Uporządkowane włókna otrzymane metodą elektroprzędzenia kierują wzrostem neuronów in vitro i stanowią potencjalny komponent rusztowań do regeneracji nerwów. Opisujemy procedurę przygotowania podłoży z włókien elektroprzędzionych oraz bezsurowiczą hodowlę pierwotnych neuronów sensorycznych (DRG) i ruchowych szczura w stadium E15. Uwzględniono również wizualizację neuronów za pomocą immunocytochemii.
Artykuł metodologiczny
Hodowla pierwotnych neuronów ruchowych i sensorycznych w zdefiniowanych mediach na rusztowaniach z nanowłókien z poli-L-laktydu otrzymanych metodą elektroprzędzenia
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Elektroprzędzenie jest techniką wytwarzania włókien w skali mikro- i nanometrycznej. Włókna mogą być elektroprzędzone z różnym stopniem uporządkowania, od silnie wyrównanych po całkowicie losowe. Ponadto włókna mogą być przędzone z różnych materiałów, w tym z polimerów biodegradowalnych, takich jak kwas poli-L-mlekowy (PLLA). Cechy te sprawiają, że włókna otrzymane metodą elektroprzędzenia nadają się do różnorodnych zastosowań w tworzeniu rusztowań w inżynierii tkankowej. Nasza uwaga koncentruje się na wykorzystaniu wyrównanych włókien elektroprzędzonych do regeneracji nerwów. Wykazaliśmy wcześniej, że wyrównane włókna PLLA otrzymane metodą elektroprzędzenia kierują wzrost zarówno pierwotnych neuronów sensorycznych, jak i motorycznych in vitro. Uważamy, że zastosowanie systemu pierwotnych kultur komórkowych jest niezbędne podczas oceny biomateriałów, aby jak najdokładniej modelować rzeczywiste neurony występujące in vivo. W niniejszej pracy opisujemy techniki stosowane w naszym laboratorium do elektroprzędzenia rusztowań włóknistych oraz hodowli eksplantatów zwojów korzeni grzbietowych, a także dysocjowanych neuronów sensorycznych i motorycznych na rusztowaniach elektroprzędzonych. Przedstawione tutaj techniki elektroprzędzenia i/lub hodowli można jednak łatwo dostosować do innych zastosowań.
Protokół
1. Roztwór prziądkowy kwasu poli-L-mlekowego (PLLA)
- Rozpuścić 0,4 g PLLA w 9 mL chloroformu, mieszając przy niskiej temperaturze.
- Dodać 1 mL dimetyloformamidu do roztworu, aby uzyskać końcowe stężenie 4% PLLA (w/v) w mieszaninie chloroform:DMF 9:1 (v/v).
- Przenieść roztwór do strzykawki polipropylenowej lub szklanej z tępą metalową igłą o rozmiarze 23ga.
2. Przygotowanie podłoża rotacyjnego1
- Przygotuj 8% (w/v) roztwór PLGA (kopolimeru kwasu mlekowego i glikolowego) o proporcjach 85:15 w chloroformie, mieszając go przy niskiej temperaturze.
- Pokryj czyste szklane szkiełka nakrywki warstwą PLGA, pokrywając powierzchnię każdego szkiełka roztworem PLGA. Pozostaw PLGA do wyschnięcia w postaci cienkiej warstwy (ok. 30 min).
3. Elektroprzędzenie2
- Przymocuj szkiełka przedmiotowe pokrywowe powlekone PLGA do kolektora za pomocą przewodzącej taśmy węglowej. W przypadku włókien uporządkowanych kolektorem jest koło napędzane silnikiem. Dla włókien przypadkowych kolektorem jest nieruchoma płyta.
- Umieść strzykawkę w pompie tak, aby końcówka znajdowała się 20 cm od koła kolektora. Ustaw pompę na około 2 mL/hr, a w przypadku użycia koła ustaw silnik na 300-40 RPM. Jeśli to możliwe, przyłóż napięcie polaryzacyjne DC -2 kV do kolektora i +15 kV do metalowej końcówki. W przypadku braku dostępu do zasilacza bipolarnego uziem kolektor.
- Włókna będą wytryskiwać z końcówki strzykawki i osadzać się na obracającym się kole. Kontynuuj przędzenie aż do uzyskania pożądanej gęstości włókien. Okresowo przecieraj metalową końcówkę ręcznikiem papierowym przymocowanym do nieprzewodzącego pręta, aby zapobiec zatykaniu się końcówki.
4. Tworzenie rowka (moating)1
- Po zakończeniu przędzenia należy utworzyć „fosę” wokół próbek elektroprzędzonych, naniosząc pipetą linię PLGA wokół obwodu szkiełka nakrywkowego. Pozostawić PLGA do wyschnięcia. Pozwoli to zachować orientację włókien podczas hodowli.
5. Powlekanie białkiem
- Włókna otrzymane metodą elektroprzędzenia oraz szklane kontrolki muszą zostać pokryte białkiem przed hodowlą komórek. Podłoża należy zanurzyć w roztworze białka na co najmniej jedną godzinę, a następnie odessać nadmiar roztworu i kontynuować aspirację do czasu wyschnięcia podłoży. Możliwe roztwory białek to: PLL (poli-L-lizyna) (10 µg/ mL), laminina (25 µg/ mL) lub fibronektyna (50 µg/ mL). W przypadku zastosowania PLL podłoża należy przepłukać w sterylnej wodzie i dwukrotnie wysuszyć po wstępnym pokryciu białkiem.
6. Pozyskiwanie zarodków szczura w 15. dniu embrionalnym (E15)3
*Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi NIH dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych, zatwierdzonymi przez Komitet ds. Wykorzystania i Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Michigan.
- Przygotowanie: Sprawdź, czy zwierzę jest w ciąży. Rozmroź 3 mL trypsyny, 3 mL FBS i podgrzej butelkę medium L15. Wypal pipetę Pasteura. Zdezynfekuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w 70% etanolu przez 30 min.
- Przygotuj i podgrzej pożywkę do wysiewu (patrz Tabela 1).
- Eutanazja: Wykonaj zastrzyk domięśniowy (IP) z ketaminy/ksylazyny. Odczekaj 10-15 minut i sprawdź brak odruchu rogówkowego oraz odruchu cofania łapy. Po ustąpieniu odruchów wykonaj zastrzyk wewnątrzsercowy (IC) z pentobarbitalu (FatalPlus).
- Unieś skórę brzucha. Przetnij skórę i warstwy mięśniowe, aby odsłonić jamę brzuszną. Zlokalizuj macicę i oddziel ją na poziomie szyjki macicy i jajników.
- Usuń embriony z macicy za pomocą nożyczek i niezwłocznie umieść je w ciepłym medium L15. (Wszystkie kolejne procedury należy przeprowadzać pod mikroskopem dissectingowym; embriony i wypreparowane pępowiny powinny być przez cały czas zanurzone w ciepłym medium L15). Oddziel głowy embrionów, zaciskając pęsetę w okolicy podżuchownej oraz poniżej kości potylicznej czaszki.
7. Disekcja3
- Ułożyć zarodek na boku. Chronić rdzeń kręgosłupa jedną pęsetą, podczas gdy drugą usuwać kończyny i narządy jamy brzusznej.
- Obrócić zarodek i unieruchomić go jedną pęsetą. Przeciąć wzdłuż zarodka, od szyi do ogona, aż cały rdzeń zostanie odsłonięty.
- Ostrożnie chwycić koniec rdzenia i pociągnąć go w kierunku ogona, aby go usunąć. Rdzeń zostanie oddzielony wraz z przytwierdzoną błoną i zwojami korzeni grzbietowych (DRG).
- W przypadku planowania hodowli eksplantów DRG lub dysocjowanych neuronów sensorycznych, odciąć DRG od rdzenia i przenieść je do nowej szalki z ciepłym medium L15.
- W przypadku hodowli eksplantów DRG przejść do kroku 10.2
- W przypadku hodowli dysocjowanych neuronów sensorycznych przejść do kroku 9
- W przypadku hodowli neuronów ruchowych DRG zostaną usunięte wraz z błoną w kroku 7.5
- Usunąć błonę z rdzenia kręgosłupowego, chwytając ją na górnym końcu rdzenia i odrywając w dół, analogicznie do zdejmowania długiej skarpetki. Powtórzyć czynność dla wszystkich zarodków, a następnie pociąć rdzenie na małe (2-3 mm) kawałki.
8. Przetwarzanie neuronów ruchowych (MN)5,6,7
- Przenieś posiekane sznury pępowinowe oraz pożywkę L15 do probówki stożkowej i wiruj przy 10 RPM przez 2-3 min w celu sfragmentowania i osadzenia kawałków tkanek.
- Odlej supernatant i dodaj 3 mL trypsyny do osadu z sznurów. Inkubuj w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez 20 min.
- Dodaj 3 mL FBS do probówki stożkowej i wiruj przy 10 RPM przez 2-3 min, aby ponownie uzyskać osad.
- Odlej supernatant i pokryj wnętrze wypalonej pipety Pasteura FBS.
- Dodaj do probówki stożkowej objętość L15 odpowiadającą jednej pipecie Pasteura, a następnie delikatnie homogenizuj do uzyskania jednorodnego roztworu bez widocznych grudek. Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza.
- Przygotuj 9% roztwór Optiprep w pożywce L15. Przygotuj jedną probówkę z 3 mL roztworu Optiprep na każde dwa embriony (w przypadku nieparzystej liczby embrionów zaokrąglij liczbę probówek w górę).
- Nanieś zhomogenizowany roztwór na roztwór Optiprep, dzieląc go równomiernie pomiędzy wszystkie probówki. Wiruj probówki przy 200 RPM przez 15 min.
- Ostrożnie pobierz górne 2 mL z każdej probówki i połącz je w probówce stożkowej o pojemności 50 mL. Napełnij probówkę pożywką L15 i wiruj przy 10 RPM przez 5 min, aby wypłukać Optiprep z komórek.
- Odlej supernatant i resuspenderuj komórki w niewielkiej ilości pożywki do hodowli (250-50 µl). Policz komórki, stosując metodę wykluczania błękitu trypanowego w celu zidentyfikowania żywych komórek. Przejdź do kroku 10.1.
9. Przetwarzanie neuronów sensorycznych (SN)7
- Przenieś wyjęte z rdzeni kręgowych i medium L15 zwoje korzeni grzbietowych (DRG) do probówki stożkowej i wiruj przy 10 RPM przez 2-3 min, aby osadzić fragmenty na dnie.
- Odlej nadsącz i dodaj 3 mL trypsyny do osadu DRG. Inkubuj w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez 10 min.
- Dodaj 3 mL FBS do probówki stożkowej i wiruj przy 10 RPM przez 2-3 min, aby ponownie osadzić komórki.
- Odlej nadsącz i pokryj wnętrze wypalanej pipety Pasteura FBS.
- Dodaj do probówki stożkowej objętość odpowiadającą jednej pipecie Pasteura medium L15, a następnie delikatnie homogenizuj przez pipetowanie, aż roztwór stanie się jednorodny i pozbawiony widocznych grudek. Unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza.
- Wiruj homogenat przy 100 RPM przez 5 min. Odlej nadsącz i resuspender komórki w niewielkiej ilości pożywki SN do wysiewania (250-50 µl). Policz komórki, stosując metodę wykluczenia błękitu trypanu w celu zidentyfikowania żywych komórek. Przejdź do kroku 10.1.
10. Wysiewanie i hodowla
- W przypadku hodowli dysocjowanych neuronów czuciowych (SN) lub ruchowych (MN):
- Przykryć podłoża kilkoma kroplami pożywki, a następnie dodać odpowiednią objętość zawiesiny komórkowej. Dysocjowane komórki należy wysiewać z niską gęstością (25-50 komórek/mm2). Pozostawić komórki do przytwierdzenia na co najmniej jedną godzinę przed całkowitym wypełnieniem studnieków pożywką.
- W przypadku hodowli eksplantów zzęsłów korzeniowych (DRG):
- Przykryć podłoża kilkoma kroplami pożywki, a następnie dodać DRG do pożywki. Rozmieścić DRG tak, aby były równomiernie rozłożone na podłożu (na szkiełku podstawkowym o wymiarach 2x2 mm zmieści się około 4 DRG). Pozostawić DRG do przytwierdzenia na co najmniej 4 h przed całkowitym wypełnieniem studnieków pożywką.
- Hodowle można utrzymywać do 4 dni bez wymiany pożywki. W przypadku dłuższych hodowli należy przeprowadzać połowiczą wymianę pożywki na pożywkę do dokarmiania. Pożywka do dokarmiania ma taki sam skład jak pożywka do wysiewu, z wyjątkiem L-glutaminy.
1. Immunocytochemia1,5,8
- Fiksacja komórek: Odessać medium i zastąpić je ciepłym 4% PFA (paraformaldehydem) na 30 min. Następnie przeprowadzić 3x 5-minutowe przemycia w 1x PBS.
- Blokowanie/permeabilizacja: Przygotować roztwór do blokowania i permeabilizacji (1,25% albuminy surowicy bydlęcej w 1X PBS, 0,05% Triton X-10 oraz 2,0% normalnej surowicy koziej). Odessać PBS i nałożyć roztwór do blokowania/permeabilizacji na próbki na 30 minut. Następnie przeprowadzić 1x 5-minutowe przemycie w 1x PBS.
- Przeciwciało pierwszorzędowe: Przygotować pracujący roztwór przeciwciała pierwszorzędowego (10% normalnej surowicy koziej, 1,25% albuminy surowicy bydlęcej, 0,1% Na azide, 0,05% Triton X-10 i uzupełnić do 10 mL przy użyciu 1x PBS). Dodać odpowiednią ilość przeciwciała pierwszorzędowego (patrz Tabela 2). Wyłożyć kilka szalek parafilmem. Na parafilmie dla każdego podłoża umieścić kroplę 20µl pracującego roztworu przeciwciała pierwszorzędowego. Odwrócić podłoża, tak aby spoczywały stroną z komórkami na pracującym roztworze przeciwciała pierwszorzędowego przez noc (jeśli w pomieszczeniu działa klimatyzacja lub jest szczególnie sucho, w narożniku szalki można dodać kawałek papieru nasączonego wodą, aby zapobiec odparowywaniu roztworu pracującego).
- Przeciwciało wtórne: Zdjąć podłoża z przeciwciał pierwszorzędowych (roztwór pracujący można zebrać, przechowywać w 4°C i użyć ponownie) i przeprowadzić 2x 5-minutowe przemycia w 1x PBS. Nałożyć 20 µl przeciwciała wtórnego rozcieńczonego 1:20 w PBS (również w pozycji odwróconej na szalce wyłożonej parafilmem) na 4 h.
- Zdjąć z przeciwciał wtórnych, a następnie przeprowadzić 2x 5-minutowe przemycia w 1x PBS. Zamontować podłoża na szkiełkach za pomocą Prolong Gold zawierającego DAPI lub innego odpowiedniego barwnika do jąder komórkowych.
12. Reprezentatywne wyniki:
Typowa morfologia uporządkowanych i losowych włókien otrzymanych metodą elektroprzędzenia została przedstawiona na Rysunku 1. Stosując ten protokół, zazwyczaj otrzymujemy czystość MN na poziomie >90% neuronów7,8, a hodowle DRG utrzymujemy przez okres do jednego tygodnia bez znaczącego wzrostu fibroblastów. Rysunek 2 przedstawia typowy wygląd MN na szkle i włóknach po 24 godzinach hodowli oraz po immunobarwieniu. Na Rysunku 3 przedstawiono immunobarwione DRG hodowane przez trzy dni na szkle i włóknach.
Rycina 1. Orientację włókien manipuluje się poprzez wybór kolektora. A.) Włókna uporządkowane naniesione na rotujący kolektor kołowy oraz B.) włókna przypadkowe naniesione na stacjonarny kolektor płytowy. Paski skali = 20 μm.
Rycina 2. Reprezentatywne neurony ruchowe barwione przeciwciałem przeciwko TuJ1 (zielony) i DAPI (niebieski) po 24 godzinach hodowli na pokrytych PLL A.) włóknach i B.) szkle. Paski skali = 20 μm.
Rysunek 3. Reprezentatywne zwojezwoje korzeni grzbietowych (DRG) barwione na neurofilamenty (kolor zielony) po 3 dniach hodowli na szkle powlekanym PLL (A) oraz na włóknach powlekanym PLL (B). Paski skali = 200 μm.
| Roztwór stokowy: | pożywka MN: | pożywka DRG/SN: |
| 10 mg/ml-1 albumina | 12.5 μl | -- |
| 10 mg/ml-1 apo-transferyna | 50 μl | 40 μl |
| 50 μg ml-1 β-estradiol | 2.7 μl | 2.2 μl |
| 0,1 mg/ml-1 biotyna | 50 μl | -- |
| 16 mg/ml-1 katalaza | 8 μl | -- |
| 15 mg/ml-1 D-galaktoza | 50 μl | -- |
| 50 μg ml-1 hydrokortyzon | 3.7 μl | 2.9 μl |
| 0,63 mg/ml-1 progesteron | 0.5 μl | -- |
| 16 mg/ml-1 putrescyna | 50 μl | -- |
| 50 μg ml-1 selen | 3.4 μl | 4.1 μl |
| 2,5 mg/ml-1 dysmutaza ponadtlenkowa | 50 μl | -- |
| * 500 ng/ml-1 czynnik wzrostu nerwów | -- | 1 ml |
| * 10X PSN | 0,5 mL | 0,5 mL |
| * B27 | 1 ml | 1 ml |
| * 2 mM L-glutaminy | 35 μl | 35 μl |
| * Neurobasal | do 50 ml | do 50 ml |
Tabela 1. Składniki oznaczone gwiazdką (*) należy dodać do pożywki bezpośrednio przed użyciem. Pozostałe składniki można przygotować w formie roztworu zapasowego i przechowywać w temperaturze -20°C do momentu wykorzystania6,7.
| Pierwotna (stężenie) | Neurony: | Gleje: | Fibroblasty: |
| przeciwciało anty-β-tubulina (TuJ1) (1:100) | ✓ | X | X |
| anty-neurofilament (1:10) | ✓ | X | X |
| anty-S-10 (1:250) | X | ✓ | ✓ |
| anty-NGFR p75 (1:50) | ✓ | ✓ | X |
Tabela 2. Wybór przeciwciała pierwszorzędowego zależy od celów badacza. Powyżej przedstawiono kilka przeciwciał oraz stężenia, które z sukcesem stosowaliśmy w naszym laboratorium. S-10 jest szczególnie użyteczne do identyfikacji komórek Schwanna i/lub wykrywania zanieczyszczeń fibroblastami, należy jednak pamiętać, że musi być stosowane w połączeniu z NGFR p75, aby odróżnić glej od fibroblastów4. Zauważyliśmy również, że NGFR p75 bardzo słabo barwi neuryty, natomiast neurofilament lub TuJ1 są doskonałym wyborem, jeśli celem jest wizualizacja poszczególnych neurytów.
Dyskusja
Protokół ten zawiera kilka krytycznych etapów. Pierwszym z nich jest prawidłowe wytworzenie podłoży z włókien elektroprzędzionych. W mediach ciekłych włókna PLLA, błona PLGA i wał PLGA oddzielą się od szklanego szkiełka nakrywkowe jako jedna całość. Jeśli pominie się PLGA, włókna PLLA nie utworzą płaskiej warstwy – zwiną się w bezużyteczny splot. Dlatego błona PLGA jest stosowana jako odpowiednie podłoże w celu utrzymania wyrównania włókien podczas hodowli. Wał jest dodawany po przędzeniu obu elementów, aby zapewnić trwałe przymocowanie włókien do błony PLGA oraz nadać błonie sztywność strukturalną. Wał służy również jako wygodny uchwyt podczas manipulowania podłożami w trakcie utrwalania, barwienia i montowania. Drugim krytycznym etapem jest tryturacja. Należy dołożyć wszelkich starań, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza. Dodatkowo znacznie wyższe wydajności uzyskiwano, gdy w tym kroku stosowano pipetę wypalaną nad ogniem. Aby wypalić pipetę, należy zapalić palnik Bunsena i przymocować gruszkę do pipety. Przesunąć końcówkę pipety szybko przez płomień 2-3 razy, jednocześnie stale ściskając i puszczając gruszkę – przepływ powietrza przez pipetę pomoże zapobiec całkowitemu zamknięciu się końcówki. Przed użyciem należy sprawdzić końcówkę pipety, aby upewnić się, że otwór jest nadal drożny, a krawędzie wydają się lekko zaokrąglone.
Elektroprzędzenie jest procesem bardzo wszechstronnym; parametry elektroprzędzenia można modyfikować, aby uzyskać włókna o różnych morfologiach. Tan et al. (2005) szczegółowo opisują systematyczne badanie parametrów wpływających na średnicę włókien z PLLA otrzymanych metodą elektroprzędzenia. Wang et al. (2009) przedstawiają szczegółowe badanie parametrów wpływających na orientację włókien z PLLA otrzymanych metodą elektroprzędzenia.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
NIH K08 EB003996
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| PLLA | Boehringer Ingeheim | Resomer L210 | |
| PLGA 85:15 | Sigma-Aldrich | 43471 | |
| L15 | GIBCO, by Life Technologies | 11415 | |
| Albumina | Sigma-Aldrich | A2289 | |
| Apoproteina transferryny | Akorn Inc | AK8227 | |
| Biotyna | Fisher Scientific | AC 23009-0010 | |
| Galaktoza | Sigma-Aldrich | G0625 | |
| Progesteron | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Putrescyna | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Selen | Sigma-Aldrich | S9133 | |
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E 1132 | |
| Hydrokortyzon | Sigma-Aldrich | H0396 | |
| Katalaza | Sigma-Aldrich | C40 | |
| Dyzmutaza ponadtlenkowa | Sigma-Aldrich | S4636 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| PSN | GIBCO, by Life Technologies | 15640 | |
| L-glutamina | Nalge Nunc international | 1680149 | |
| Trypsyna | Nalge Nunc international | 1689149 | |
| Płodowa surowica bydlęca | GIBCO, by Life Technologies | 26140 | |
| Optiprep | Accurate Chemical & Scientific Corporation | 2011 | |
| PLL | Sigma-Aldrich | P4832 | |
| Fibronektyna | Sigma-Aldrich | F 4759 | |
| Laminina | Invitrogen | 23017-015 | |
| B27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Przeciwciało anty-TuJ1 | BD Biosciences | 556321 | |
| Przeciwciało anty-neurofilamentowe | EMD Millipore | AB1987 | |
| Przeciwciało anty-S100 | Sigma-Aldrich | S2532 | |
| Przeciwciało anty-NGFR p75 | Sigma-Aldrich | N3908 | |
| Normalna surowica kozia | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Azydek sodu | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Taśma węglowa | Ted Pella, Inc. | 13073-1 | |
| Prolong Gold +DAPI | Invitrogen | P36931 |
Bibliografia
- Corey, J. M., Gertz, C. C., Wang, B. S., Birrell, L. K., Johnson, S. L., Martin, D. C., Feldman, E. L. The design of electrospun PLLA nanofiber scaffolds compatible with serum-free growth of primary motor and sensory neurons. Acta. Biomater. 4, 863-875 (2008).
- Lin, D. Y., Johnson, M. A., Vohden, R. A., Chen, D., Martin, D. C. Tailored nanofiber morphologies using modulated electrospinning for biomedical applications. Mat. Res. Soc. Symp. Proc. 736, D3.8.1-D3.8.6 (2003).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. Chapter 19 (1998).
- Kameda, Y. Expression of glial progenitor markers p75NTR and S100 protein in the developing mouse parathyroid gland. Cell Tissue Res. 327, 15-23 (2007).
- Corey, J. M., Lin, D. Y., Mycek, K. B., Chen, Q., Samuel, S., Feldman, E. L., Martin, D. C. Aligned electrospun nanofibers specify the direction of dorsal root ganglia neurite growth. J. Biomed. Mater. Res. A. 83, 636-645 (2007).
- Vincent, A. M., Mobley, B. C., Hiller, A., Feldman, E. L. IGF-I prevents glutamate-induced motor neuron programmed cell death. Neurobiol. Dis. 16, 407-416 (2004).
- Russell, J. W., Windebank, A. J., Schenone, A., Feldman, E. L. Insulin-like growth factor-I prevents apoptosis in neurons after nerve growth factor withdrawal. J. Neurobiol. 36, 455-467 (1998).
- Gertz, C. C., Leach, M. K., Birrel, L. K., Martin, D. C., Feldman, E. L., Corey, J. M. Accelerated neuritogenesis and maturation of primary spinal motor neurons in response to nanofibers. Dev. Neurobiol. 70, 589-603 (2010).
- Tan, S. -H., Kotaki, M., Ramakrishna, S. Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process. Polymer. 46, 6128-6134 (2005).
- Wang, H. B., Mullins, M. E., Cregg, J. M., Hurtado, A., Oudega, M., Trombley, M. T., Gilbert, R. J. Creation of highly aligned electrospun poly-L-lactic acid fibers for nerve regeneration applications. J. Neural Eng. 6, (2009).
Przedruki i uprawnienia
