Wizualizacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Streszczenie

Źródło: Biller, S. J., et al. Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film przedstawia przygotowanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic do transmisyjnej mikroskopii elektronowej za pomocą barwienia ujemnego, umożliwiając wizualizację morfologii, wielkości i czystości pęcherzyków w wysokiej rozdzielczości do analiz strukturalnych i porównawczych.

Protokół

1. Charakterystyka izolowanych pęcherzyków

1. Wykonaj mikroskopię elektronową z transmisją barwienia ujemnego (patrz Tabela materiałów) (TEM - transmisyjna mikroskopia elektronowa; wielkość cząstek, struktura, czystość).
   1. Aby poprawić jakość obrazu, jarzenie rozładowuje powierzchnię siatki TEM z powłoką wcześniej za pomocą systemu wyładowczego jarzeniowego zgodnie z wytycznymi producenta (patrz Tabela materiałów).
   2. Ostrożnie nałóż ~ 5 μl próbki pęcherzyka i pozostaw na 5 minut.
      >UWAGA: Próbki o stężeniach pęcherzyków >10^{9 ml-1} zazwyczaj dają najlepsze wyniki; bardziej rozcieńczone próbki będą miały niewiele pęcherzyków na obraz.
   3. Usunąć próbkę, dotykając krawędzią siatki kawałka czystej bibuły filtracyjnej.
   4. Odpipetować 20-50 μl kropli 2% octanu uranylu (patrz Tabela Materiałów) na płaską powierzchnię pokrytą folią z tworzywa sztucznego i umieścić pływającą na niej siatkę na 2 minuty.
   5. Usuń octan uranylu za pomocą bibuły filtracyjnej i unieś się na krótko na kropli ultraczystej wody do umycia. Powtórz płukanie wodą po raz drugi.
      UWAGA: Ostateczna sucha siatka jest gotowa do wizualizacji po kroku 1.1.5.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2% roztwór octanu uranylu	Mikroskopia elektronowa Sciences	22400-2	Barwienie negatywowe - TEM
Carbon Support Film 200 Mesh, miedź. CF200-Cu	Mikroskopia elektronowa Sciences	71150	Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)
siatka easiGlow Glow Discharge Cleaning System Ted	Pella	91000	Komercyjna siatka TEM Wyładowujący żarówkę
Referencyjny system oczyszczania wody Milli-Q	Z00QSV0WW	Merck System oczyszczania wody do otrzymywania ultraczystej wody typu I
Transmisyjny mikroskop elektronowy	JEOL	JEM-1400	Lub podobny mikroskop