$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
- Przygotowanie strzykawki do mikroiniekcji i mikroiniektora do wstrzykiwania:
- Zablokuj każdą gazoszczelną strzykawkę do mikroiniekcji w stojaku pompy do mikroiniekcji.
- Umieść końcówkę gazoszczelnej strzykawki w sterylnej wodzie znajdującej się w małej łódce do ważenia i delikatnie potrząśnij tłokiem, aby nasmarować drut wewnętrzny. Równomiernie pociągnij tłok do ogranicznika na pompie, aby napełnić ją wodą.
- Wsuń rurkę PE20 podłączoną do mikrowstrzykiwacza na igłę 26 G (brązowa piasta) przymocowaną do strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej sterylną wodą. Rozpyl sterylną wodę przez mikrowtryskiwacz i sprawdź wzór i odległość rozpylania.
UWAGA: Woda powinna tryskać bardzo daleko i prosto z końcówki mikrowtryskiwacza. Jeśli strumień nie jest prosty, miejsce wstrzyknięcia nie będzie prawidłowe. - Umieść wysterylizowany mikrowstrzykiwacz na sterylnym polu.
- Zsuń rurkę z igły, trzymając rurkę mikrowtryskiwacza w pozycji pionowej, aby zapobiec kapaniu wody, jednocześnie przecinając rurkę poniżej obszaru uszkodzonego przez igłę.
- Popchnij tłok strzykawki do mikroiniekcji lekko do przodu, aby utworzyć kroplę na końcu igły i wsuń rurkę PE20 wypełnioną wodą (która jest podłączona do mikrowtryskiwacza) na igłę.
UWAGA: Spowoduje to utworzenie połączenia ciecz-ciecz, które umożliwi odpowiednie przeciwciśnienie, które może usunąć zator, który może powstać na końcówce mikrowtryskiwacza. - Popchnij tłok całkowicie do przodu, aby przygotować się do załadowania próbki i upewnić się, że w mikrowtryskiwaczu nie pozostał śladowy ilość etanolu.
- Sprawdź konfigurację pod kątem wycieków, kilkakrotnie dotykając kropli wody, która utworzyła się na końcówce mikrowtryskiwacza, czystą chusteczką laboratoryjną.
- UWAGA: Po dotknięciu chusteczki laboratoryjnej powinna powstać tylko jedna mokra plama. Jeśli kropli jest więcej, oznacza to nieszczelność systemu.
- Unikaj wycieków, kontrolując nakładanie super kleju i przycinając rurkę PE20 ostrymi nożyczkami lub żyletką za każdym razem, gdy rurka PE20 jest wyjmowana z dowolnego połączenia.
- Odciągnąć tłok strzykawki o 0,2 μl, tworząc pęcherzyk między sterylną wodą w wężyku/mikrowstrzykiwaczu PE20 a roztworem, który ma być wstrzykiwany.
- UWAGA: Ten pęcherzyk zapobiega rozcieńczeniu iniekcji, zanieczyszczeniu wody i pozwala na monitorowanie procesu wstrzykiwania, ponieważ będzie się poruszał podczas wstrzykiwania. Należy wytworzyć pojedynczy, stały pęcherzyk.
- Umieścić mikrowstrzykiwacz w odczynniku, który ma być wstrzykiwany, i powoli pociągnąć tłok strzykawki do blokady.
- Przygotowanie zwierzęcia do wstrzyknięcia:
- Przyłóż klatkę piersiową szczura do klatki piersiowej eksperymentatora. Oczyść obszar wokół kaniul bawełnianym aplikatorem nasączonym 70% etanolem (v/v).
- UWAGA: Przy prawidłowym obchodzeniu się z myszami można delikatnie przytrzymać w złożonej dłoni. W przeciwnym razie może być wymagane scruffing.
- Usuń zasłony za pomocą małych kleszczy i umieść je w łodzi wagowej z 70% etanolem (v/v).
- Wykonywanie iniekcji:
- Umieść napełniony mikrowstrzykiwacz w kaniuli. Nacisnąć przycisk start na pompie do mikroiniekcji i monitorować ruch pęcherzyków.
- UWAGA: Może być konieczne lekkie dociśnięcie, aby upewnić się, że mikrowtryskiwacze nie unoszą się. Bańka powinna równomiernie przesuwać się do przodu i całkowicie wchodzić do mikrowtryskiwacza.
- Wyjmij mikrowstrzykiwacze z kaniuli i wymień obturatory, po zakończeniu wstrzyknięcia i upływie okresu dyfuzji po wstrzyknięciu.
- UWAGA: Typowy czas dyfuzji po wstrzyknięciu wynosi 2 – 4 minuty dla odczynników farmakologicznych i 2 – 10 minut dla wirusów. Pozostawienie mikrowstrzykiwacza w okresie po infuzji zapobiega cofaniu się iniekcji z powrotem w górę kaniuli, a nie dyfuzji do tkanki. Umieść obturatory z boku łodzi wagowej wypełnionej etanolem, aby umożliwić odpływ etanolu przed ponownym włożeniem do kaniuli.