Implantacja kaniuli do Cisterna Magna w modelu mysim

Streszczenie

Źródło: Xavier, A. L. R., et al. Implantacja kaniuli do Cisterna Magna gryzoni. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film pokazuje procedurę wszczepiania kaniuli do cisterna magna znieczulonej myszy. Technika polega na przeprowadzeniu kaniuli zamontowanej na igle przez oponę twardą do odwróconego trójkątnego cisterna magna i zabezpieczeniu jej w celu ukierunkowanego dostarczenia do płynu mózgowo-rdzeniowego.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Zabieg chirurgiczny
   UWAGA: Przewlekła kaniulacja cisterna magna (CM) pozwala zwierzętom na powrót do zdrowia po zabiegu chirurgicznym. Zastrzyki CM są wykonywane następnego dnia po implantacji kaniuli i, co ważne, mogą być wykonywane zarówno u zwierząt znieczulonych, jak i przytomnych. Ponieważ jest to operacja rekonwalescencji, zabiegi powinny być przeprowadzane w sterylnych warunkach.
   1. Zważ mysz (C57BL/6JRj, obie płcie, 8 tygodni) i znieczul ją mieszaniną ketaminy i ksylazyny (odpowiednio 100 mg/kg; 10 mg/kg) poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe (i.p.). W razie potrzeby należy ponownie podać myszom połowę dawki ketaminy (50 mg/kg) podczas zabiegu chirurgicznego. Alternatywnie, w przypadku przewlekłej kaniulacji, znieczulij mysz, umieszczając ją w komorze indukcyjnej izofluranu o stężeniu 2,5 - 3% izofluranu, przy około 1 l / min tlenu (O₂). W takim przypadku należy użyć stożka nosowego, aby podtrzymać znieczulenie izofluranem na poziomie 1,5 - 2% przez cały czas trwania operacji.
   2. Kiedy odruchy szczypania palców u nóg ustają, a oddech staje się powolny i stabilny, umieść zwierzę w stereotaktycznej ramie na poduszce grzewczej.
   3. Zastosuj maść okulistyczną. Powtórz tę czynność podczas zabiegu, gdy tylko zajdzie taka potrzeba.
   4. Ogol głowę i szyję myszy, usuń sierść i wysterylizuj odsłoniętą skórę najpierw wacikiem nasączonym alkoholem, a następnie dwa razy roztworem chlorheksydyny (0,5%) lub jodu (2%). Powtórz sterylizację jeszcze dwa razy.
      UWAGA: Zmień serwetę chirurgiczną, aby usunąć zanieczyszczenia i włosy po goleniu. Następnie udrapuj zwierzę, aby chronić sterylne pole.
   5. W przypadku przewlekłej kaniulacji należy podać 0,5 - 1 ml lidokainy/bupiwakainy (odpowiednio 1 mg/ml i 0,25 mg/ml) podskórnie (s.c.) w miejsce nacięcia. Podawać buprenorfinę (0,05 mg/kg mc.; podp.) w celu znieczulenia pooperacyjnego.
   6. Ustaw mysz w ramce stereotaktycznej. Po upewnieniu się, że jest to stabilizacja wewnątrzuszna lub przez łuk jarzmowy, należy lekko przechylić głowę tak, aby utworzyła kąt 120° do ciała (ryc. 1E).
   7. Znajdź część czaszki wystającą bezpośrednio nad mięśnie szyi - grzebień potyliczny. Podnieś leżącą na niej skórę za pomocą pęsety i odetnij kawałek skóry w kształcie migdała o długości około 1 cm wzdłuż linii środkowej. Użyj bawełnianych wacików lub włóczni do oczu, aby zatamować powstałe krwawienie.
   8. Używając grzebienia potylicznego jako punktu odniesienia, rozsuń powierzchowną tkankę łączną, aby odsłonić mięśnie szyi poniżej.
   9. Oddziel mięśnie w linii środkowej, ostrożnie przesuwając kleszcze po środku miejsca nacięcia w osi od przodu do tyłu. Trzymając parę zakrzywionych kleszczy w każdej ręce, połącz końcówki pośrodku w pobliżu dolnej części czaszki i odciągnij mięśnie na bok.
      UWAGA: Powinno to odsłonić CM, który wygląda jak mały odwrócony trójkąt, zarysowany przez móżdżek powyżej i rdzeń poniżej, za półprzezroczystą błoną opony twardej (ryc. 1B i 1C).
   10. Za pomocą chirurgicznej włóczni do oczu lub bawełnianego wacika wytrzyj membranę opony twardej pokrywającą CM.
2. Wprowadzenie kaniuli do CM
   1. Wyjmij kaniulę ze strzykawki wypełnionej sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (aCSF), trzymając igłę 30G przymocowaną do tylnego końca rurki.
   2. Podłączyć igłę 30G do strzykawki o pojemności 100 μl wypełnionej wodą destylowaną, podłączonej do pompy strzykawkowej.
   3. Wprowadzić pęcherzyk powietrza o długości około 1 cm do kaniuli, pobierając powietrze za pomocą pompki strzykawkowej.
   4. Za pomocą pompy strzykawkowej pobrać 12 μl pożądanego znacznika płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) do kaniuli.
   5. Chwyć kaniulę, wypełnioną znacznikiem płynu mózgowo-rdzeniowego, w pobliżu igły pokrytej rurką za pomocą pary zakrzywionych pęsety trzymanych w dominującej ręce. Oprzyj środkowy palec ręki niedominującej na pasku słuchowym po przeciwnej stronie i trzymaj go nieruchomo do późniejszego wykorzystania jako podpórkę dla kaniuli.
   6. Włóż kaniulę pod kątem 45° w stosunku do głowy myszy, przechodząc do środka CM, identyfikowanego przez jej trójkątny aspekt widziany przez oponę twardą. Unikaj penetracji móżdżku lub rdzenia. Upewnij się, że igła jest włożona tylko na głębokość 1 - 2 mm, na przykład do punktu, w którym skos znajduje się całkowicie pod oponą twardą. Zwolnij pęsetę trzymającą kaniulę i pozwól kaniuli spocząć na niedominującej ręce.
      UWAGA: Skośny koniec igieł dentystycznych będzie wymagał przyłożenia pewnej siły, aby przebić membranę opony twardej pokrywającą CM.
   7. W razie potrzeby osusz wyciek płynu mózgowo-rdzeniowego po penetracji za pomocą chirurgicznej włóczni do oczu lub bawełnianych wacików.
   8. Nałóż 2-3 krople kleju cyjanoakrylowego na membranę opony twardej otaczającą kaniulę. Dodaj kroplę akceleratora kleju, aby natychmiast utwardzić klej. Przykryj czaszkę i igłę mieszaniną cementu dentystycznego (około 0,5 mg) i kleju cyjanoakrylowego (3 - 5 kropli). Natychmiast po tym nałóż kroplę przyspieszacza kleju, aby utwardzić.

Wyniki

Rysunek 1: Wstrzykiwanie znaczników do cisterna magna. (A) Schematyczny przegląd głowy i mózgu myszy ukazujący położenie cisterna magna (CM) w stosunku do mózgu i struktur czaszki. (B) Mikrofotografia odsłoniętego CM po ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
SOPIRA carpule 30G 0,3 x 12 mm	Kulzer	AA001
Chlorheksydyna 0,5% (diglukonian chlorheksydyny)	Meda AS		http://www.meda.dk/behandlingsomrader/desinfektion/desinfektion-af-hud/klorhexidin-sprit-medic-05/
Wacik nasączony alkoholem 70% alkoholu izopropylowego 30 x 60 mm	Vitrex Medical A/S	520213
Viskoese Oejendraeber Ophtha	Ophtha	145250
Drewniany aplikator, podwójny wacik (Ø ok. 4 - 5 mm, długość ok. 12 mm)	Heinz Herenz	1032018
Włócznie do oczu	Medicom	A18005
Kimtech Science chusteczki precyzyjne chusteczki	do tkanek Kimberly Clark Professional	5511
Loctite super klej precyzyjny 5 g	Loctite		http://www.loctite-consumer.dk/da/produkter/superglue-liquid.html
Akcelerator Insta-Set CA	Bob Smith Industries	BSI-152
Cement dentystyczny w proszku	AM Systems	525000
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS; 0,01 M; pH 7,4)	Sigma Aldrich	P3813
Albumina jaja kurzego, koniugat Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	O34784
DAPI (4′,6-diamidyn-2-fenyloindol) roztwór (1 mg/ml)	Thermo Fisher Scientific	62248
Dekstran, fluoresceina, 3000 MW, anionowy	Thermo Fisher Scientific	D3305
Ketaminol Vet 100 mg/ml (ketamina)	Intervet International BV	511519
Rompin Vet 20 mg/ml (ksylazyna)	KVP Pharma + Veterinär Produkte GmbH	148999
Xylocain 20 mg/ml (lidokaina)	AstraZeneca	158543
Marcain 2,5 mg/ml (bupiwakaina)	AstraZeneca	123918
Bupaq Vet 0,3 mg/ml (buprenorfina)	Richter Pharma AG	185159