotem w górę kaniuli, a nie dyfuzji do tkanki. Umieść obturatory z boku łodzi wagowej wypełnionej etanolem, aby umożliwić odpływ etanolu przed ponownym włożeniem do kaniuli.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rurka kaniuli	Amazon Supply/ Małe części	HTXX-26T-60	26 gauge, Hypotube S / S 316-TW 26GA
Obturator	Amazon Supply/ Małe części	GWXX-0080-30-05	Gauge 33, Drut S / S 316LVM 0,008 IN
Drut mikroiniektora	MicroGroup	33RW 304	33 gauge
Super Glue	Loctite	3924AC	Płyn, nieżelowy, może być autoklawowany
Plastikowe rurki do mikrowtryskiwaczy	Becton Dickson	427406	PE20
Średnia waga Hemostats	World Precision Instruments	501241-G
Linijka	Fisher	09-016	Kleszcze
	150 mmStoelting	52100-77	Dumont, Dumostar
Narzędzie obrotowe	Dremmel	285	Dwubiegowa
tarcza tnąca	McMaster Carr	3602	15/16 "x 0,025"
Pompa mikroiniekcyjna	Aparat Harvard	PhD 2000
1 ul Szklana strzykawka	Hamilton	7001KH	Styl igły: aplikator z bawełnianą końcówką 25 s / 2,75 "/ 3
	Fisher	23-400-101
Chusteczki laboratoryjne	Kimwipes	34133
Oprogramowanie operacyjne	Coulbourn	Graphic State
Operant Chambers	Coulborun	Habitest