W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę efektywnej kriokonserwacji i rozmrażania bloków tkanki kory mózgu w celu uzyskania silnie wzbogaconych kultur neuronalnych. Ten prosty protokół zapewnia elastyczność przy późniejszym generowaniu kultur neuronów, astrocytów oraz komórek prekursorowych neuronów.
Artykuł metodologiczny
Kriokonserwacja bloków tkanki kory mózgowej w celu generowania silnie wzbogaconych kultur neuronalnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W niniejszym badaniu przedstawiamy zestandaryzowany protokół skutecznej kriokonserwacji i rozmrażania bloków tkanki kory mózgu w celu generowania silnie wzbogaconych kultur neuronalnych. W tym protokole jako medium do mrożenia zastosowano 10% dimetylosulfoksyd (DMSO) rozcieńczony w buforze Hanksa (HBSS). Bloki tkanki korowej przeniesiono do krioprobówek zawierających medium do mrożenia i powoli zamrożono w tempie -1°C/min w pojemniku do mrożenia z kontrolowaną szybkością spadku temperatury. Przetwarzanie po rozmrożeniu i dysocjacja zamrożonych bloków tkankowych konsekwentnie pozwalały na uzyskanie kultur wzbogaconych w neurony, które wykazywały szybki wzrost neurytowy w ciągu pierwszych 5 dni hodowli oraz znaczną ekspansję sieci neuronalnej w ciągu 10 dni. Barwienie immunocytochemiczne z użyciem markera astrocytarnego – białka kwaśnego włókienka gliaz (GFAP) – oraz markera neuronalnego – beta-tubuliny klasy III, wykazało wysoką liczbę neuronów i astrocytów w kulturach. Generowanie kultur komórek prekursorowych neuronów po dysocjacji bloków tkankowych doprowadziło do powstania szybko rozwijających się neurosfer, które w warunkach różnicowania wytworzyły liczne neurony i astrocyty. Ten prosty protokół kriokonserwacji umożliwia szybkie, wydajne i niedrogie przechowywanie bloków tkanki kory mózgu, co zapewnia większą elastyczność przy późniejszym generowaniu kultur neuronów, astrocytów i komórek prekursorowych neuronów.
Protokół
1. Kriokonserwacja bloków tkanki kory
Przygotowanie materiałów
- Przygotuj 1X zbuforowany roztwór soli Hanksa (HBSS), rozcieńczając 10X roztwór zapasowy w wodzie sterylnej (1:9). Przechowuj HBSS w temperaturze 4°C.
- Przygotuj 10% medium do mrożenia DMSO, rozcieńczając DMSO w HBSS (1:9). Medium do mrożenia powinno zostać przygotowane bezpośrednio przed kriokonserwacją i przechowywane w temperaturze 4°C do momentu schłodzenia.
- Do systematycznego siekania tkanki należy użyć stalowego ostrza do golenia. Przed użyciem ostrze sterylizuje się poprzez zanurzenie w 70% etanolu na 2 h. Bezpośrednio przed obróbką tkanki trzykrotnie opłucz ostrze wodą sterylną. Unikaj pozostawiania ostrza w wodzie sterylnej przez zbyt długi czas, ponieważ jest ono podatne na utlenianie.
- Pojemnik do mrożenia Nalgene należy wypełnić kriotubkami (2,5 mL), a następnie przenieść do sterylnej komory biologicznej. Do każdej probówki dodaje się 1 mL schłodzonego medium do mrożenia. Następnie pojemnik do mrożenia umieszcza się w temperaturze 4°C na co najmniej 2 h.
Czyszczenie, siekanie i mrożenie
- Tkankę mózgu przeznaczoną do mrożenia należy oczyścić z błon oponowych i naczyń krwionośnych. Używając sterylnych końcówek do igieł, ostrożnie usuń zanieczyszczenia z tkanki, pracując na wkładce chłodzącej. Oczyszczoną tkankę należy lekko przepłukać zimnym HBSS i przenieść do nowej szalki Petriego w celu posiekania.
- Pracując na wkładce chłodzącej, użyj wysterylizowanego ostrza żyletki, aby szybko posiekać tkankę na bloki o rozmiarach około 1 mm3. Praca z małymi porcjami oczyszczonej tkanki na raz zapewnia lepszą kontrolę nad procedurą siekania, co pozwala uzyskać bardziej jednorodne rozmiary bloków.
- Powoli przenieś posiekaną tkankę do 50 mL HBSS w probówce stożkowej o pojemności 50 mL. Delikatnie wypłucz szalkę Petriego za pomocą HBSS, aby zebrać wszystkie pozostałe bloki tkanki. Pozostaw bloki tkanki, aż opadną na dno probówki, tworząc luźny osad bloków tkankowych.
- Podczas osiadania tkanki, przenieś wcześniej schłodzony pojemnik do mrożenia oraz krioprobówki do komory bezpieczeństwa biologicznego. Otwórz wszystkie krioprobówki, aby przyspieszyć proces dodawania tkanki.
- Po osadzeniu się wszystkich bloków tkanki, delikatnie odessaj nadmiar HBSS, pozostawiając bardzo cienką warstwę medium nad osadem. Odradza się wirowanie, ponieważ spowoduje ono przyleganie bloków tkanki do siebie, co znacznie obniży efektywność mrożenia.
- Powoli pobierz 20 μL z dna luźnego osadu bloków tkankowych, używając końcówki pipety z szerokim otworem (odciętej sterylnymi nożyczkami). Przenieś materiał do jednej krioprobówki i przejdź do następnej, ponownie pobierając tkankę z dna osadu. Niezbędne jest, aby cała procedura rozdziału tkanki nie trwała więcej niż 3-4 min na jeden pojemnik do mrożenia. Zapewnia to, że tkanka jest wystawiona na działanie DMSO tylko przez krótki czas przed zamrożeniem. Po przeniesieniu tkanki do probówek, umieść pojemnik do mrożenia w zamrażarce -80oC na co najmniej 4 godz. Alternatywnie, pojemnik do mrożenia można pozostawić na noc w temperaturze -80 oC. Powtórz ten proces dla wszystkich pozostałych pojemników do mrożenia.
- Przenieś krioprobówki z pojemnika (pojemników) do mrożenia do krioboksu i umieść w zbiorniku z ciekłym azotem do długoterminowego przechowywania.
2. Rozmrażanie i hodowla zamrożonych bloków tkanki korowej
Przygotowanie materiałów
- Na jeden dzień przed rozmrożeniem próbek tkanek, poly-L– przygotowuje się szalki Petriego/szkiełka podstawowe powlekane lizyną. W przypadku neuronów korowych zazwyczaj przygotowujemy powlekane szalki z 500 μg/ml lub 1 mg/ml. Dodać odpowiednią ilość poli-L-roztwór lizyny (przygotowany w buforze boratowym), aby całkowicie zakryć dno naczynia. Jeśli wymagane jest użycie szklanych lamelki, należy upewnić się, że są one całkowicie zanurzone w roztworze poli-Lroztwór lizyny. Inkubować przez co najmniej 12 h. Przed użyciem dokładnie wypłukać szalki obfitą ilością sterylnej wody 3 razy, przez 5 min za każdym razem.
- Do oczyszczania rozmrożonej tkanki, a także do jej dysocjacji w celu uzyskania zawiesin komórkowych, stosuje się ocieplony HBSS. Wymagana objętość HBSS różni się w zależności od ilości rozmrażanej tkanki, jednak zazwyczaj jedną krioprobetkę rozcieńcza się w 50 mL HBSS i dysocjuje w 10 mL HBSS.
- podłoże Dulbecco's Modified Eagle Medium z dodatkiem 10% serum cielęcego wzbogaconego żelazem (EBS) i 1% mieszanki antybiotyków i antymikotyków (AA) (DMEM(++)) należy umieścić w 37°C łaźnia wodna
- Pożywka do wysiewania (NB(+++)) powinna być przygotowana bezpośrednio przed użyciem. Pożywkę tę sporządza się poprzez dodanie 1% antybiotyku/antymykotyku oraz suplementów B27 i N2.
Uwaga: Nazwy pożywek z dopisanymi krzyżykami (+) wskazują na dodatek substancji pomocniczych do składu podstawowego pożywki. W niniejszym tekście DMEM(++) oznacza DMEM oraz 10% EBS oraz 1% AA, natomiast NB(+++) oznacza NB oraz 1% AA oraz B27 oraz N2.
Rozmrażanie i hodowla
- Wyjmij krioprobówki z pojemnika z ciekłym azotem i szybko rozmroź w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C, aż wewnątrz probówki pozostanie jedynie niewielka grudka lodu.
- Ostrożnie przenieś zawartość probówki do 50mL ciepłego HBSS w probówce stożkowej. Użyj końcówki o szerokim otworze, aby delikatnie usunąć wszelkie pozostałe fragmenty tkanki przyklejone do ścianek krioprobówki. Odwróć probówkę 3-4 razy i pozwól tkance powoli opaść na dno. Tkanka powinna osiaść szybko, ale jeśli fragmenty są zbyt małe, może tak się nie stać i zaleca się lekkie wirowanie (~20 x g).
- Odsakcyj nadmiar HBSS.
- Dodaj do osadu tkankowego 10 mL ciepłego HBSS, 300 μL 0,25% trypsyny oraz 50 μL DNAazy. Inkubuj w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez 5 min, następnie umieść w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną ustawionej na 80 rpm i 37°C przez kolejne 5 min.
- Po tym czasie przenieś fragmenty tkanki do komory bezpiecznej biologicznie i za pomocą pipety 10 mL ostrożnie wymieszaj fragmenty tkanki, aż powstanie mętna zawiesina komórkowa. Zneutralizuj trypsynę, dodając 10 mL ciepłego DMEM(++) do zawiesiny komórkowej.
- Odwiruj rozdzielone komórki przy 1200 x g przez 5 min. Odsakcyj i odrzuć nadsącz, resuspenduj osad komórkowy w 10 mL ciepłego DMEM(++) i określ liczbę komórek za pomocą komory countingowej (hemocytometru).
- Wysiej komórki na płytki powlekane poli-L-lizyną. Zazwyczaj na płytce 60-mm wysiewa się 1x106 komórek.
- Pozostaw komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych na około 1 h, aby przyłączyły się do płytki/szkiełek podstawowych. Zaleca się monitorowanie procesu przyłączania na jednej płytce co 10 min, aż do uzyskania skutecznej adhezji. Następnie delikatnie wymień medium na świeży DMEM(++).
- Po 24 h zastąp DMEM(++) ciepłym NB(+++). Częściowe wymiany medium (50%) wykonuje się co 5 dni przy użyciu świeżego NB(+++). Zdrowe kultury zazwyczaj wykazują oznaki różnicowania i wzrostu wypustek po 24 h. W tych warunkach, przy dokonywaniu częściowych wymian medium co 4-5 dni, kultury można utrzymywać przez dłuższy czas, aż do 4-6 tygodni.
- W celu generowania neuronalnych komórek prekursorowych (NPCs) stosuje się podobny protokół, z wyjątkiem tego, że po wirowaniu używa się DMEM bez EBS. Komórki wysiewa się do kolb T-25 w medium DMEM/F12 (1:3) uzupełnionym o B27 i EGF (20 ng/ mL), aby umożliwić tworzenie neurosfer. Aby zróżnicować NPCs, neurosfery wysiewa się na szkiełka podstawowe powlekane lamininą (10 ug/ mL) w medium DMEM/F12 (1:3) uzupełnionym o N2.
3. Reprezentatywne wyniki
Zdrowe hodowle wykażą znaczący wzrost i różnicowanie 5 dni po rozmrożeniu i zazwyczaj ustabilizują swój wzrost do 10. dnia (Rycina 1). Barwienie immunocytochemiczne tych hodowli ujawnia liczne astrocyty (Rycina 2A) i neurony (Rycina 2B) zarówno w przypadku pierwotnych hodowli neuronalnych ludzkich, jak i szczurzych. Niniejszy protokół nadaje się również do generowania NPC w formie wolno pływających neurosfer (Rycina 3A), które w warunkach różnicowania prowadzą do powstania wysokiej jakości hodowli mieszanych (Rycina 3B,C).
Rycina 1. Hodowle komórkowe z zamrożonej tkanki kory mózgu człowieka. Zamrożone bloki tkanki kory mózgu człowieka poddano rozmrażaniu, a następnie wyłożono na szkiełka podstawkowe pokryte poli-lizyną i hodowano przez 10 dni. W 5. dniu widoczna była ekspansja komórek, a w 10. dniu osiągnięto pełną konfluencję. Pasek skali: 100 μm.
Rysunek 2. Barwienie immunocytochemiczne kultur komórkowych. (A) Hodowle zabarwiono markerem glejowym – gliałkowym kwaśnym białkiem włókienstym (GFAP, grube strzałki). (B) Neurony wykryto za pomocą markera neuronalnego – beta-tubuliny III (TIII, cienkie strzałki). (C) Zarówno hodowle ludzkie, jak i szczurze wykazują obfitą obecność gleju i neuronów po 10 dniach hodowli. Przeciwciała pierwotne: mysie anty-GFAP (1:10) i królicze anty-TIII (1:100). Przeciwciała wtórne: anty-mysie Alexa 594 (1:50) i anty-królicze Alexa 48 (1:50). Barwienie jąder: błękitny Hoechst (1:100). Pasek skali: 50 μm.
Rysunek 3. Generowanie neurosfer. (A) Zamrożone tkanki przetworzono zgodnie z powyższym opisem i przeprowadzono ich propagację w formie neurosfer. (B) Neurosfery wysiano na szkiełka podstawkowe w warunkach różnicowania i hodowano przez 10 dni, co doprowadziło do migracji komórek z neurosfery. (C) Zarówno neurony, jak i astrocyty występują w rozszerzającym się obrzeżu różnicującej się neurosfery. Barwienie kontrastowe jąder oraz przeciwciała pierwotne i wtórne zastosowano tak jak na Rys. 2.
Dyskusja
Kriokonserwacja daje możliwość bankowania cennych próbek tkanki mózgowej do przyszłego wykorzystania. Opisujemy tutaj prosty, ale skuteczny protokół generowania zarówno kultur wzbogaconych w neurony, jak i neuronalnych komórek prekursorowych z zamrożonych bloków tkanki mózgowej. Ta ekonomiczna procedura pozwala uniknąć kosztów tradycyjnych technik kriokonserwacji, które wykorzystują droższe zamrażarki z kontrolowaną szybkością chłodzenia. Protokół umożliwia uzyskanie żywotnych kultur neuronalnych po rozmrażaniu, zapewniając szybki i skuteczny sposób zamrażania bloków tkankowych. Cały proces zamrażania może trwać zaledwie 20 minut. Oprócz pierwotnych kultur neuronalnych, z wykorzystaniem tej metody bloki tkankowe można rozmrażać w celu uzyskania NPC hodowanych jako wolno pływające neurosfery. W tym względzie brak surowicy w naszym medium do zamrażania zapewnia zachowanie komórek w stanie niedróżnicowanym. W warunkach różnicowania neurosfery wytworzone z zamrożonej tkanki wykazują tempo ekspansji i różnicowania bardzo zbliżone do neurosfer generowanych z tkanki świeżej.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Badania te były wspierane przez granty z programu Undergraduate Research Opportunities Program na UCI (A.R. i S.P.) oraz granty z State of California Alzheimer's Disease Initiative i National Institutes of Health nr HD38466, a także grant z Alzheimer's Disease Research Center nr AG16573 (J.B.)
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Dulbecco’podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Invitrogen | 11995-073 | Wysoka zawartość glukozy 1X |
| surowica cielęca bydlęca z dodatkiem | Hyclone | SH30072.03 | Do pożywki hodowlanej |
| Pożywka Neurobasal-A (1X), płynna | Invitrogen | 1088-022 | |
| Suplement B27 | Invitrogen | 17504-044 | Suplement do pożywki Neurobasal |
| Suplement N2 | Invitrogen | 17502-048 | Suplement do pożywki Neurobasal |
| Trypsyna (10X) | Cellgro | 25-054CI | Dysocjacja tkanki |
| Deoksiribonukleaza 1 z trzustki bydlęcej (DNaza) | Sigma-Aldrich | D4527-30KU | Dysocjacja tkankowa |
| Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) (10X) | GIBCO, by Life Technologies | 14065 | Oczyszczanie tkanki, płukanie i medium do mrożenia |
| poli-L-lizyna- 500 mg | Invitrogen | P2636 | Podłoże do adhezji komórek neuronalnych |
| antybiotyk-antymykotyk (100X), roztwór | Invitrogen | 15240-062 | Aby zapobiec kontaminacji |
| Nawki do pipet z szerokim otworem (1-200 µl) | Fisher Scientific | 02-681-141 | Aby zapobiec naprężeniom ścinającym komórek |
| Graduowane końcówki do pipet (101-1000 ul) | USA Scientific, Inc. | 1111-2721 | |
| precyzyjne igły prowadzące G1 21 G | BD Biosciences | 305165 | Oczyszczanie tkanki |
| pipeta 10 ml | USA Scientific, Inc. | 1071-0810 | Opakowane indywidualnie |
| probówki 50 ml | USA Scientific, Inc. | 926-9-04 | |
| Jednostronne ostrze do żyletek | Smith & Nephew Inc. | 67-0238 | Rozdrabnianie tkanki |
| szalka Petri z polistyrenu 60 x 15 mm | USA Scientific, Inc. | 8609-0160 | Do hodowli ogólnej |
| szalka Petri z polistyrenu 100 x 15 mm | USA Scientific, Inc. | 8609-0010 | Do oczyszczania tkanek |
| Pojemnik kriogeniczny | Nalge Nunc international | 5026-1010 | |
| Pojemnik do mrożenia | Nalge Nunc international | 5100-0001 | "Mr. Frosty" |
| probówki kriogeniczne 2,0 ml | Nalge Nunc international | 5012-0020 | |
| DMSO | Fisher Scientific | D128-500 | Do medium do mrożenia |
| Etanol 200 proof | Sigma-Aldrich | E7023 | Do sterylizacji żyletki |
Bibliografia
- Robbins, R. J. Cryopreservation of human brain tissue. Exp Neurol. 107, 208-213 (1990).
- Ware, C. B., Nelson, A. M., Blau, C. A. Controlled-rate freezing of human ES cells. Biotechniques. 38, 879-880 (2005).
- Paynter, S. J. Principles and practical issues for cryopreservation of nerve cells. Brain Res Bull. 75, 1-14 (2008).
- Thirumala, S., Gimble, J. M., Devireddy, R. V. Cryopreservation of stromal vascular fraction of adipose tissue in a serum-free freezing medium. J Tissue Eng Regen Med. 4, 224-232 (2010).
Przedruki i uprawnienia
