Wszystkie procedury związane z pobraniem próbek zostały wykonane zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Znakowane wstrzyknięcie komórek do organoidu mózgowego
UWAGA: W tym artykule organoidy mózgowe zostały wyprodukowane przy użyciu komercyjnego zestawu zgodnie z instrukcjami producenta. Można to zastąpić interesującym organoidem mózgowym. Materiały użyte w tej części protokołu muszą być wstępnie schłodzone, aby uniknąć żelowania rozpuszczonej matrycy błony podstawnej w temperaturach powyżej 4 °C.
- Umieść strzykawkę (strzykawki), końcówki i rurki, które będą miały kontakt z rozpuszczoną matrycą błony podstawnej, w temperaturze -20 °C, aby ostygły.
- Rozmrozić na lodzie odpowiednią porcję rozpuszczonej macierzy błony podstawnej, w zależności od liczby wstrzyknięć, które mają być wykonane (~2 μL/wstrzyknięcie). Zajmuje to około 30 minut.
- Podczas rozmrażania podwielokrotności podziel, zbierz i policz komórki.
- Należy obliczyć objętości potrzebne na wstrzyknięcie. W przypadku wykonywania wielu wstrzyknięć należy umieścić całkowitą objętość komórek w probówce o pojemności 1,5 ml i dodać do 1 ml DMEM/F12.
UWAGA: Objętość, która pozwala na kilka dodatkowych wstrzyknięć, powinna być wykorzystana do uwzględnienia strat/błędów pipetowania. - Umieść komórki w lodzie, podczas gdy kolejne kroki są przygotowywane.
- Po rozmrożeniu rozcieńczyć rozpuszczoną matrycę błony podstawnej do końcowego stężenia 3 mg/ml w lodowatym DMEM/F12.
- Pobrać zawiesinę jednokomórkową z lodu i odwirowywać ją w temperaturze 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Jeśli wirówka z chłodzeniem nie jest dostępna, wirowanie w temperaturze pokojowej wydaje się być ogólnie tolerowane. - Delikatnie usuń pożywkę całkowicie, nie naruszając osadu komórkowego. Zawiesić osad komórkowy przez delikatne pipetowanie w rozcieńczonej, rozpuszczonej macierzy błony podstawnej (3 mg/ml), aby uzyskać końcową objętość 2 μl na wstrzyknięcie, które ma zostać wykonane, i natychmiast umieścić go z powrotem na lodzie do czasu użycia.
UWAGA: Ponowne zawieszenie komórek należy wykonywać powoli i z wstępnie schłodzonymi końcówkami, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków i żelowania. - Przenieść schłodzoną strzykawkę (strzykawki) z zamrażarki o temperaturze -20 °C do wiadra na lód. Trzymaj je tam do czasu użycia.
- Wyjąć płytkę z organoidami mózgowymi z inkubatora. Za pomocą końcówki o szerokim otworze przenieść organoid do wstrzyknięcia do naczynia o średnicy 35 mm. Usuń całą możliwą pożywkę bez uszkadzania organoidu, aby go ustabilizować i ułatwić wstrzyknięcie.
UWAGA: Ważne jest, aby używać końcówek o szerokim otworze, aby uniknąć zniszczenia organoidu. Jeśli nie są dostępne, odetnij koniec zwykłej końcówki P1,000 sterylnymi nożyczkami. - Umieścić 35-milimetrową szalkę zawierającą organoid pod mikroskopem preparacyjnym, aby ułatwić prowadzenie i ułatwienie wstrzyknięcia.
UWAGA: Jeśli mikroskop preparacyjny nie jest dostępny w sterylnym obszarze, możliwe jest wykonanie wstrzyknięcia bez niego, aczkolwiek z nieco ograniczoną kontrolą. Inną alternatywą jest użycie pętli powiększającej lub okularów. - Gdy organoid(y) będzie gotowy do wstrzyknięcia, delikatnie zawiesić komórki za pomocą schłodzonej końcówki pipety P20 i przenieść 2 μl (zawierające żądaną liczbę komórek do wstrzyknięcia) na wstępnie schłodzone sterylne szkiełko podstawowe.
UWAGA: W przypadku wielokrotnych wstrzyknięć można dodać dodatkowe 2 μl objętości na szklanym szkiełku. Trzymaj go na lodzie i uważaj, aby nie wyparować. - Weź schłodzoną strzykawkę insulinową z lodu i powoli nabierz 2 μl zawiesiny komórkowej skosem igły skierowanym w dół, aby umożliwić pobranie wszystkich komórek/pożywki.
UWAGA: Upewnij się, że robisz bardzo wolno, aby uniknąć zasysania powietrza. - Otwórz pokrywę naczynia zawierającego organoid i skup na nim mikroskop. Trzymaj naczynie jedną ręką. Umieść skos igły do góry, a drugą ręką powoli wstrzyknij komórki w powierzchnię organoidu.
UWAGA: Ważne jest, aby wstrzykiwać powoli, aby uniknąć uszkodzenia tkanki. - Po wstrzyknięciu umieść pokrywkę z powrotem w naczyniu i pozostaw wstrzyknięty organoid na 1-2 minuty.
UWAGA: Pozwala to rozcieńczonej, rozpuszczonej macierzy błony podstawnej na żelowanie, utrzymując komórki na miejscu. Jeśli pożywka zostanie dodana zbyt wcześnie, może zmyć komórki znajdujące się na powierzchni. - Delikatnie dodać 500 μl pożywki organoidowej i przenieść organoid z końcówką o szerokim otworze do studzienki na płytce 24-dołkowej. Inkubować organoid w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc. Wykonuj pełne zmiany pożywki co drugi dzień.
UWAGA: Ważne jest, aby dołączyć organoid kontroli ujemnej (imitowany w zastrzyku), który będzie używany do regulacji obrazowania. W tym celu należy wstrzyknąć organoid, jak opisano wcześniej, z rozcieńczoną, rozpuszczoną macierzą błony podstawnej (3 mg/ml), aby uzyskać końcową objętość 2 μl bez komórek.