$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Kriokonserwacja bloków tkanki korowej
Przygotowanie materiału
- Przygotuj 1X buforowany roztwór soli Hanka (HBSS), rozcieńczając 10-krotny roztwór podstawowy w sterylnej wodzie (1:9). Przechowywać HBSS w temperaturze 4oC.
- Przygotować 10% pożywkę do zamrażania DMSO, rozcieńczając DMSO w HBSS (1:9). Pożywka do zamrażania powinna być przygotowana na świeżo przed krioprezerwacją i przechowywana w temperaturze 4oC do momentu schłodzenia.
- Stalowa żyletka służy do systematycznego siekania tkanek. Przed użyciem żyletka jest sterylizowana przez zanurzenie w 70% etanolu na 2 godziny. Bezpośrednio przed obróbką tkanek opłucz żyletkę sterylną wodą 3 razy. Unikaj pozostawiania maszynki do golenia w sterylnej wodzie przez zbyt długi czas, ponieważ jest ona podatna na utlenianie.
- Pojemnik do zamrażania Nalgene jest ładowany kriowialiami (2,5 ml), a następnie umieszczany w sterylnej komorze biologicznej. Do każdej fiolki dodaje się 1 ml schłodzonego podłoża do zamrażania. Naczynie do zamrażania umieszcza się następnie w temperaturze 4oC na co najmniej 2 godziny.
Czyszczenie, siekanie i zamrażanie
- Tkanka mózgowa, która ma zostać zamrożona, jest oczyszczana z błony oponowej i naczyń krwionośnych. Użyj sterylnych końcówek igieł, aby ostrożnie usunąć zanieczyszczenia z tkanki podczas pracy na okładzie z lodu. Oczyszczoną tkankę należy lekko spłukać zimnym HBSS i przenieść na nową szalkę Petriego w celu siekania.
- Pracując na wierzchu okładu z lodu, użyj wysterylizowanej żyletki, aby szybko posiekać tkankę na bloki o wielkości około 1 mm3. Praca z małymi porcjami oczyszczonej tkanki na raz skutkuje lepszą kontrolą nad procedurą siekania, co skutkuje bardziej jednolitymi rozmiarami bloków.
- Powoli dodaj posiekaną tkankę do 50 ml HBSS w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Delikatnie przepłukać szalkę Petriego HBSS w celu zebrania pozostałych bloków tkanki. Pozwól, aby bloki tkanek opadły na dno probówki, tworząc luźno upakowaną osadkę z bloku tkanki.
- Podczas gdy tkanka osiada, przenieś wcześniej schłodzony pojemnik do zamrażania i kriowiale do komory bezpieczeństwa biologicznego. Odkręć wszystkie kriowiale, aby przyspieszyć proces dodawania tkanki.
- Po ustabilizowaniu się wszystkich bloków tkankowych delikatnie odessaj nadmiar HBSS, pozostawiając bardzo cienką warstwę pożywki nad osadem. Odradza się wirowanie, ponieważ spowoduje to, że bloki tkanek będą się ze sobą przylegać, co znacznie zmniejszy wydajność zamrażania.
- Powoli zebrać 200 μl z dna luźnego osadu tkankowego, używając końcówki pipety z szerokimi otworami (odciąć końcówkę sterylnymi nożyczkami). Przenieś materiał do jednego kriowialnego i przejdź do następnego, ponownie zbierając tkankę z dna osadu. Istotne jest, aby cała procedura alokacji tkanek nie trwała dłużej niż 3-4 minuty na pojemnik do zamrażania. Gwarantuje to, że tkanka jest wystawiona na działanie DMSO tylko przez krótki okres czasu przed zamrożeniem. Po przeniesieniu tkanki do fiolek umieścić pojemnik do zamrażania w temperaturze -80oC na co najmniej 4 godziny. Alternatywnie pojemnik do zamrażania można pozostawić na noc w temperaturze -80 oC. Powtórz ten proces dla wszystkich pozostałych pojemników do zamrażania.
- Przenieść kriowiale z pojemnika(-ów) zamrażającego do krioboxa i umieścić w zbiorniku z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania.
2. Rozmrażanie i hodowla zamrożonych bloków tkanki korowej
Przygotowanie materiału
- Na dzień przed rozmrożeniem próbek tkanek przygotowuje się płytki Petriego/szkiełka nakrywkowe pokryte poli-L-lizyną. Ogólnie rzecz biorąc, dla neuronów korowych przygotowujemy naczynia powlekane o objętości 500 μg / ml lub 1 mg / ml. Dodaj tyle roztworu poli-L-lizyny (przygotowanego w buforze boranowym), aby całkowicie pokryć dno naczynia. Jeśli wymagane są szkiełka nakrywkowe, upewnij się, że są całkowicie zanurzone w roztworze poli-L-lizyny. Inkubować przez co najmniej 12 godzin. Przed użyciem dokładnie spłucz naczynia dużą ilością sterylnej wody 3 razy po 5 minut.
- Ciepły HBSS służy do oczyszczania rozmrożonej tkanki, a także do dysocjacji tkanki na zawiesiny komórkowe. Potrzebna objętość HBSS będzie się różnić w zależności od ilości tkanki do rozmrożenia, ale zazwyczaj 1 kriowial rozcieńcza się w 50 ml HBSS i zostanie zdysocjowany w 10 ml HBSS.
- Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco zawierające 10% surowicy cielęcej bydła (EBS) uzupełnionej żelazem i 1% mieszaniny antybiotyków/antybiotyków (AA) (DMEM(++)) należy umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37°C.
- Podłoże galwaniczne (NB(+++)) powinno być świeże przed użyciem. Pożywkę tę przygotowuje się przez dodanie 1% antybiotyku/antybiotyku oraz suplementów B27 i N2.
Uwaga: Nazwy mediów uzupełnione krzyżykami (+) wskazują na włączenie dodatków do podstawowego składu pożywki. W tym tekście DMEM(++) oznacza DMEM plus 10% EBS plus 1% AA, podczas gdy NB(+++) oznacza NB plus 1% AA plus B27 plus N2.
Rozmrażanie i hodowla
- Wyjąć kriowiale ze zbiornika z ciekłym azotem i szybko rozmrozić w temperaturze 37°C w łaźni wodnej do momentu, aż w zawartości fiolki zaobserwuje się tylko niewielką ilość lodu.
- Delikatnie przenieść zawartość fiolki do 50 ml ciepłego HBSS w stożkowej probówce. Użyj końcówki kryzy z szerokim otworem, aby delikatnie usunąć wszelkie pozostałe bloki tkanki, które utknęły w kriowalu. Odwróć rurkę 3-4 razy i pozwól tkance powoli zebrać się na dnie. Tkanka powinna szybko osiadać, ale jeśli bloki są zbyt małe, może to nie nastąpić i zaleca się lekkie wirowanie (~200 x g).
- Odessać nadmiar HBSS.
- Dodać 10 ml ciepłego HBSS do osadu tkankowego i 300 μl 0,25% trypsyny i 50 μl DNAazy. Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37°C przez 5 minut, a następnie umieścić w wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 80 obr./min i 37°C na dodatkowe 5 minut.
- Po tym okresie przenieś bloki tkanek do komory bezpieczeństwa biologicznego i użyj pipety o pojemności 10 ml, aby ostrożnie wstrząsnąć blokami tkanek, aż utworzy się mętna zawiesina komórek. Dezaktywuj trypsynę, dodając 10 ml ciepłego DMEM (++) do zawiesiny komórek.
- Odwirować zdysocjowane komórki przy 1200 x g przez 5 minut. Odessać i odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml ciepłego DMEM (++) i określić ilościowo liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
- Płytki komórkowe na naczyniach pokrytych poli-L-lizyną. Zazwyczaj szalka o średnicy 60 mm będzie pokryta6 komórkami 1x10.
- Pozostawić komórki do przyczepienia się do naczynia/szkiełek nakrywkowych na około 1 godzinę w inkubatorze do hodowli tkankowych. Zaleca się monitorowanie postępu mocowania w jednej płytce co 10 minut, aż do momentu zaobserwowania skutecznego mocowania. Następnie delikatnie zastąp pożywkę świeżym DMEM (++).
- Po 24 godzinach wymień DMEM(++) na ciepły NB(+++). Częściowe zmiany podłoża (50%) przeprowadza się co 5 dni ze świeżym NB(+++). Zdrowe kultury zwykle wykazują oznaki różnicowania i wzrostu procesów po 24 godzinach. W tych warunkach i wykonując częściowe zmiany pożywki co 4-5 dni, kultury mogą być utrzymywane przez dłuższy czas do 4-6 tygodni.
- Do generowania neuronalnych komórek prekursorowych (NPC) stosuje się podobny protokół, z wyjątkiem tego, że po odwirowaniu stosuje się DMEM bez EBS. Komórki są siane w kolbach T-25 w DMEM/F12 (1:3) uzupełnionym B27 i EGF (20 ng / ml), aby umożliwić tworzenie neuroferów. Aby odróżnić NPC, neurosfery są powlekane na szkiełkach nakrywkowych pokrytych lamininą (10 ug/ml) w pożywce DMEM/F12 (1:3) uzupełnionej N2.
3. Reprezentatywne wyniki
Zdrowe kultury wykazują znaczny wzrost i zróżnicowanie po 5 dniach od rozmrożenia i zazwyczaj stabilizują swój wzrost po 10 dniach (Rysunek 1). Barwienie immunkocytochemiczne tych kultur ujawnia liczne astrocyty (ryc. 2A) i neurony (ryc. 2B) zarówno dla pierwotnych kultur neuronalnych ludzi, jak i szczurów. Protokół ten nadaje się również do generowania NPC jako swobodnie unoszących się neurosfer (ryc. 3A), które w zróżnicowanych warunkach dają wysokiej jakości kultury mieszane (ryc. 3B,C).
Rysunek 1. Hodowle komórkowe zamrożonej ludzkiej tkanki korowej. Zamrożone bloki ludzkiej tkanki korowej są rozmrażane i powlekane na szkiełkach nakrywkowych pokrytych polilizyną i hodowane przez 10 dni. W 5 dniu ekspansja komórek jest widoczna, a w 10 dniu osiąga się konfluencję. Podziałka: 100 μm.
Rysunek 2. Barwienie immunocytochemiczne kultur komórkowych. (A) Kultury barwiono markerem glejowym kwaśnym białkiem fibrylarnym gleju (GFAP, grube strzałki). (B) Neurony wykryto za pomocą markera neuronalnego beta-tubuliny III (TIII, cienkie strzałki). (C) Zarówno kultury ludzkie, jak i szczurów wykazują obfite glej i neurony po 10 dniach w hodowli. Przeciwciała pierwszorzędowe: mysi anty-GFAP (1:1000) i króliczy anty-TIII (1:1000). Przeciwciała drugorzędowe: anty-mysz Alexa 594 (1:500) i anty-królik Alexa 488 (1:500). Barwienie jąder: Hoestch niebieski (1:1000). Podziałka: 50 μm.
Rysunek 3. Generowanie neurosfer. (A) Zamrożoną tkankę przetworzono w sposób opisany powyżej i pozwolono jej rozmnażać się jako neurosfery. (B) Neurosfery zostały posiane na szklanych szkiełkach nakrywkowych w zróżnicowanych warunkach i hodowane przez 10 dni, w wyniku czego komórki migrowały z neurosfery. (C) Zarówno neurony, jak i astrocyty są obecne w rozszerzającym się prążku różnicującej się neurosfery. Przeciwbarwienie jądrowe, przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe stosowane jak na ryc. 2.