Stymulacja nerwu błędnego za pomocą przewlekle wszczepionych elektrod mankietowych nerwów obwodowych u szczurów

Streszczenie

Źródło: Sanchez, CA i wsp. Przygotowanie elektrod do stymulacji nerwów obwodowych do przewlekłej implantacji u szczurów. J. Vis. Exp. (2020).

Ten film pokazuje stymulację nerwu błędnego u obudzonego szczura. Szczur z wszczepioną przewlekłą elektrodą mankietową nerwu obwodowego i przeszkolony w zadaniu naciskania dźwigni jest podłączony do generatora bodźców za pomocą wszczepionej nasadki na głowę. Nerw błędny jest stymulowany natychmiast po każdym udanym naciśnięciu dźwigni, co powoduje rozszerzenie mapy motorycznej.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Stymulowanie produkcji elektrod mankietowych

1. Przygotuj rurkę mankietu.
   1. Za pomocą żyletki wytnij kawałek polimerowej rurki o długości 2,5 mm. Włóż końcówki kleszczyków lub spinacz do papieru przez rurkę i użyj ostrza, aby zrobić nacięcie wzdłuż przez ściankę rurki po jednej stronie mankietu.
   2. Zdejmij kleszcze z rurki i włóż dużą igłę do szycia przez linię środkową mankietu, prostopadle do długiej osi. Włóż igłę przez szczelinę (na górze) i do środka rurki po przeciwnej stronie (na dole). Umieść igłę w płycie piankowej, aby przypiąć mankiet na miejscu podczas pozostałych etapów montażu.
2. Umieść szew, aby zabezpieczyć zamknięcie mankietu podczas implantacji.
   1. Wprowadź małą igłę do szycia przez ściankę mankietu, na linii środkowej, około 0,5 mm od górnego rozcięcia po jednej stronie. Włóż igłę od wewnątrz na zewnątrz, aby uniknąć uszkodzenia rurki mankietu. Przełóż szew 6/0 o długości 2 cm przez oczko igły i przeciągnij igłę przez ściankę rurki, aby wkręcić szew do mankietu.
   2. Pozostawiając nić na miejscu, wyjmij igłę i przebij drugi otwór przez ściankę rurki około 0,5 mm poniżej pierwszego otworu, wzdłuż linii środkowej mankietu. Wprowadzić szew przez oczko igły i przeciągnąć igłę przez ściankę rurki, aby ponownie przewlec szew przez mankiet.
   3. Oba końce nici do szwów powinny teraz znajdować się po zewnętrznej stronie mankietu. Wyreguluj szew tak, aby ~1,5 cm wystawało z górnego otworu i ~0,5 mm wystawało z dolnego otworu.
   4. Nałóż niewielką ilość kleju utwardzanego promieniami UV (ultrafiolet) na krótki koniec szwu wychodzący z dolnego otworu i pociągnij dłuższy koniec szwu, aż dolny ogon będzie prawie równy z zewnętrzną ścianą rurki. Użyj różdżki UV, aby utwardzić klej i mocno przytrzymać szew na miejscu.
   5. Powtórz kroki od 1.2.1 do 1.2.3 po przeciwnej stronie mankietu.
3. Umieść przewody Platinum:Iridium (Pt:Ir).
   1. Użyj małej igły do szycia, aby zrobić 4 otwory w ścianie mankietu. Każda para otworów powinna być umieszczona około 0,5–0,8 mm od prostopadłej linii środkowej, z otworem około 0,5–0,8 mm od górnej szczeliny po obu stronach mankietu.
      UWAGA: Aby uzyskać najbardziej spójne i dokładne rozmieszczenie przewodów, włóż igłę od wewnątrz na zewnątrz, aby wykonać wszystkie otwory, Używanie umieszczenia szwów jako przewodnika.
   2. Ponownie włóż igłę do szycia, tym razem pracując od zewnątrz do wewnątrz przez ołowiany otwór 1. Przełóż około 0,5 cm drutu Pt:Ir o długości 7,5 cm przez oczko igły i przeciągnij igłę przez rurkę, aby przewlec przewód przez ściankę mankietu. Wyreguluj drut tak, aby ~4.5 cm wystawało na zewnątrz mankietu (Rysunek 1A).
   3. Ponownie włóż igłę przez otwór ołowiany 1, ponownie pracując od zewnątrz do wewnątrz, a dodatkowo włóż igłę przez otwór ołowiany 2 bezpośrednio naprzeciwko otworu ołowianego 1. Włóż ~ 0,5 cm krótszego (wewnętrznego) końca drutu Pt: Ir przez oczko igły i przeciągnij igłę przez rurkę, aby przewlec przewód drutu przez ścianki mankietu.
      UWAGA: Oba końce drutu Pt: Ir powinny teraz znajdować się po zewnętrznej stronie mankietu, a wokół krawędzi szczeliny i przez otwór ołowiany 1 tworzy się pętla z drutu (Rysunek 1B).
   4. Powtórz kroki od 1.3.1 do 1.3.3, aby umieścić drut Pt:Ir przez otwory ołowiane 3 i 4.
   5. Używając zapalniczki butanowej, ostrożnie usuń izolację z długości 5–6 mm na końcu przewodów Pt:Ir wychodzących z otworu ołowianego 2 i otworu ołowianego 4.
      UWAGA: Ostrożnie odizoluj końce przewodów od reszty zespołu mankietu, aby uniknąć uszkodzenia mankietu. Użyj narzędzi do przytrzymania przewodów, aby uniknąć obrażeń.
   6. Dopasuj nieizolowany drut wewnątrz mankietu, aby umieścić przewody w ich ostatecznych miejscach. Aby to zrobić, delikatnie pociągnij za koniec przewodu Pt:Ir rozciągającego się od otworu 1, aż nieizolowana część przewodu zrówna się z otworem 1. Powtórz z drugim przewodem, aby wyrównać nieizolowany koniec drutu przewleczonego przez otwory ołowiane 3 i 4.
   7. Nałóż niewielką ilość kleju utwardzanego promieniami UV na druciane pętle po zewnętrznej stronie mankietu w otworach ołowianych 1 i 3. Użyj różdżki UV, aby utwardzić klej i zabezpieczyć przewody na miejscu.
   8. Użyj małej końcówki do pipety, aby docisnąć nieizolowane przewody Pt:Ir do wewnętrznej ścianki mankietu. Po umieszczeniu przewodów na miejscu odetnij końce przewodów wystających z otworów ołowianych 2 i 4 tak, aby około 1 mm drutu wystawało poza zewnętrzną stronę ścianki mankietu.
   9. Złóż 1 mm końcówki drutu płasko do zewnętrznej powierzchni mankietu, uważając, aby nie skrócić ich razem. Nałóż niewielką ilość kleju utwardzanego promieniami UV, aby pokryć tylko dwa ogony i utwardzić klej, aby zabezpieczyć umieszczenie przewodu i zapewnić izolację elektryczną.
      UWAGA: Ważne jest, aby całkowicie pokryć odsłonięte na zewnątrz powierzchnie Pt:Ir klejem, aby zaizolować przewody i uniknąć stymulacji poza celem.
4. Zabezpiecz przewody druciane Pt:Ir na miejscu za pomocą zabezpieczenia szwów.
   1. Wyjmij dużą igłę z zespołem mankietu z płyty piankowej. Przełóż szew 6/0 o długości 3 cm przez oczko igły i przeciągnij igłę przez rurkę, aby przewlec szew przez dolną część mankietu w punkcie środkowym.
   2. Przełącz się na małą igłę do szycia, aby zakończyć nawlekanie szwów w celu zabezpieczenia ołowiu Pt:Ir. Włóż igłę przez ten sam otwór w linii środkowej, ponownie pracując od wewnątrz na zewnątrz, aby uniknąć deformacji rurki i przewodów. Włóż zewnętrzny ogon szwu przez oczko igły i przeciągnij igłę przez ścianę mankietu, aby utworzyć pętlę szwu wokół krawędzi mankietu (Rysunek 1C).
      UWAGA: Użyj kleszczyków i pracuj pod mikroskopem, aby upewnić się, że szew jest zorientowany wzdłuż długiej osi mankietu i leży płasko na rurce. Ten krok zapewnia, że przewody pozostają oddzielone po wewnętrznej stronie mankietu i są utrzymywane na miejscu po boku linii środkowej mankietu.
   3. Utwórz drugą pętlę wokół przeciwległego końca mankietu, wiążąc końce szwu w pół węzła, po zewnętrznej stronie mankietu. Upewnij się, że szew biegnie wzdłuż długiej osi mankietu i przylega płasko do rurki. Trzymając węzeł mocno, tak aby przylegał płasko do rurki, nałóż niewielką ilość kleju utwardzanego promieniami UV na pół węzła i utwardź, aby utrzymać go na miejscu.
   4. Ostrożnie odetnij końce nici do szwu jak najbliżej węzła. W razie potrzeby użyj niewielkiej ilości dodatkowego kleju utwardzanego promieniami UV, aby przykleić krótkie końce szwu tak, aby przylegały płasko do rurki (ryc. 1D).
5. styki złącza do przewodów Pt:Ir.
   1. Używając zapalniczki butanowej, usuń izolację z ~3 mm na końcu każdego z przewodów Pt:Ir. stronę miseczki złotego kołka (patrz Tabela materiałów) do nieizolowanego końca każdego przewodu.
6. Sprawdź impedancję zmontowanego urządzenia.
   1. Podłącz złote piny do wejść miernika LCR (indukcyjność (L), pojemność (C) i rezystancja (R)) lub modułu sprawdzającego impedancję elektrody i ustaw częstotliwość testową na 1 kHz. Zanurz rurkę mankietu (i styki stymulacji Pt:Ir wewnątrz mankietu) w małej zlewce wypełnionej solą fizjologiczną, uważając, aby złote styki ołowiane i złącza sondy były suche. Przed przystąpieniem do implantacji sprawdź, czy zmontowany mankiet ma impedancję przy 1 kHz mniejszą niż 2 kΩ.
      UWAGA: Wysoka impedancja często wskazuje na niewystarczającą powierzchnię Pt:Ir odsłoniętą, która może powstać z powodu takich czynników, jak niewystarczające usunięcie izolacji, przypadkowe nałożenie kleju we wnętrzu mankietu, zerwane pasma drutu, itd. Mankiety należy również sprawdzić pod kątem pękniętych lub źle ułożonych pasm drutu, które mogą skutkować zwarciem styków przy długotrwałym użytkowaniu.

2. Konstrukcja nasadki

na głowę UWAGA: Procedury montażu nasadki są podobne do tych opublikowanych wcześniej i zostały podsumowane tutaj dla wygody.

1. Złóż nasadkę głową
   1. Wytnij dwa małe kawałki drutu 30 AWG (American Wire Gauge), jeden o długości ~13 mm i jeden o długości ~10 mm. Zdejmij ~1,5 mm izolacji z każdego końca obu przewodów. stronę bolca złotego kołka do jednego końca każdego drutu, jak najbliżej kubka. Użyj nożyc do drutu, aby odciąć nadmiar długości kołka poza złączem lutowanym.
   2. drugie końce przewodów AWG do dwóch środkowych miseczek lutowniczych 4-pinowego złącza mikropaskowego.
   3. Zegnij nasadkę przewodu prowadzącą w górę w kierunku złącza i umieść złote kołki płasko na złączu, równolegle do siebie, jak pokazano na rysunku 2A. Kołek połączony z krótszym przewodem należy umieścić poniżej kołka połączonego z dłuższym przewodem. Użyj akrylu do paznokci, cementu dentystycznego lub kleju utwardzanego promieniami UV, aby zabezpieczyć przewody nasadki na miejscu.

3. Użytkowanie urządzenia

1. Wszczepij elektrody mankietu w celu przewlekłej stymulacji nerwu błędnego.
   UWAGA: Wszystkie zabiegi chirurgiczne powinny być wykonywane przy użyciu sterylnej lub aseptycznej techniki w odpowiednim znieczuleniu, zgodnie z wytycznymi NIH (National Institutes of Health) dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych oraz z lokalną aprobatą IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee). Poniższe procedury mają na celu zilustrowanie reprezentatywnego użytkowania urządzenia i nie mają charakteru wyczerpującego.
   1. Umieść szczura w stereotaktycznej ramie i wykonaj strzałkowe nacięcie nad kośćmi ciemieniowymi i potylicznymi, aby odsłonić powierzchnię czaszki do wszczepienia nasadki na głowę/łącznika. Ostrożnie wywierć 4 otwory w czaszce i umieść jubilera. Użyj akrylu dentystycznego, aby przymocować nasadkę do czaszki i.
   2. Wyjmij szczura z ramy stereotaktycznej i połóż go na prawym boku. Wykonaj pionowe nacięcie w skórze po lewej stronie szyi i ostrożnie wypreparuj lewy nerw błędny z tętnicy szyjnej, znajdującej się między mięśniami mostkowo-sutkowymi i mostkowo-gnykowymi oraz pod mięśniem omohyoidalnym.
   3. Tunel mankietu prowadzi podskórnie w kierunku czaszki. Podłącz przewody do nasadki za pomocą złotych pinów.
   4. Umieść nerw błędny wewnątrz mankietu i zabezpiecz urządzenie zamknięte, zawiązując podwójny węzeł w szwach mankietu. Należy uważać, aby uniknąć uszkodzenia nerwu podczas implantacji poprzez manipulowanie nerwem za pomocą, nieprzewodzących haczyków lub chwytanie tkanki łącznej otaczającej nerw.
   5. Przetestuj implant, stosując stymulację urządzenia (10 s ciągu 0,8 mA, 30 Hz, 100 μs impulsy dwufazowe). Właściwa implantacja spowoduje zaprzestanie oddychania i spadek SpO₂ (nasycenie tlenem w kapilarach obwodowych) o 5% lub więcej.
   6. Przykryj złote szpilki i odsłonięte przewody akrylem dentystycznym, zamknij rany szwami i oczyść miejsca nacięć solą fizjologiczną, alkoholem i roztworem jodu powidonu.
   7. Zapewnij płyny zastępcze, leki przeciwbólowe i opiekę pooperacyjną zgodnie z wytycznymi NIH i aprobatą IACUC.
2. Stymuluj nerw błędny podczas czuwania.
   UWAGA: Wcześniej wykazano, że dostarczanie VNS (stymulacji nerwu błędnego) podczas wykonywania przez zwierzęta określonych zadań motorycznych rozszerza reprezentację mapy motorycznej mięśni istotnych dla zadania. Używamy tego zwalidowanego paradygmatu, aby zapewnić reprezentatywny przykład użycia urządzenia, ale wiele innych paradygmatów behawioralnych i/lub parametrów stymulacji może być istotnych dla alternatywnych zastosowań. Szczury zostały przeszkolone, aby były biegłe w zadaniu wyciskania dźwigni używanym tutaj przed implantacją urządzenia. Po operacji dobre wyniki zostały ponownie zweryfikowane przed porodem VNS: szczury przeprowadziły co najmniej 100 udanych prób w dwóch 30-minutowych sesjach treningowych dziennie. VNS został sparowany z prawidłowymi naciśnięciami dźwigni podczas 10 kolejnych sesji treningowych w ciągu 5 dni.
   1. Podłącz szczura do generatora bodźców za pomocą wszczepionej nasadki na głowę i dostosuj do odpowiednich ustawień stymulacji. W celu indukowanej przez VNS reorganizacji mapy kory ruchowej, należy sparować każde prawidłowe naciśnięcie dźwigni z pojedynczym ciągiem 15 dwufazowych impulsów, każdy o szerokości 100 μs i amplitudzie 800 μA, dostarczanych z częstotliwością 30 Hz.
   2. Ciąg stymulacji jest dostarczany natychmiast po wykryciu każdego udanego naciśnięcia dźwigni podczas dziesięciu 30-minutowych sesji treningowych. Podczas dostarczania VNS użyj oscyloskopu, aby monitorować pomyślne dostarczenie stymulacji prądu.
3. Zweryfikuj przewlekle wszczepioną funkcję mankietu.
   1. W ciągu 24 godzin od ostatniej sesji treningowej sparowanej VNS użyj mikrostymulacji wewnątrzczaszkowej (ICMS) do ilościowego określenia funkcjonalnej mapy somatotopowej w korze ruchowej.
   2. Po indukcji znieczulenia do mapowania ICMS kory ruchowej, ponownie zwaliduj funkcję mankietu, stosując 10-sekundowy ciąg stymulacji prądem 30 Hz, 0,8 mA (impulsy dwufazowe 100 μs), co powinno skutkować zaprzestaniem oddychania i obniżeniem poziomu SpO₂ o co najmniej 5%, zgodnie z odruchem Heringa-Breuera.
      UWAGA: W zależności od zastosowania, funkcja mankietu może być uznana za dopuszczalną, jeśli obserwuje się niezawodny spadek SpO₂ mniejszy niż 5% lub jeśli wyższe amplitudy prądu (do 1,6 mA) niezawodnie powodują co najmniej 5% redukcję SpO₂. Niezaobserwowanie zaprzestania oddychania i/lub wiarygodnego zmniejszenia SpO₂ wskazuje na niewydolność implantu.

Wyniki

Rysunek 1: Montaż elektrod stymulujących mankiet. (A) Po zabezpieczeniu szwów po obu stronach mankietu, drut Pt: Ir można przewlec przez ściankę mankietu w otworze #1 (biały grot strzałki) za pomocą igły do szycia. (B) Drut Pt: Ir jest prawid...

Materiały