$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem modeli zwierzęcych zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję ds. opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
UWAGA: Szczury-dawcy mają swobodny dostęp do pożywienia i wody przed zabiegami dawstwa skóry i mięśni. Eutanazja jest wykonywana w głębokim znieczuleniu, a następnie następuje dosercowe wstrzyknięcie chlorku potasu z wtórną metodą obustronnej odmy opłucnowej. W tym eksperymencie teoretycznie można wykorzystać każdy szczep szczura; jednak nasze laboratorium osiągnęło spójne wyniki zarówno u samców, jak i samic szczurów Fischer F344 (~200-250 g) w wieku od dwóch do czterech miesięcy. Szczury-dawcy muszą być izogeniczne w stosunku do szczurów doświadczalnych.
1. Przygotowanie przeszczepu skórnego:
- Znieczulić szczura dawcy w komorze indukcyjnej, wykorzystując roztwór 5% izofluranu w tlenie w tempie 0,8-1 l/min. Po znieczuleniu szczura wyjmij go z komory indukcyjnej i umieść na stożku nosowym do ponownego oddychania, obniżając izofluran do 2-2,5% w celu utrzymania znieczulenia.
- Podawać roztwór 0,02-0,03 ml karprofenu (50 mg/ml) w 0,2 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej podskórnie między łopatki w celu znieczulenia.
- Nałóż maść na sztuczne łzy na oba oczy, aby zapobiec owrzodzeniom rogówki.
- Za pomocą maszynki do strzyżenia ogol całe dolne kończyny tylne (kończyny), okolicę kostki i boki łap (łap).
- Oczyść wybraną tylną kończynę i podeszwową powierzchnię łapy alkoholem, a następnie roztworem jodopowidonu, kończąc na końcowym oczyszczeniu alkoholem w celu usunięcia resztek jodopowidonu.
- Za pomocą ręcznej wiertarki szybkoobrotowej z mikrosilnikiem i wyjmowanym okrągłym kamieniem polerskim o drobnym ziarnie (4000 obr./min), zadzioruj podeszwową powierzchnię łapy, aby usunąć naskórek. Podczas zadziorów stosuj kroplówki soli fizjologicznej, aby nie poparzyć skóry. Leżąca pod spodem skóra właściwa będzie miała błyszczący wygląd z punktowym krwawieniem.
- Załóż opaskę uciskową na kończynę dolną, aby spowolnić przepływ krwi.
- Usuń ostro skórę podeszwową skalpelem #15 i umieść ją w gazie zwilżonej solą fizjologiczną, aby zapobiec wysuszeniu. Na tym etapie część tkanki ścięgnistej i łącznej zostanie z natury usunięta wraz ze skórą i zostanie usunięta później.
- Nałóż gazę na krwawiącą stopę, aby spowolnić krwotok. Powtórz kroki 1.5-1.9, jeśli wykonujesz dwie konstrukcje.
- Pod mikroskopem (20-krotne powiększenie) usuń ścięgna i tkankę łączną z głębokiej warstwy przeszczepu skóry za pomocą mikronożyczek. Uważaj, aby nie zrobić w szczepie. Cienki przeszczep skórny powinien być lekko nieprzezroczysty i zawierać tylko skórę właściwą o wymiarach około 0,5 cm x 1,0 cm.
- Umieść w gazie zwilżonej solą fizjologiczną, aż będzie gotowy do produkcji konstrukcji C-RPNI. Szczepy należy zużyć w ciągu 2 godzin od zbioru.
2. Przygotowanie przeszczepu mięśnia:
- Wykonaj podłużne nacięcie wzdłuż przedniej części dolnej kończyny tylnej od tuż nad kostką do tuż poniżej kolana za pomocą skalpela #15. Przeprowadź sekcję przez tkankę podskórną, aby odsłonić leżące pod nią mięśnie.
- W dystalnej części nacięcia odsłoń przyczepy ścięgniste mięśni kończyny dolnej. Piszczel przednia (TA) jest zazwyczaj największym i najbardziej wysuniętym do przodu mięśniem, a tuż pod i za tym mięśniem znajduje się prostownik palca długiego (EDL). Odizoluj dystalne ścięgno EDL od innych ścięgien w okolicy, uważając, aby w tym miejscu nie naciąć jego przyczepu.
- Zapewnij izolację prawidłowego ścięgna, wkładając oba zęby kleszczyka pod ścięgno i wywierając nacisk w górę, otwierając kleszcze, aby spowodować przemieszczenie ścięgna. Manipulacja tym ścięgnem powinna spowodować jednoczesne wyprostowanie wszystkich palców u stóp.
- Wykonaj dystalną tenotomię ostrymi nożyczkami do tęczówki i tępo oddziel mięsień od otaczających tkanek za pomocą tenotomii (lub innych nożyczek z końcówką), pracując proksymalnie, aby znaleźć pochodzenie ścięgniste.
- Po uwidocznieniu ścięgna bliższego należy ponownie wykonać tenotomię za pomocą ostrych nożyczek do tęczówki. Umieść przeszczep mięśniowy w gazie zwilżonej solą fizjologiczną, aby zapobiec wysuszeniu.
- Po usunięciu wszystkich pożądanych przeszczepów od szczura-dawcy należy przeprowadzić eutanazję głównie przez dosercowe wstrzyknięcie KCl (1-2 mEq K+/kg), a następnie wtórną eutanazję z obustronnym nakłuciem odmy opłucnowej z ostrzem #15.
3. Wspólna izolacja i przygotowanie nerwu strzałkowego
- Znieczulić i zapewnić znieczulenie szczurowi doświadczalnemu zgodnie z protokołem opisanym w krokach 1.1-1.3.
- Ogol pożądane udo i oczyść je alkoholem, betadyną, a na koniec alkoholem, aby usunąć ślady betadyny.
- Przenieś zwierzę ze stołu chirurgicznego na stół mikroskopu operacyjnego i umieść je na poduszce grzewczej z sondą temperatury w celu utrzymania temperatury ciała. Utrzymuj izofluran na poziomie 2-2,5%, a tlen na poziomie 0,8-1 l/min.
- Zaznacz nacięcie, rozciągające się od dystalnej części do wcięcia kulszowego do dolnej części kolana. To oznaczenie powinno być niższe i odchylone od kości udowej. Wykonaj nacięcie ostrzem #15, nacinając powięź mięśnia dwugłowego uda.
- Ostrożnie przeprowadź sekcję mięśnia dwugłowego uda za pomocą hemostatu lub mikronożyczek z końcówką do przestrzeni pod mięśniem dwugłowym uda.
UWAGA: Nerw kulszowy porusza się mniej więcej w tym samym kierunku, co początkowe nacięcie, które zostało wykonane. Istnieją trzy gałęzie, zazwyczaj z nerwem strzałkowym tylnym i wspólnym nerwem strzałkowym i piszczelowym biegnącym odpowiednio powierzchownie i głęboko do kolana. - Po zidentyfikowaniu wspólnego nerwu strzałkowego (CP), za pomocą pary mikro-, drobno zakończonych kleszczyków i mikronożyczek, ostrożnie odizoluj nerw CP od innych gałęzi kulszowych i usuń wszelkie zalegające dystalnie tkanki łącznej.
- W miejscu, w którym nerw przecina powierzchnię kolana, ostro przeciąć nerw za pomocą mikronożyczek.
UWAGA: Używanie ostrych nożyczek jest niezwykle ważne na tym etapie, ponieważ spowodowanie znacznego urazu nerwu może zwiększyć ryzyko powstania nerwiaka. - Ostrożnie uwolnij pozostałą tkankę łączną z nerwu CP i pracuj proksymalnie, aby uwolnić nerw na długość około 2 cm.
4. Wytwarzanie konstrukcji C-RPNI
- Usuń przeszczep mięśniowy z gazy zwilżonej solą fizjologiczną i usuń całą centralną tkankę ścięgnistą, a także mały centralny segment epimysium. Pozostaw ścięgniste końce nienaruszone.
- Korzystanie z 8-0 nylonowy szew, przymocuj epineurium przeciętego końca nerwu CP do obszaru przeszczepu mięśniowego pozbawionego epimysium za pomocą dwóch przerwanych szwów po obu stronach nerwu.
- Przymocuj przeszczep mięśniowy do okostnej kości udowej za pomocą pojedynczego nylonowego szwu przerywanego 6-0 zarówno proksymalnie, jak i dystalnie, z połączeniem nerwowo-mięśniowym skierowanym w stronę przeciwną od kości udowej.
UWAGA: Zabezpiecz mięsień tak, aby znajdował się na normalnej, rozluźnionej długości. Staraj się nie rozciągać znacząco mięśnia ani nie pozostawiać zbyt dużej wiotkości podczas zabezpieczania. - Postaw 8-0 ścieg nylonowy na dolnym, środkowym brzegu epimysium przeszczepu mięśniowego, mocując go do nerwu CP epineurium w taki sposób, aby stworzyć wiotkość nerwu w przeszczepie mięśniowym i pomóc złagodzić wszelkie przyszłe napięcia, na które może być narażony przy późniejszym poruszaniu się.
- Usuń przeszczep skóry z gazy nasączonej solą fizjologiczną i ułóż go na przeszczepie mięśniowym w taki sposób, aby całkowicie zakrył nerw i większość mięśnia. Upewnij się, że głęboki brzeg skóry właściwej spoczywa na mięśniu. Przytnij każdą skórę właściwą, która wystaje poza granicę mięśnia.
- Przymocuj przeszczep skóry do przeszczepu mięśniowego obwodowo za pomocą 8-0 Nylonowe szwy przerywane. Zazwyczaj stosuje się 4-8 całkowitych szwów w zależności od wielkości konstrukcji.
- Zamknij powięź mięśnia dwugłowego uda nad konstrukcją w biegu za pomocą szwu chromowego 5-0.
- Zamknij wierzchnią skórę za pomocą szwu chromowego 4-0 w stylu biegowym.
- Przetrzyj obszar operacyjny wacikiem nasączonym alkoholem i nałóż maść z antybiotykiem.
- Zaprzestań wziewnego środka znieczulającego i pozwól szczurowi dojść do siebie dzięki źródłom pożywienia i wody oddzielonym od współwięźniów w klatce.